Текст книги "Вирусы: Скорее друзья, чем враги"

Вакцины против ВИЧ не существует?

Каковы же результаты тридцатилетней истории разработки вакцины? Вакцины от ВИЧ нет, и так как обещания ее разработать остались невыполненными, никто не решается делать прогнозы. Когда открыли ВИЧ, специалисты в области молекулярной биологии полагали, что удастся сразу же разработать против него вакцину. За модель взяли вирус гепатита В (HBV), при котором поверхностные молекулы индуцируют синтез антител, которые нейтрализуют вирус, противодействуют его инфекционности, предотвращая репликацию. По аналогии с HBV в качестве основы для разработки вакцины выбрали последовательность, кодирующую белок оболочки вируса ВИЧ. Эта последовательность стала известна уже через несколько месяцев после обнаружения вируса. Затем наподобие HBV использовали поверхностный белок ВИЧ, полученный из дрожжей и бактерий путем использования технологии рекомбинантной ДНК. Это было первое успешное производство вакцины с использованием новой технологии. Однако в отношении ВИЧ она не работала, несмотря на некоторое сходство ВИЧ с вирусом гепатита В. Причина заключается в том, что HBV генетически более стабилен и несет внутри вирусной частицы практически полную двуспиральную ДНК, которая гораздо меньше подвержена изменениям, нежели геном ВИЧ, представленный односпиральной РНК, которая весьма вариабельна, и ее до сих пор не удалось «поймать». Таким образом, прогнозы вирусологов оказались настолько нереалистичны, что все, кто имеет отношение к этой деятельности, до сих пор испытывают неловкость, поскольку различия между HBV и ВИЧ уже тогда были известны всем исследователям. Вакцины против поверхностных белков в состоянии нейтрализовать вирус в лучшем случае в пробирке, но никак не в реальной жизни, да и представлен он не одним видом, а характеризуется видовым разнообразием, наличием квазивидов и к тому же быстро изменяется.

Непреднамеренная «вакцинация» произошла в Австралии, когда пациенты с нарушением свертываемости крови получали дополнительный препарат крови «Фактор VIII». Этот продукт был заражен дефектным ВИЧ без одного добавочного гена (изначально он «негативный»), фактора патогенности Nef. Это был медленно реплицирующийся вирус, который мог бы стать идеальной вакциной, судя по ранее разработанным вакцинам, в частности по вакцине против полиомиелита, работающей по принципу ослабленного (медленно реплицирующегося) вируса. Это один из лучших дизайнов вакцин. Тем не менее через 10 лет некоторые реципиенты «Фактора VIII» заболели: вирус восполнил дефектный ген и стал быстрее реплицироваться, что, к немалому удивлению вирусологов, и привело к развитию заболевания.

Ведется тщательное исследование белков поверхности клетки, но пока эта деятельность не увенчалась успехом. Такие поверхностные молекулы нужны вирусу для обнаружения и заражения клетки-хозяина, поэтому поверхность клетки до сих пор находится в центре внимания исследователей. В настоящее время используется новый подход, заключающийся в исследовании антител у зараженных ВИЧ людей, у которых заболевание в течение продолжительного времени не прогрессирует. Этих людей называют долговременными нонпрогрессорами (LTNP) или элитными контроллерами (ЭК). В лабораторных условиях из объема антител, полученных у таких пациентов, отбирают антитела, способные связываться с поверхностью ВИЧ, нейтрализуя его и превращая в неинфекционный. Был проведен tour de force скрининг 200 000 антител, чтобы отобрать несколько антител-кандидатов, которые в настоящее время разрабатываются для получения новой вакцины.

В Таиланде проводилась ранняя стадия крупномасштабных клинических исследований (RV144), в которой участвовали 16 000 добровольцев. Полученные результаты неоднократно анализировали, и качество полученных данных улучшалось в зависимости от статистики, собранной между 2009 и 2015 г. Вакцина представляет собой «прайм-буст» – комбинацию вирусного вектора Canarypox (ALVAC) и gp120, поверхностного белка вируса (с использованием формы белка В и АЕ в качестве мономеров, а не триммеров, но, так как изначально не было известно, что вирусный белок естественным образом подвергается триммеризации, эта вакцина оказалась неоптимальной). Выяснилось, что вакцинация снижает риск заражения на 31 %. Фонд Билла и Мелинды Гейтс спонсирует исследование одного из вариантов этой вакцины с участием 5400 добровольцев (форма С) в Африке и прогнозирует – или надеется, – что к 2030 г. эта работа увенчается успехом.

Новая технология позволяет идентифицировать нейтрализующие антитела широкого спектра действия (bnAb) в русле новой стратегии. Если одна вакцина оказывается неэффективной, возможно, успешной окажется комбинация вакцин, то есть последовательная иммунизация. Означает ли это, что можно поэтапно управлять иммунным ответом в целях разработки специальных классов антител к ВИЧ – речь идет о последовательности вакцин, поражающих движущуюся мишень? Трудно сказать. Аденоассоциированный вирус (ААВ) экспрессирует bnAb в клиническом исследовании, проводимом в настоящее время в Великобритании. Дэн Барух из Гарвардского университета тестирует вакцину «Aденовирус – Env». План исследования предусматривает использование модифицированного аденовируса для экспрессии нескольких белков ВИЧ (Gag, Pol и Env) и последующий «буст» с использованием только поверхностного белка вируса Env.

В наши дни разрабатывается «подход-обманка». Вместе «настоящего» поверхностного белка вируса синтезируют аналогичный и используют как антиген с более выраженными иммуногенными свойствами, чем «нативный» поверхностный вирусный белок Env. Данный синтетический поверхностный белок применяется в надежде на то, что антитела станут лучше распознавать «нативный» поверхностный белок. Такой подход используется при работе с животными моделями (мы тоже его весьма эффективно применяли), и он вполне может сработать, но применительно к ВИЧ это совершенно новый подход. В настоящее время планируется тестирование реплицирующихся вирусов в качестве вакцины, но при этом следует помнить, что реплицирующиеся вирусы оптимально использовать в качестве вакцины, если они не вызывают развитие заболевания. В данном случае использовали модифицированный герпесвирус CMV, поэтому в результате вакцинации невозможно повторное появление интактного ВИЧ. Давайте ждать и надеяться. Долго ли – 15 лет? 30 лет?

«Голая ДНК»

Однажды в 1990-х гг. я неожиданно получила приглашение поработать в Малверне, штат Пенсильвания, США. Ранее я несколько лет консультировала компанию Centocor по использованию гена рака для диагностики или лечения этого заболевания. Но в этот раз речь шла о проекте разработки вакцины против ВИЧ, и с этой целью Centocor создала новую дочернюю компанию Apollon. Я должна была руководить разработкой этой вакцины и получила внушительно звучащую должность – директор по науке, но команда, которой я руководила, была малочисленной! Ежемесячно я на неделю уезжала из Общества Макса Планка (Берлин), так как время, проводимое мной за компьютером, никто не фиксировал. Я работала в очень интересной области знаний – наша задача состояла в разработке вакцины, основанной на «голой ДНК». В то время это было новое направление. Суть такой ДНК-вакцинации сводилась к введению действующей ДНК, кодирующей вирус, для получения частей вируса, ряда белков, стимулирующих инфекцию. Это должно было привести к синтезу антител у реципиента вакцины. ДНК представляла собой сложную комбинацию разных генов вируса, амплифицирующих генов, и некоторые из них происходили из совершенно других вирусов или даже бактерий. Это широкое поле деятельности для вирусологов, но вместе с тем от них требуется высокий профессионализм, так как секрет заключается в том, как при создании модуля искусственного вируса выбрать, «вырезать» и рекомбинировать гены, чтобы усилить одни свойства и воспрепятствовать усилению других. Нельзя допустить, чтобы в итоге образовался интактный патогенный вирус. И исследователю, и американским таможенникам должно быть понятно, что человек не инфицирован, а всего лишь вакцинирован.

Получив большой объем ДНК, мы неожиданно обнаружили, что все образцы, пробирки с исследуемым материалом и реагенты заражены ДНК. Где-то произошла утечка, и до того, как нам удалось устранить проблему с должной системой биозащиты, оказалось, что мы все вакцинированы – вакцина попала в организм через нос и легкие. ДНК не пострадала! А потом мы превратили ее в «пустышку», чтобы ее невозможно было украсть или чтобы конкуренты не смогли ее имитировать, – это обычные в этой отрасли меры предосторожности, но в исследовательских лабораториях такие меры предпринимаются реже, а у меня все это было впервые.

Затем ДНК протестировали в Цюрихе на нескольких ВИЧ-инфицированных пациентах. Эта была первая в Европе вакцина, основанная на ДНК. В течение нескольких лет «нежелательных явлений» выявлено не было. (Самое главное, что у добровольцев не отмечался аутоиммунный ответ.)

Однако неожиданно вирусологи Цюрихского университета сами продемонстрировали «серьезное нежелательное» поведение. Возможно, потому, что вторглись на их «территорию»? Я попыталась сотрудничать с ними до того, как мы начали вводить вакцину пациентам, но у меня ничего не получилось. Я начала работу над этим проектом до того, как приехала в Цюрих, и это – информация для размышления для тех, кто хочет избежать неприятностей.

После инъекции мы отметили, что один пациент заразился «не тем» штаммом ВИЧ – штаммом, который наша вакцина не могла распознавать. Когда мы отошли от первого шока, возникла реальная проблема, поскольку в первой фазе клинических исследований пациентам обычно вводят вакцину для исследования только ее безопасности. Конечно, нам бы хотелось оценить ее эффективность и защитные свойства, хотя это не было целью исследования. В настоящее время конструкция ДНК-вакцин используется в армии США, но в комбинации с другими вакцинами. Особенно привлекателен последовательный подход – «прайм-буст»: сначала происходит праймирование с помощью ДНК, а затем реакция бустируется с помощью вируса. В данном случае вирус представляет собой модифицированный аденовирус с «метками» ВИЧ, поскольку вирусные частицы улучшают иммунный ответ. Видимо, введение ДНК «тренирует» иммунные клетки, превращая их в клетки с долговременной памятью. Для нас это было неожиданно. Вирус для активации иммунной системы в ряде случаев содержит редкие триплеты, обозначаемые как «деоптимизирующие кодоны», что приводит к снижению выработки вируса. Такое изменение, зачастую предназначенное для вакцин, приводит к тому, что вирус теряет способность вызывать заболевание. В прошлом реальные, но инактивированные вирусы использовали в качестве основы для разработки вакцин. При введении ДНК иглы для инъекций больше не используют; сейчас для инъекции ДНК в мышечную ткань применяют пистолет-инжектор. У меня есть такой пистолет, предоставленный компанией-производителем. Он лежит в безопасном контейнере с красной бархатной подкладкой (чтобы лучше смотрелся). Однако нам такое приспособление показалось не очень эффективным. Возможно, следовало бы усовершенствовать конструкцию. Во всем мире вакцинация ДНК проводится с помощью таких пистолетов в самых разнообразных вариантах: прививка от гриппа, от респираторно-синцитиального вируса или вируса Эбола, равно как и недавно появившегося вируса Зика. И все же введение одной только ДНК очень уж неэффективно, в силу чего необходимо комбинировать ее с другими вакцинами. В отличие от вирусов, на поверхности раковых клеток не наблюдается экспозиции «инородных» белков, поэтому довольно сложно подготовить иммунную систему к их распознаванию в качестве мишеней для производства антител. Поэтому в настоящее время предпринимаются попытки делать ставку не столько на производство антител, сколько на стимуляцию клеточно опосредованного иммунитета путем выращивания культуры лимфоцитов с генетическим кодом для усиленного синтеза цитокинов. Поэтому в ходе одного исследования мы вводили такую ДНК (продуцирующую интерлейкин-12) пациентам с меланомой и получили некоторый эффект (об этом далее). Идея заключается в том, чтобы помочь тому, кто готов помочь себе сам.

Микробициды в качестве женских презервативов

На основе препаратов для лечения ВИЧ, которые оказались неэффективными для пероральной терапии, недавно были разработаны препараты местного вагинального применения для защиты от ВИЧ, передаваемого половым путем. Во всем мире женщины хотят сами заботиться о своем здоровье, не полагаясь на партнера. Было установлено, что вагинальная область в качестве мишени для микробицидов, способных инактивировать микробы и ВИЧ, охарактеризована недостаточно. Два исследования микробицидов, проведенные Фондом Билла и Мелинды Гейтс, оказались неэффективными на поздних этапах разработки, и их пришлось досрочно прекратить, поскольку было установлено, что микробициды не только не обеспечивают профилактику ВИЧ, а, наоборот, повышают риск заражения. Несмотря на компетентность и репутацию специалистов, привлекаемых фондом, исследования не увенчались успехом, из чего следует, что наши представления по данному вопросу не соответствуют реальности.

В 2010 г. я вместе с еще десятком европейских ученых организовала в Стелленбоше (ЮАР) в рамках глобального обмена Европейской организации по молекулярной биологии (ЕОМБ) курс лекций, посвященный проблеме ВИЧ/СПИД, при поддержке ЕОМБ и пустила на это свой грант. ЕОМБ рассматривала это мероприятие как первый шаг по осуществлению деятельности во всемирном масштабе за пределами Европы. ЮАР – страна с самым высоким в мире показателем заражения ВИЧ. Кое-кто из 60 молодых участников-африканцев сомневался, стоит ли подавать заявку на участие, и не решился сообщить об этих лекциях другим – тема ВИЧ была порицаемой в обществе. Бывший президент ЮАР Табо Мбеки на протяжении многих лет заявлял, что ВИЧ-инфекции можно было бы избежать, если бы люди принимали душ. Видимо, именно поэтому люди погибали.

Студентам нравились сумки с логотипом ЕОМБ, и за них разве что не дрались. У нас таких сумок оказалось недостаточно, поскольку половина из них исчезла на таможне и найти их так и не удалось. Лекции проходили в безопасном месте в Стелленбоше, в здании, содержание которого спонсировалось Фондом Валленберга (Швеция). Слушатели не решались передвигаться по Кейптауну и покидать его и никогда не выходили из дома после захода солнца. Они боялись ходить по перенаселенным районам окрестностей Кейптауна.

В окрестностях Кейптауна 1 млн человек проживают в примитивных пристанищах из картонных коробок, автомобильных покрышек и листов гофрированного железа. По нашим оценкам, на все это количество людей приходится примерно 50 сухих туалетов, несколько голубых кабинок, стоящих в ряд практически за пределами перенаселенного района. Вместо того чтобы осмотреть голландские виноградники, мы пошли на церковную службу в такой перенаселенный район. Все крутилось вокруг СПИДа – проповедь, богослужение, оформление и обсуждение, после которого к нам, иностранцам, подходили люди и говорили: «Нам нужна помощь». Мужчины, например, думали, что от ВИЧ можно избавиться, если иметь половой контакт с девственницей. Какая фатальная ошибка! В целом, к сожалению, потраченные мной на организацию этих лекций время и силы оказались малорезультативными. Сейчас более крупные организации добиваются все более и более впечатляющих успехов.

Пока все исследования микробицидов ни к чему не привели. Даже результаты самого многообещающего исследования CAPRISA (ЮАР), представленные на заседании ЕОМБ и на Международном конгрессе по СПИДу в Риме, где сообщение вызвало широкий резонанс, оказались невоспроизводимыми. Еще одно исследование микробицидов PrEp-VOICE, в котором участвовали 10 000 женщин, не принесло никаких результатов. Причиной неудачи исследования стало невыполнение более чем 30 % испытуемых назначений врача, что часто обусловлено отсутствием образования, жизненным уровнем и плохими жилищными условиями. В настоящее время 10 микробицидов оказались неэффективными. Чтобы предотвратить ненадежный прием добровольцами таблеток, есть вариант инъекционного системного препарата длительного действия, и сейчас ведется научное исследование такого препарата с использованием ингибитора интегразы. Эшли Хаас из Миннесотского университета (Миннеаполис) доказала, что ВИЧ не поражает клетки, выстилающие влагалище, однако вирус проходит через клеточные соединения. Вирус выбирает сокращенный путь, и действующие в клетке соединения оказываются неэффективными, поскольку вирус находится вне клетки. А наше соединение подошло бы для этих целей.

Таким образом, из-за недостатка знаний исследования не были спланированы должным образом. Отсюда вывод: исследователям нужно учиться на ошибках. Перед тем как ввести вирус в клетку, его нужно убить. В 2016 г. продолжаются два клинических исследования с микробицидами (CONRAD 128 и MTN-030/IPM 041), в рамках которых проходит тестирование – с умеренными результатами – вагинального кольца с двойной функцией: противозачаточное средство и защита от ВИЧ-инфекции.

Как довести ВИЧ до «самоубийства»

Мы с коллегами в Цюрихе разработали методику, в соответствии с которой ВИЧ «убивают» до того, как он инфицирует клетку. С нашей точки зрения, наиболее актуальный способ избежать заражения – обработать влагалище микробицидом. Комментарий в журнале Nature Biotechnology по поводу опубликованных нами результатов был озаглавлен «Как довести ВИЧ до самоубийства» (2007). Цюрихский университет напечатал открытки с этим слоганом, которые можно было взять в трамваях в дни юбилея университета. Однако это не помогло нам реализовать на практике этот метод. Слишком дорого и сложно. «Суицид» вируса основан на действии молекулярных «ножниц», так называемой РНКазы Н, вызывающей расщепление РНК в гибриде РНК – ДНК. Обычно этот процесс происходит внутри клеток после того, как вирусная РНК скопирована в ДНК и становится бесполезной. В настоящее время такие «ножницы» присутствуют внутри вирусных частиц и задействуются после того, как вирус проникает в клетку. Их активация внутри частиц приводит к гибели РНК до ее копирования, поэтому репликация вируса становится невозможной – так происходит «суицид», или прекращение жизненного цикла вируса. («Ножницы»-РНКаза – один из четырех ретровирусных ферментов и единственный фермент, который до сих пор не является мишенью ингибиторных препаратов, поскольку в клетке находится слишком много аналогичных ферментов. Мы активируем этот фермент: обрабатываем вирус до того, как он внедряется клетку, и вводим часть ДНК, которая обусловливает появление гибрида и активирует вирусные «ножницы», приводящие к гибели вируса. Мы корректно охарактеризовали этот эффект как «ДНК-сайленсер», но это вызвало яростную реакцию у рецензента, заявившего, что только «сайленсер РНК» является приемлемым определением, и мы ему уступили.)

Мой коллега ввел «шпильку» ДНК мышам во влагалище, используя в качестве носителя гель. Только через пять лет мы отметили, что такое же вещество американское Управление по контролю над пищевыми продуктами и лекарственными средствами (FDA) одобрило в качестве «профилактического фактора» при половом акте и смазывающего вещества при использовании медицинских приспособлений во время проведения манипуляций в трахее и т. д. Фонд Билла и Мелинды Гейтс согласился протестировать наше соединение с использованием стандартных процедур, чтобы обеспечить непосредственную сопоставимость данных. Однако эта процедура предназначена для ВИЧ внутри клетки, что было неприменимо к нашему соединению. Поэтому тестирование не дало положительных результатов, что я предвидела, но не могла предотвратить. «Шпилька» успешно уничтожала ВИЧ на мышиной модели тяжелого комбинированного иммунодефицита, она полностью предотвращала инфицирование и приводила к существенному уменьшению размера опухоли у мышей. Онкогенный вирус мышиной модели – заменитель ВИЧ, не инфицирующий мышей, что является серьезной проблемой для исследователей, поскольку многие годы в таких исследованиях использовались только дорогостоящие обезьяны. В настоящее время путем добавления новых свойств разрабатываются новые, мышиные модели. Мы изложили результаты по уменьшению опухоли в рукописи и представили ее в Nature Biotechnology. Рецензенты запросили больше статистических данных и потребовали, чтобы мы всего за четыре недели провели исследования с бóльшим количеством мышей. И тут у меня начались проблемы. Одна из авторов забеременела и не хотела работать в виварии, еще один сотрудник ушел, а другие члены команды категорически отказались принимать участие в исследованиях на животных, и только один лаборант выказал готовность мне помочь, но у него не было разрешения на работу. Из 50 коллег никто не мог мне помочь. Поэтому я отказалась от всех своих должностей в институте и стала все делать сама. К своему удивлению, несмотря на многолетнюю административную работу, я все еще помнила, как обращаться с мышами и делать им инъекции.

Между тем мы пытались выполнить задание Фонда Билла и Мелинды Гейтс и добиться длительного сохранения свойств микробицидов ВИЧ. Мы протестировали петлю-«шпильку» ДНК после длительного хранения и в присутствии семенной жидкости, что является одним из важных параметров эффективности микробицидов. В гамбургском Институте экспериментальной вирусологии им. Хайнриха Петте мы поставили небольшой контейнер в мужском туалете и попросили мужчин стать анонимными донорами семенной жидкости. Это прекрасно сработало, но когда мы представили рукопись, то еще до того, как с ней начали работать, нас попросили показать письменное согласие доноров с указанием фамилий и письменное разрешение Комитета по этике больницы, на что ушло несколько недель. Совершенно новое требование. Даже донор кала применительно к инфекциям, передаваемым с калом (об этом речь пойдет ниже), должен был задним числом предоставить письменное согласие. Таким образом, для забора образцов любых жидкостей организма необходимо письменное согласие донора – будь то слезинка или капля мочи, – поскольку гены можно секвенировать и получить большой объем персонифицированной информации.

А что же будет дальше? Одна из проблем – высококачественное производство «шпилек» ДНК в соответствии со стандартами надлежащей производственной практики (GMP). Эти расходы просто непомерны. Я приезжала в Россию, два раза была в Китае и один раз в Африке. ВИЧ там до сих пор табуированная тема, а для производства соответствующих препаратов предусматривается чрезвычайно дорогостоящее GMP-производство (даже когда, как мне кажется, в этом нет необходимости). В странах третьего мира запрещено использовать более экономичные технологии, есть даже риск угодить за решетку. Во время моего пребывания в Китае главу выдающего разрешения комитета приговорили к смертной казни и расстреляли за то, что он недостаточно строго придерживался действующих в Китае правил, которые западные компании, приходя на китайский рынок, зачастую пытаются обойти. Возможно, этот чиновник спас не одну жизнь.