Текст книги "Расшифрованная жизнь. Мой геном, моя жизнь"

Через некоторое время, не получив ничего от Мэри-Клэр, я позвонил ей – узнать, что случилось с клонами. Она объяснила, что дело во Фрэнсисе. Он, якобы, требовал внесения своей фамилии в список авторов всех статей об исследованиях рака молочной железы (что она считала абсолютно недопустимым) и угрожал прекратить ее финансировать, если она пошлет нам ДНК для секвенирования. Мэри-Клэр не захотела рисковать и предпочла не посылать мне клоны.

Мы с Клэр были в ярости. Я знал о напряженных отношениях между Мэри-Клэр и Фрэнсисом, но если она правильно передала мне его слова, это означало злоупотребление служебным положением в карьерных целях. Я был еще больше возмущен поступком Мэри-Клэр, которая повелась на этот шантаж. Мы были так разочарованы и возмущены еще и потому, что результаты этой «охоты на ген» могли благотворно повлиять на здоровье женщин из зоны риска.

Через несколько месяцев руководство НИР – Национального института рака (отделение НИЗ) – решило сделать приоритетным секвенирование гена рака молочной железы и предложило соискателям присылать заявки. Мы в очередной раз попытались получить ДНК и снова получили отказ. Я позвонил директору НИР Сэму Бродеру и объяснил, что нам даже не требуется дополнительное финансирование, а нужен только образец ДНК. Он нам посочувствовал, но сказал, что не может заставить исследователей выложить клоны в общий доступ.

В очередной раз политика оказалась выше науки. Хотя Коллинз и критиковал HGS и TIGR за их нежелание сделать свои результаты более доступными для научного сообщества, сам-то он явно перекрывал доступ к клонам ДНК, созданным на деньги налогоплательщиков. Он просто хотел получить преимущества в гонке за обнаружение этого гена, ну и прославиться. В итоге в сентябре 1994 года всех победили Роджер Уайзман из Национального института гигиены окружающей среды штата Северная Каролина и Марк Сколник из Университета штата Юта. В общей сложности, сорок пять ученых приняли участие в выделении онкогена, так называемого BRCA1 – гена рака молочной железы 1. Пока члены команды Сколника позировали фотографам журнала Time, вновь возник вопрос об интеллектуальной собственности. Сколник создал компанию под названием Myriad Genetics для патентования генов и их продвижения на рынке, и пресса сразу же провела параллель с «делом Вентера».

Мне кажется, суть происходящего лучше всего сформулировал один исследователь из Центральной больницы штата Массачусетс, процитированный журналом Nature:

«Похоже, в генетике началась новая эра: благодаря поддержке промышленности возникают реальные возможности для быстрого и эффективного проведения высококачественных научных экспериментов»{70}70
  «Breast Cancer Discovery Sparks New Debate on Patenting Human Genes», Nature, № 371, 271–72, September 22, 1994.


[Закрыть].

Science и Nature продолжали публиковать сообщения о патентах на гены HGS и TIGR, а заодно и Myriad. В лабораториях всего мира захотели обследовать женщин на ген рака молочной железы, но Myriad запрещала делать это на коммерческой основе. Парадокс заключался в том, что если бы нам разрешили получить клоны ДНК, ген рака молочной железы не был бы запатентован, и обследование можно было бы беспрепятственно проводить в любой лаборатории.

К тому времени на мировой арене у нас появились и другие серьезные конкуренты в секвенировании, в том числе основанный в 1992 году фондом Wellcome Trust совместно с MRC Институт Сенгера. Кроме того, для обеспечения доступа европейских биологов к результатам секвенирования был создан Европейский институт биоинформатики.

У Великобритании имелась особая причина относиться к геномике серьезнее, чем большинство других стран, ведь именно в Великобритании началась генетическая революция – после открытия в 1953 году Уотсоном и Криком структуры двойной спирали, а затем объяснения Сенгера, как читать ее код.

Раздосадованное своими неудачными попытками извлечь выгоду из геномики, руководство Wellcome организовало осенью 1994 года в Вашингтоне закрытое заседание для обсуждения коммерческого использования генетических исследований. Инициаторами дискуссии, в которой приняли участие около тридцати человек, были директор научной программы фирмы Майкл Морган, Фрэнсис Коллинз и генетик Том Каски из Merck.

У главных игроков было много общего. Wellcome и НИЗ потеснил небольшой институт с бюджетом менее 1 % от их собственных, а Merck был в пух и прах разбит SmithKline.

Редакция Nature, готовящая к публикации мою статью «Анатомия гена человека», с сочувствием прокомментировала в своей передовице, как я «сталкивал лбами своих конкурентов», и сделала следующий вывод: «Вместо того, чтобы топить Вентера, геномное сообщество могло бы с пользой для себя попробовать применить его методы»{71}71
  «Ownership and the Human Genome», Nature, № 371, 363–364, September 29, 1994.


[Закрыть]. Хотя Уотсон и многие другие все еще грозились бойкотировать журнал, если редакция опубликует мою статью, Моргану вроде удалось внести положительную струю в дебаты на той встрече. Он предложил продемонстрировать примирение между SmithKline, HGS и их критиками из университетской среды, чтобы геномное сообщество заговорило о возможности создания генетических карт на основе EST, официально признав их важность{72}72
  Bishop J. «Merck’s Plan for Public-Domain Gene Data Could Blow Lid Off Secret Genetic Research», The Wall Street Journal Europe, September 30, 1994.


[Закрыть].

Однако 14 октября 1994 года, в день своего рождения, я обнаружил в Science трехстраничный материал под заголовком: «Препирательства по поводу фрагментов генов»{73}73
  Marshall E. «A Showdown Over Gene Fragments», Science, № 266, 208–10, October 14, 1994.


[Закрыть]. В статье говорилось, что участники встречи выплеснули накопившиеся у академического сообщества чувства возмущения и разочарования в связи с идеей патентования генов. Как выразился автор комментария в Science, «если кому-то сегодня и была отведена роль Франкенштейна, то это был Институт геномных исследований». (Один мой коллега в TIGR с сожалением заметил: «Они гонятся за нами с горящими факелами и вилами».)

Главный конкурент SmithKline, компания Merck, стремилась нарушить запрет своего соперника на применение EST по вполне понятным причинам: у Merck не было своей программы геномики, не было даже примитивных средств биоинформатики, зато был директор по науке, откровенно настроенный против геномики. Однако объявление HGS о своем эксклюзивном контракте с SmithKline Beecham вызвало у руководства компании сильное раздражение. Если Merck не суждено стать главным игроком, пусть не будет им никто. Руководство компании заплатило Бобу Уотерстону из Вашингтонского университета в Сент-Луисе за секвенирование EST человека и скорейшую передачу результатов в dbEST – публичную базу данных, созданную еще в мою бытность в НИЗ как специальное хранилище последовательностей EST.

Merck делала вид, что действовала «на благо человечества», а Уотерстон был только рад. Журналисты любят стереотипы, а тут вырисовывался простой и соблазнительный образ: «хорошие ребята» действуют на благо общества, а «плохие парни» работают на частные компании.

Руководители Merck, должно быть, со смеху покатывались у себя в компании: их стратегическое и расчетливое решение все восприняли как попытку спасти мир от алчных капиталистов! «Компания Merck, – писал Салстон, – сделала большое дело для науки – победил принцип свободного доступа к геномной информации»{74}74
  Sulston J., Ferry G. The Common Thread (London: Corgi, 2003), p. 139.


[Закрыть].

Кроме Merck, «хорошими ребятами» была и компания Wellcome, вторая по величине благотворительная организация в мире, финансируемая за счет прибылей и щедрости фармацевтической компании и наделенная безналоговым статусом, а также американская правительственная организация, упустившая инициативу, когда метод EST впервые продемонстрировал свои впечатляющие возможности. Вопрос, почему она оказалась вовлеченной в организованную британскими фирмами травлю американской биотехнологической компании, до сих пор не дает мне покоя. Обвинения их поистине непостижимы, ведь мы стали единственными исследователями, которые секвенировали EST и были готовы сделать многие из них доступными.

Я же оказался в центре этой мыльной оперы, эдаким олицетворением злодейского образа компании, «которую геномным исследователям так нравится ненавидеть», как выразился автор статьи в Science{75}75
  Marshall E. «The Company That Genome Researchers Love to Hate», Science, № 266, 1800–02, December 16, 1994.


[Закрыть]. Разыгрывалась обычная карта: якобы я «снимал сливки» и «захватывал территории». Порой нам делали и комплименты, причем с самых неожиданных сторон. «TIGR и Вентер сделали замечательную работу, а их результаты отличаются высоким качеством», – заявил Эрик Ландер.

Больше всего мне понравилось высказывание Вармуса: «Жаль, что мы не настояли, чтобы кто-нибудь создал подобную базу данных для открытого доступа несколько лет назад». Мне тоже жаль, что они этого не сделали. Возможно, Вармус не знал, что я разработал EST еще в НИЗ, хотел там же их секвенировать и, наконец, был вынужден уйти из НИЗ, чтобы получить возможность для такого секвенирования.

Как ни странно, столь назойливое внимание прессы оказалось мне во многом на руку. Статья в The Wall Street Journal от 28 сентября 1994 года под заголовком «План, который может вывести на чистую воду секретные генные исследования» привлекла еще больше внимания к моему методу и к моим идеям. Наряду с миллионами долларов, вливающихся теперь в секвенирование EST, все это помогало продвигать наш метод. Кроме того, теперь, после представления результатов этих «работающих на благо общества» организаций, мы смело могли публиковать свои статьи.

Однако я все еще был вынужден планировать свои действия на шаг вперед. HGS и SmithKline хотели, чтобы мы по-прежнему секвенировали EST, что мне казалось бессмысленным, – ведь HGS уже создала свой собственный центр секвенирования ДНК, а TIGR уже послал в Nature статью с описанием EST, соответствующих более чем половине всех генов человека. Я занимался наукой, и у меня была другая цель. Я хотел, чтобы TIGR в первую очередь был независимым некоммерческим институтом, мог использовать любые возможности по мере их возникновения и не был связан со стратегическими целями коммерческой организации.

Мне это удалось лишь частично, о чем свидетельствовали мои по-прежнему бурные взаимоотношения с SmithKline и HGS. Несмотря на то, что HGS делал все возможное, чтобы закрыть TIGR и сэкономить около 10 миллионов долларов в год, а Хазелтайн пытался приписать себе мои достижения, я чувствовал: пришло время сделать что-то новое. Я был загнан в ловушку обреченных на неудачу отношений и даже лишился части кишечника из-за чрезмерного стресса. Но несмотря ни на что я был готов идти вперед.

Глава 9
Метод дробовика – шотган-секвенирование

Если вы не можете объяснить любому, что вы делали, значит, вы занимались полной ерундой.

Эрвин Шрёдингер

Итак, мы научились выявлять гены человека с невообразимой скоростью, но наши достижения только разожгли аппетит и заставили приступить к еще более грандиозным проектам. Я решил вернуться к всестороннему и тщательному изучению генома человека – то есть прочитать каждое из 6 миллиардов оснований генетического кода в хромосомах наших клеток. Я всегда мечтал секвенировать геном человека целиком.

Однако для этого нужны были совершенно новые методы. Я был уверен, что найду более эффективный способ, чем тот, который использовали сегодня и который казался мне абсолютно устаревшим. Уже в 1986 году, когда я только начал заниматься геномикой, я мечтал о «конвейере», где ряды машины автоматически прочитывали бы код ДНК. Теперь у меня была именно такая, первая в мире лаборатория, и я был полон решимости использовать ее возможности. Альтернативой был кажущийся мне нелепым, еле-еле продвигавшийся вперед, правительственный проект «Геном человека». С самого начала этот проект рассматривался как грандиозный, а его прототипом стала расшифровка генома дрожжей, растянувшаяся на целое десятилетие и потребовавшая «пота и крови» тысяч ученых в дюжине стран мира.

Проблема, с которой мы столкнулись, – как читать последовательность всего кода, если имеющаяся технология обеспечивает одновременное секвенирование лишь нескольких сотен пар оснований. Если бы на моем месте был какой-нибудь кроткий монах, и перед ним стояла грандиозная задача секвенирования миллионов пар оснований генетического кода, то руководствуясь обычной логикой, он бы разбил ДНК на более мелкие, легко описываемые фрагменты. Для их обработки он бы использовал различные методы размножения этих фрагментов ДНК. Небольшие участки размером лишь в несколько тысяч пар оснований можно было бы просто мультиплицировать в стандартных плазмидах.

Для участков ДНК размером до 18 тысяч пар оснований использовался бактериальный вирус, или фаг лямбда, а для участков ДНК, считавшихся тогда особенно большими и насчитывавших около 35 тысяч пар оснований, применялись специальные плазмиды – так называемые «космиды». На заре геномики почти все ученые использовали эти космиды. Процесс казался очень логичным, но логичный путь не всегда самый быстрый. Иногда случайный подход тоже может оказаться вполне эффективным.

Выполняя свою кропотливую и дорогостоящую работу, трудолюбивые монахи сначала аккуратно разместили бы все космиды в правильном порядке, как и в книге жизни. Результатом стала бы основанная на космидах геномная карта. Только после завершения этапа картирования настоятель монастыря оплатил бы работу монахов и благословил бы их на последовательное секвенирование космид. Проведение картирования до секвенирования вполне возможно, но занимает очень много времени.

Фредерику Блаттнеру, исследовавшему кишечную бактерию E. coli, геном которой почти в тысячу раз меньше генома человека, потребовалось три года, чтобы встроить клоны лямбды в карту генома до секвенирования. А на попытку создания карт хромосом человека ушло более десятка лет и 1,5 миллиарда долларов, но карты эти так и остались незавершенными. Как сказал один биолог, «за время секвенирования генома человека, выявляя клон за клоном, вполне можно было сделать не одну успешную карьеру в науке»{76}76
  Ashburner M. Won for All: How the Drosophila Genome Was Sequenced (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2006), p. 7.


[Закрыть].

Создавалось впечатление, что цель картирования – избежать секвенирования ДНК. Однако результаты EST четко продемонстрировали, как много информации содержится всего лишь в нескольких сотнях пар оснований кода ДНК: метод EST не только определяет уникальную сигнатуру фрагмента, которую можно использовать для картирования генома, но часто содержит и информацию о структуре гена и его функции. Почему же не использовать информационные возможности секвенирования? Почему бы не отказаться от утомительного картирования клонов и утомительной работы, доставшейся нашим монахам?

Несколько лет назад я уже придумал альтернативный способ секвенирования генома оспы – методом дробовика, а именно фрагментации его на тысячи осколков ДНК, а затем, после обнаружения конкретных перекрывающихся последовательностей, реконструирование генома по последовательности отдельных фрагментов. Ну как при складывании головоломки, когда выкладываешь все ее части, а затем берешь по одной и сравниваешь с другими, пока не находишь ей соответствие. Но имея дело с тысячью и даже миллионами участков генома, составлять такую головоломку нужно с помощью компьютера.

Когда я занимался секвенированием генома оспы, мне пришлось отказаться от этого метода – тогда не было соответствующих компьютерных программ. Но позже они по явились – в результате случайной встречи в марте 1993 года в Испании, в Бильбао.

Меня пригласили выступить там на конференции, организованной ведущим испанским генетиком Сантьяго Гризолиа. Мой доклад был последним. Он вызвал интерес к нашим результатам по EST и другим, в том числе по идентификации генов рака толстой кишки.

Неизбежно возникли вопросы по поводу патентования генов, и один священник, видный богослов, заявил, что патентовать гены человека безнравственно. Я спросил его, так же ли безнравственно патентовать гены других видов животных? Нет, ответил он, – и это был тот самый ответ, которого я ждал. Я сообщил ему, что TIGR только что секвенировал ген человека, идентичный гену крысы, и кодируемые им белки оказались абсолютно одинаковыми. Он опешил, поскольку не подозревал, что геном человека почти не отличается от геномов всех других видов живого.

Наконец, когда толпа желавших поговорить со мной один на один рассосалась, ко мне подошел высокий, седой, добродушного вида господин в очках. «Я думал, вы с рожками», – сказал он, намекая на мой демонический образ, созданный прессой. Это был Хэмилтон Смит из Университета Джона Хопкинса. Я, конечно, слышал о Хэме раньше – благодаря безупречной репутации Смита, широкой известности в научных кругах и полученной им Нобелевской премии. Он мне сразу понравился, потому что явно собирался сделать собственные выводы обо мне и моих исследованиях, не полагаясь на чужое мнение.

Смит открыл ферменты рестриктазы, молекулярные «ножницы» для разрезания ДНК в точно определенном месте. Сегодня известны сотни рестриктаз. Одни распознают 4 пары оснований, такие как GTAC, и разрезают ДНК в тех участках последовательности, где встречают GTAC. Другие однозначно распознают 8 пар оснований – такие палиндромы встречаются только один раз на каждую сотню тысяч пар оснований. Чем больший палиндром распознает рестриктаза, тем реже она встречается. Открытия Смита очень широко используются, и молекулярная биология, возможно, не достигла бы без них своего нынешнего уровня. В 1972 году Пол Берг использовал ферменты рестрикции для создания с помощью бактерий чужеродного белка, положив начало современной биотехнологической промышленности. Первые карты геномов даже называли «рестрикционными картами», построенными на основании размера фрагментов, выявленных с помощью данного фермента. Сегодня эти карты используются, среди прочего, для геномной идентификации в криминалистике.

Мы со Смитом зашли пропустить по рюмочке в бар, и вскоре мне стало ясно, что этот весьма скромный человек не желает почивать на лаврах своих прежних достижений. Пока я пил пиво, он потягивал коктейль «Манхэттен» и расспрашивал о нашем секвенировании, его точности, оборудовании и открываемых генах. Я пригласил его пообедать со мной и кое с кем из моих друзей. Он объяснил, что ему, как лауреату Нобелевской премии, нужно сегодня присутствовать на официальном ужине в качестве «свадебного генерала», но потом сказал: «Да ну их!», и мы присоединились к небольшой веселой вечеринке в местном ресторанчике, которая, по испанской традиции, затянулась до самого утра.

После ужина мы вернулись в отель для продолжения разговора. Хотя Смит старше меня больше чем на десять лет, у нас оказалось много общего. В детстве мы оба любили строить всякие штуковины, вдохновленные примером старших братьев (к сожалению, у брата Хэма было психическое заболевание, и его положили в больницу), и мы оба получили медицинское образование. Хэм тоже служил в армии, в Сан-Диего. И у него однажды тоже было столкновение с Биллом Хазелтайном – Хэм заподозрил его в попытке задержать публикацию статьи конкурента. На следующий день я пригласил его стать членом Научно-консультативного совета TIGR.

В том же году Хэм принял участие в первом заседании совета, где он поднял руку и спросил: «Вы себя называете Институтом геномных исследований. Как насчет того, чтобы этим и заняться?» Он рассказал нам о Haemophilus influenzae (гемофильной палочке), которую он исследовал в течение двадцати лет и выяснил, что ее геном меньше, чем у E. coli, и что она обладает и другими свойствами, которые делают ее идеальным кандидатом для секвенирования. Я давно искал подходящий геном, чтобы попробовать метод дробовика для секвенирования всего генома. Идея секвенирования H. Influenzae мне очень понравилась, к тому же у H. Influenzae был сходный состав по соотношению G/C с ДНК человека. Появлялась реальная возможность впервые секвенировать геном свободноживущего организма, досконально изученного Хэмом.

Наше сотрудничество набирало обороты с некоторым трудом. Хэм объяснял это тем, что с библиотеками клонов, содержащих фрагменты генома H. Influenzae, имеются проблемы. Только спустя годы он признался, что его коллеги из Университета Джона Хопкинса относились ко мне с большим подозрением из-за нападок Уотсона и других критиков, и он опасался, что работа со мной повредит его репутации. И все-таки Хэм решил создать библиотеку генов Haemophilus. А у нас уже была подходящая компьютерная программа для сборки фрагментов. Хэм смоделировал некую имитацию сборки и считал возможным осуществить ее с примерно 25 тысячами участков. Сотрудники TIGR были полны энтузиазма, а вот изобретатель геномного ассемблера TIGR Грейнджер Саттон не был уверен, что его программа справится с задачей восстановления всей секвенированной ДНК обратно в геном, состоящий из 1,8 миллиона пар оснований. Грейнджер был не только молчалив, но и очень скромен: на самом деле, незадолго до этого его программа соединила в кластеры соответствующей ДНК более 100 тысяч последовательностей EST, и я был уверен, что его ассемблер справится с геномом H. Influenzae.

Мы приступили к оформлению гранта в НИЗ на тестирование нашего метода летом 1994 года. Естественно, я беспокоился, что по политическим причинам НИЗ откажется нас финансировать, а нам с Хэмом не терпелось приступить к работе. Исследования геномов дрожжей и E. coli финансировались уже много лет, и если бы мы «переиграли» их с помощью нашего метода, это стало бы началом очень важного этапа: прочитав код патогена, насчитывающего почти миллион пар оснований, мы бы впервые расшифровали геном свободноживущего организма. Вместо того, чтобы девять месяцев ждать весьма вероятного отказа от НИЗ, я принял решение перенаправить часть бюджета TIGR, около миллиона долларов, на исследование H. Influenzae. Я был уверен – этот риск оправдан.

Спустя четыре месяца мы получили последовательности 25 тысяч участков ДНК H. Influenzae, и команда Грейнджера взялась за дело. Через несколько недель из фрагментов было собрано несколько очень больших отрезков генома. Но оставались еще некоторые мелкие неучтенные фрагменты, и было не совсем ясно, как они встроены в хромосому.

Эти результаты не оправдали «великой геномной мечты», в которой все клоны ДНК генома выращивались в E. coli, секвенировались, затем собирались вместе с помощью компьютера, и, в конце концов, появлялась целиком вся хромосома. Но так происходит очень редко, и на то есть веские причины. Одна из них – зависимость роста чужеродных фрагментов ДНК от бактериальной среды E. coli. Некоторые ДНК явно токсичны для E. coli, и они удаляются биохимическим механизмом ее клеток. Рестриктазы используются бактериями для защиты от атак чужеродных ДНК, постоянно циркулирующих вокруг, например от вирусов.

Тем не менее недостающие куски геномной головоломки помогли мне понять, что карта генома может упорядочить последовательность и собранные фрагменты таким же образом, как картинка готовой головоломки помогает в ее сборке, даже если некоторые элементы отсутствуют. Подобно мореплавателям, генетики на протяжении многих лет использовали различные виды карт. Среди них – так называемые функциональные карты, или карты сцепления.

При воспроизведении гены материнского организма часто, но не всегда, передаются потомству. Чем дальше друг от друга расположены гены на хромосоме, тем меньше вероятность, что такая передача произойдет. Изучая частоту совместной передачи двух генов из поколения в поколение, ученые могут оценить, насколько близко на хромосоме они расположены, и создать карту сцепления. Впервые хромосома была картирована таким образом в начале 1990-х великим американцем Томасом Хантом Морганом при исследовании плодовой мушки. В его честь был назван участок гена, состоящий из около одного миллиона пар оснований генетического кода – сантиморган. О карте с таким разрешением генетики давно мечтали.

Другой вид генетических карт – физическая карта, основанная на поиске физического местоположения данного гена. Определяется, на какой хромосоме находится ген, с чем соседствует, и в каком именно участке хромосомы находится.

Но я не собирался создавать ни карту сцепления, ни физическую карту до секвенирования, как это сделали мои конкуренты. Команда Фреда Блаттнера потратила три года на разработку карты клона лямбды E. coli, и конечным результатом их работы стали 18 перекрывающихся килобаз клонов, подобных сцепляющимся друг с другом элементам игры «Лего», – грандиозный подвиг традиционного генетического исследования. Но у меня не было необходимости создавать такую карту. Каждый, кто хоть раз собирал пазл, знает, что можно продолжать сборку, не зная всей картинки, если идти от краев и других узнаваемых частей снизу вверх. В общем-то, последовательность ДНК сама является конечной физической картой, в которой все пары оснований генетического кода известны, так же как и точный порядок их расположения.

Не имея карты генома H. influenzae, мы разработали несколько принципиально новых методов организации больших совокупностей фрагментов для воссоздания генома. В одном случае для копирования ДНК из генома мы использовали технологию ПЦР. Два химических соединения, так называемых праймера, определяют начало и конец копируемого участка. Мы использовали праймеры, полученные из последовательностей вблизи концов собранных фрагментов. Затем мы попытались использовать ПЦР со всеми комбинациями праймеров с помощью зонда ПЦР от конца каждой последовательности, поочередно со всеми другими зондами ПЦР от концов всех остальных участков.

Получив из генома фрагмент ДНК, мы его быстро секвенировали. Затем мы соединяли в последовательность два других фрагмента. Проделывая одновременно несколько комбинаций, мы могли относительно быстро составить бóльшую часть генома.

Метод ПЦР не работает с каждой точкой геномного разрыва, поэтому я придумал совершенно новую методику секвенирования генома человека. Собрав с максимальной точностью, по специальной компьютерной программе полный комплект из 25 тысяч фрагментов генома Haemophilus, мы в результате получили большие наборы перекрывающихся фрагментов ДНК, так называемые «контиги» (от «contiguous» – «перекрывающиеся»). Чтобы использовать контиги для сборки генома, я планировал сравнивать оба конца нескольких сотен случайных клонов фага лямбда. Если конец одного клона лямбды соответствует одному контигу, а другой конец – другому контигу, то это означает, что мы автоматически определили правильный порядок и ориентацию этих контигов. Нам нужно было разработать новые методы секвенирования только концов клонов лямбды, но это можно было сделать довольно быстро. Получив всего несколько последовательностей со спаренными концами, мы уже могли соединить ансамбли ДНК в правильном порядке. Эта стратегия «секвенирования спаренных концов», предполагающая знание точного количества участков, разделяющих два элемента генетической головоломки, и стала ключом к секвенированию всего генома методом дробовика. Итак, секвенирование свелось всего лишь к заполнению нескольких разрывов во всем геноме бактерии, и мы убедились, что нашли оптимальную методику.

Вскоре должна была состояться конференция по секвенированию геномов, на которой я хотел представить наши результаты. Мы очень гордились достигнутыми успехами, и я с нетерпением ждал открытия конференции. Мы прошли долгий путь, начав с тестирования сумасбродной идеи, и теперь стояли на пороге прорыва, впервые в истории секвенировав геном свободноживущего организма.

В сентябре того же года Роберт Флейшман представил наши результаты на Конференции по секвенированию генома в Хилтон-Хеде в Южной Калифорнии. Нам казалось, что презентация прошла очень хорошо, и мы были буквально поражены, когда выступил Уотерстон и назвал наш метод бесполезным. Он утверждал, что метод никогда не будет работать и наш единственный результат – 11 фрагментов, которые никоим образом не упорядочить. Хэм расстроился больше всех. Он и по сей день не может забыть скандальное выступление Уотерстона в 1994 году.

Вскоре после возвращения в Роквилл мы получили ожидаемый ответ по поводу нашей с Хэмом грантовой заявки на исследование Haemophilus, поданной в начале года. Оценка экспертов была невысокая, и до вопросов финансирования дело даже не дошло. Заключение рецензентов отражало мнение геномного сообщества: как и Уотерстон, все они считали наш метод (к тому же применяемый без их ведома) бесперспективным, а попытки его использовать – бессмысленными. Правда, меня несколько утешило особое мнение небольшой группы независимых экспертов НИЗ, которые выразили несогласие с мнением большинства и посчитали нашу программу достойной финансирования.

Я прикрепил письмо с отказом в финансировании на дверь своего кабинета. Тогда я уже не сомневался, что у нас все получится. Мы с Хэмом решили напрямую обратиться к Фрэнсису Коллинзу с просьбой финансировать проект, представив данные о наших последних результатах, из которых следовало, что в самое ближайшее время мы, скорее всего, расшифруем первый в истории геном. Разумеется, на карту было поставлено нечто большее, чем просто научные достижения. Мы были потрясены, получив через несколько недель письмо из Центра генома НИЗ с отказом.

Однако это письмо нисколько не охладило наш пыл, а побудило продемонстрировать, как ошибаются наши критики. Для этого мы вскоре ликвидировали последние разрывы в последовательности Haemophilus influenzae. Итак, мы первыми секвенировали генетический код свободноживущего организма, и, что было не менее важно, сделали это, разработав принципиально новый метод. Это «секвенирование всего генома методом дробовика» позволило нам быстро (в двадцать раз быстрее, чем любым другим методом) и без геномной карты секвенировать и реконструировать с помощью компьютера весь геном. Конечно, мы очень многим были обязаны Сенгеру, но наш метод обладал важными отличиями. Секвенированные Сенгером в его пионерском исследовании вирусы отнюдь не являлись живыми организмами, а представляли собой сложные химические структуры, которые ведут себя по-пиратски и воспроизводятся только в клетках другого существа. Сенгер разбил геномы вирусов на определенные участки с помощью ферментов рестрикции, поэтому его метод дробовика не был в полной мере случайным. И хотя Сенгер тоже использовал компьютеры, их программное обеспечение не смогло бы «переварить» получаемый нами объем данных.

Исследования Сенгера были, бесспорно, основополагающими и значительно продвинули методы секвенирования ДНК, но их нужно было усовершенствовать и адаптировать для расшифровки геномов живых организмов. Его последователи использовали фрагментацию ультразвуком, но они по-прежнему применяли его только для клонов рестрикционных фрагментов, даже при секвенировании более крупных вирусных геномов. Другие ученые, например Клайд Хатчисон из Университета Северной Каролины (ныне сотрудник Института Крейга Вентера), пробовали применять метод дробовика, но их смущала необходимость вручную секвенировать и собирать случайные участки ДНК – процедура, резко усложняющаяся для больших геномов.