Текст книги "Полный курс за 3 дня. Микробиология"

4. Виды пластического обмена

Основными видами пластического обмена являются:

1) белковый;

2) углеводный;

3) липидный;

4) нуклеиновый;

5) минеральный.

Белковый обмен характеризуется катаболизмом и анаболизмом. В процессе катаболизма бактерии разлагают белки под действием протеаз с образованием пептидов. Под действием пептидаз из пептидов образуются аминокислоты.

Распад белков в аэробных условиях называется тлением, в анаэробных – гниением.

В результате распада аминокислот клетка получает ионы аммония, необходимые для формирования собственных аминокислот. Бактериальные клетки способны синтезировать все 20 аминокислот. Ведущими из них являются аланин, глютамин, аспарагин. Они включаются в процессы переаминирования и трансаминирования. В белковом обмене процессы синтеза преобладают над распадом, при этом происходит потребление энергии.

В углеводном обмене у бактерий катаболизм преобладает над анаболизмом. Сложные углеводы внешней среды могут расщеплять только те бактерии, которые выделяют ферменты – полисахаридазы. Полисахариды расщепляются до дисахаров, которые под действием олигосахаридаз распадаются до моносахаров, причем внутрь клетки может поступать только глюкоза. Часть ее идет на синтез собственных полисахаридов в клетке, другая часть подвергается дальнейшему расщеплению, которое может идти по двум путям: по пути анаэробного распада углеводов – брожению (гликолизу) и в аэробных условиях – по пути горения.

В зависимости от конечных продуктов выделяют следующие виды брожения:

1) спиртовое (характерно для грибов);

2) пропионионово-кислое (характерно для клостридий, пропиони-бактерий);

3) молочно-кислое (характерно для стрептококков);

4) масляно-кислое (характерно для сарцин);

5) бутилденгликолевое (характерно для бацилл).

Наряду с основным анаэробным распадом (гликолизом) могут быть вспомогательные пути расщепления углеводов (пентозофосфатный, кетодезоксифосфоглюконатный и др.) Они отличаются ключевыми продуктами и реакциями.

Липидный обмен осуществляется с помощью ферментов – липопротеиназ, летициназ, липаз, фосфолипаз.

Липазы катализируют распад нейтральных жирных кислот, т. е. ответственны за отщепление этих кислот от глицерина. При распаде жирных кислот клетка запасает энергию. Конечным продуктом распада является ацетил-КоА.

Биосинтез липидов осуществляется за счет ацетилпереносящих белков. При этом ацетильный остаток переходит на глицерофосфат с образованием фосфатидных кислот, а они уже вступают в химические реакции с образованием сложных эфиров со спиртами. Эти превращения лежат в основе синтеза фосфолипидов.

Бактерии способны синтезировать как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты, но синтез последних более характерен для аэробов, так как требует кислорода.

Нуклеиновый обмен бактерий связан с генетическим обменом. Синтез нуклеиновых кислот имеет значение для процесса деления клетки. Синтез осуществляется с помощью ферментов: рестриктазы, ДНК-полимеразы, лигазы, ДНК-зависимые-РНК-полимеразы.

Рестриктазы вырезают участки ДНК, убирая нежелательные вставки, а лигазы обеспечивают сшивку фрагментов нуклеиновой кислоты. ДНК-полимеразы ответственны за репликацию дочерней ДНК по материнской. ДНК-зависимые-РНК-полимеразы отвечают за транскрипцию, осуществляют построение РНК на матрице ДНК.

Минеральный обмен важен для синтеза тела бактерий. Для него необходимы не только азот и углерод, но и зольные элементы – сера, фосфор, калий и кальций, а также микроэлементы – бор, молибден, цинк, марганец, кобальт, никель, йод, бром, медь и др. В состав цитоплазмы бактерий входит сера, которая участвует в синтетических реакциях в виде R-SH. Данная сера восстановленной формы обладает высокой реактивностью и легко поддается дегидрированию с последующим превращением в сложные соединения, которые при гидрировании восстанавливаются, благодаря чему регулируется окислительно-восстановительный потенциал в цитоплазме бактерии.

В нуклеиновых кислотах, многих ферментах, различных фосфолипидах и других органических соединениях содержится фосфор, который не вступает в непосредственное соединение с углеродом, но образует связи через атомы кислорода. В процессе окислительных реакций высвобождается энергия, аккумулированная в цитоплазме клеток. При этом большую роль в энергетическом обмене в клетке играют АТФ– и АДФ-кислоты. Кроме того, фосфор входит в состав нуклеопротеидов, фосфолипидов, простетических групп большинства двухкомпонентных ферментов, являющихся важнейшими соединениями цитоплазмы.

Для нормального развития микроорганизмов необходимы катионы и анионы многих металлов, в том числе магния, кальция, железа. Микроэлементы участвуют в синтезе ферментов и активизируют их.

Тема 4. Генетика микроорганизмов. Бактериофаги

1. Организация наследственного материала бактерий

ДНК является материальной основой наследственности, которая определяет генетические свойства всех организмов, за исключением РНК-содержащих вирусов, у которых вся генетическая информация записана в РНК.

Геном – фрагмент молекулы ДНК, контролирующий синтез одного белка или пептида. Генетическая информация относительно всех признаков, присущих клетке или вириону, записана в генах. Гены, несущие информацию о синтезируемых микроорганизмами ферментах или структурных белках, называются структурными генами, их транскрипции регулируются регуляторными генами.

Наследственный аппарат бактерий представлен одной хромосомой, которая представляет собой молекулу ДНК, она спирализована и свернута в кольцо. Это кольцо в одной точке прикреплено к цитоплазматической мембране. На бактериальной хромосоме располагаются отдельные гены.

Функциональными единицами генома бактерий, кроме хромосомных генов, являются:

1) IS-последовательности;

2) транспозоны;

3) плазмиды.

IS-последовательности – это короткие фрагменты ДНК. Они не несут структурных (кодирующих белок) генов, а содержат только гены, ответственные за транспозицию (способность перемещаться по хромосоме и встраиваться в различные ее участки).

Транспозоны – это более крупные молекулы ДНК. Помимо генов, ответственных за транспозицию, они содержат и структурный ген. Транспозоны способны перемещаться по хромосоме. Их положение сказывается на экспрессии генов. Транспозоны могут существовать и вне хромосомы (автономно), но неспособны к автономной репликации.

Плазмиды – дополнительный внехромосомный генетический материал. Представляет собой кольцевую, двунитевую молекулу ДНК, гены которой кодируют дополнительные свойства, придавая селективные преимущества клеткам. Плазмиды способны к автономной репликации, т. е. независимо от хромосомы или под слабым ее контролем. За счет автономной репликации плазмиды могут давать явление амплификации: одна и та же плазмида может находиться в нескольких копиях, тем самым усиливая проявление данного признака.

В зависимости от свойств признаков, которые кодируют плазмиды, различают:

1) R-плазмиды. Обеспечивают лекарственную устойчивость; могут содержать гены, ответственные за синтез ферментов, разрушающих лекарственные вещества, могут менять проницаемость мембран;

2) F-плазмиды. Кодируют пол бактерий. Мужские клетки (F+) содержат F-плазмиду, женские (F-) – не содержат. Мужские клетки выступают в роли донора генетического материала при конъюгации, а женские – реципиента. Они отличаются поверхностным электрическим зарядом и поэтому притягиваются. От донора переходит сама F-плазмида, если она находится в автономном состоянии в клетке.

F-плазмиды способны интегрировать в хромосому клетки и выходить из интегрированного состояния в автономное. При этом захватываются хромосомные гены, которые клетка может отдавать при конъюгации;

3) Col-плазмиды. Кодируют синтез бактериоцинов. Это бактерицидные вещества, действующие на близкородственные бактерии;

4) Tox-плазмиды. Кодируют выработку экзотоксинов;

5) плазмиды биодеградации. Кодируют ферменты, с помощью которых бактерии могут утилизировать ксенобиотики.

Потеря клеткой плазмиды не приводит к ее гибели. В одной и той же клетке могут находиться разные плазмиды.

2. Изменчивость бактерий

Различают два вида изменчивости – фенотипическую и генотипическую.

Фенотипическая изменчивость – модификации – не затрагивает генотип. Модификации затрагивают большинство особей в популяции. Они не передаются по наследству и с течением времени затухают, т. е. возвращаются к исходному фенотипу.

Генотипическая изменчивость затрагивает генотип. В основе ее лежат мутации и рекомбинации.

Мутации – изменение генотипа, сохраняющееся в ряду поколений и сопровождающееся изменением фенотипа. Особенностью мутаций у бактерий является относительная легкость их выявления.

По локализации различают мутации:

1) генные (точечные);

2) хромосомные;

3) плазмидные.

По происхождению мутации могут быть:

1) спонтанными, образующимися самопроизвольно и без видимого внешнего воздействия;

2) индуцированными, появляющимися в результате обработки микробной популяции мутагенными агентами, которыми могут быть: радиация, температурные, химические и другие воздействия, т. е. экспериментальным путем.

По направлению мутационного изменения мутации подразделяются на:

1) прямые – возникают в геноме «дикого типа» у бактерий в естественных условиях обитания. Образовавшиеся особи являются мутантами.

2) обратные (реверсионные) – мутации, завершающиеся возвратом от мутантного типа к дикому. Особи, возникшие в результате таких мутаций, называются реверентами. Реверсия может быть истинной в результате восстановления первоначального состояния мутантного гена; супрессорной, если реверсия происходит за счет дополнительной мутации.

Диссоциация – одна из форм мутации, в результате которой в популяции микроорганизмов возникают особи, отличающиеся от исходных внешним видом и структурой колоний, так называемые S-формы (круглые, влажные, с блестящей гладкой поверхностью и ровными краями) и R-формы (колонии неправильной формы, непрозрачные, сухие, с неровными краями и шероховатой поверхностью). S– и R-колонии являются крайними формами диссоциации, между которыми могут встречаться переходные формы. Диссоциация – явление генетической природы, оно связано с хромосомными мутациями генов, контролирующих синтез липополисахаридов клеточной стенки бактерий. Эта форма мутации известна у многих видов, возникает в природных условиях, но чаще выявляется в стареющих культурах.

Рекомбинации – это обмен генетическим материалом между двумя особями с появлением рекомбинантных особей с измененным генотипом.

У бактерий существует несколько механизмов рекомбинации:

1) конъюгация;

2) слияние протопластов;

3) трансформация;

4) трансдукция.

Конъюгация – обмен генетической информацией при непосредственном контакте донора и реципиента. Наиболее высокая частота передачи у плазмид, при этом плазмиды могут иметь разных хозяев. После образования между донором и реципиентом конъюгационного мостика одна нить ДНК-донора поступает по нему в клетку-реципиент. Чем дольше этот контакт, тем большая часть донорской ДНК может быть передана реципиенту.

Слияние протопластов – механизм обмена генетической информацией при непосредственном контакте участков цитоплазматической мембраны у бактерий, лишенных клеточной стенки.

Трансформация – передача генетической информации в виде изолированных фрагментов ДНК при нахождении реципиентной клетки в среде, содержащей ДНК-донора. Для трансдукции необходимо особое физиологическое состояние клетки-реципиента – компетентность. Это состояние присуще активно делящимся клеткам, в которых идут процессы репликации собственных нуклеиновых кислот. В таких клетках действует фактор компетенции – это белок, который вызывает повышение проницаемости клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, поэтому фрагмент ДНК может проникать в такую клетку.

Эффективность трансформации зависит от физико-химических условий, а также физиологического состояния реципиентов и трансформирующей ДНК.

Трансдукция – это передача генетической информации между бактериальными клетками с помощью умеренных трансдуцирующих фагов. Трансдуцирующие фаги могут переносить один или более генов. Трансдукция бывает:

1) специфической (переносится всегда один и тот же ген, трансдуцирующий фаг всегда располагается в одном и том же месте);

2) неспецифической (передаются разные гены, локализация трансдуцирующего фага непостоянна).

3. Бактериофаги

Бактериофаги (фаги) – это вирусы, поражающие клетки бактерий. Они не имеют клеточной структуры, не способны сами синтезировать нуклеиновые кислоты и белки, поэтому являются облигатными внутриклеточными паразитами. Бактериофаги широко распространены в природе и находятся в воде, почве, пищевых продуктах, различных выделениях из организма людей и животных. Выявляются у большинства патогенных и непатогенных микроорганизмов.

Фаги различаются по форме, типу взаимодействия с микробной клеткой и специфичности.

Большинство фагов имеет форму головастика или сперматозоида, некоторые фаги имеют кубическую или нитевидную форму. Размеры колеблются от 20 до 800 нм у нитевидных фагов.

Фаги, напоминающие своим внешним видом головастиков, изучены наиболее полно. Под микроскопом отчетливо видно, что они состоят из вытянутой икосаэдрической головки и хвостового отростка, внутри которого имеется цилиндрический стержень, сообщающийся отверстием с головкой. Снаружи хвостовой отросток покрыт чехлом, который способен сокращаться наподобие мышцы. Заканчивается хвостовой отросток шестиугольной базальной пластинкой, имеющей короткие шипы с нитевидными структурами, называемыми фибриллами.

Химический состав фагов ограничивается двумя основными химическими компонентами: нуклеиновыми кислотами (ДНК или РНК) и белком. Двунитчатая ДНК плотно упакована в виде спирали внутри головки. Белки же входят в состав оболочки, окружающей нуклеиновую кислоту, и во все структурные элементы хвостового отростка. Структурные белки фага различаются по составу полипептидов и бывают в виде множества идентичных субъединиц, которые уложены по спиральному или кубическому типу симметрии. У некоторых фагов, кроме структурных белков, обнаружены геномные, или внутренние, белки, связанные с нуклеиновой кислотой, а также белки-ферменты, которые участвуют во взаимодействии фага с клеткой.

Фаги по сравнению с бактериями являются более устойчивыми к действию химических и физических факторов. Так, ряд дезинфицирующих веществ не оказывает существенного влияния на фаги, но отмечается их высокая чувствительность к формалину и кислотам. При температуре 65–70 °С наступает инактивация большинства фагов. При высушиваниии в запаянных ампулах, а также при замораживании в глицерине при температуре – 185 °С они способны сохраняться длительное время. Ультрафиолетовые лучи и ионизирующая радиация вызывают их инактивацию, а в более низких дозах – мутацию.

Фаги могут существовать в двух формах:

1) внутриклеточной (это профаг, чистая ДНК);

2) внеклеточной (это вирион).

Фаги, как и другие вирусы, обладают антигенными свойствами и содержат группоспецифические и типоспецифические антигены.

Различают два типа взаимодействия фага с клеткой:

1) литический (продуктивная вирусная инфекция). Это тип взаимодействия, при котором происходит репродукция вируса в бактериальной клетке. Она при этом погибает. Вначале происходит адсорбция фагов на клеточной стенке. Затем следует фаза проникновения. В месте адсорбции фага действует лизоцим, и за счет сократительных белков хвостовой части в клетку впрыскивается нуклеиновая кислота фага. Далее следует средний период, в течение которого подавляется синтез клеточных компонентов и осуществляется дисконъюнктивный способ репродукции фага. При этом в области нуклеоида синтезируется нуклеиновая кислота фага, а затем на рибосомах осуществляется синтез белка. Фаги, обладающие литическим типом взаимодействия, называют вирулентными.

В заключительный период в результате самосборки белки укладываются вокруг нуклеиновой кислоты и образуются новые частицы фагов. Они выходят из клетки, разрывая ее клеточную стенку, т. е. происходит лизис бактерии;

2) лизогенный. Это умеренные фаги. При проникновении нуклеиновой кислоты в клетку идет интеграция ее в геном клетки, наблюдается длительное сожительство фага с клеткой без ее гибели. При изменении внешних условий могут происходить выход фага из интегрированной формы и развитие продуктивной вирусной инфекции.

Клетка, содержащая профаг в геноме, называется лизогенной и отличается от исходной наличием дополнительной генетической информации за счет генов профага. Это явление лизогенной конверсии.

По признаку специфичности выделяют:

1) поливалентные фаги (лизируют культуры одного семейства или рода бактерий);

2) моновалентные (лизируют культуры только одного вида бактерий);

3) типовые (способны вызывать лизис только определенных типов (вариантов) бактериальной культуры внутри вида бактерий).

Фаги могут применяться в качестве диагностических препаратов для установления рода и вида бактерий, выделенных в ходе бактериологического исследования. Однако чаще их применяют для лечения и профилактики некоторых инфекционных заболеваний. Умеренные фаги используются в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК в генной инженерии и биотехнологии.

Тема 5. Распространение микробов в природе и методы микробиологического контроля почвы, воды и воздуха

1. Микрофлора почвы

Плодородие почвы обеспечивается не только наличием в ней неорганических и органических веществ, но и различными видами микроорганизмов, которые обусловливают качественный состав почвы. Наиболее богаты микроорганизмами верхние слои почвы. Так, на глубине 5–15 см их содержится 1 000 000 в 1 мм³, но с увеличением глубины их число снижается, и на глубине 1,5 м и более можно встретить лишь единичные особи. Плотность микрофлоры особенно высока в черноземных, каштановых почвах, а также в хорошо удобряемых сероземах. Всего лишь 1 г плодородной почвы содержит несколько миллионов бактерий большинства известных к настоящему времени видов, миллион спор грибов, полсотни тысяч водорослей и четверть сотни тысяч простейших. Микрофлора плодородной почвы представлена микробными популяциями водорослей, актиномицетов, нитрифицирующих, денитрифицирующих, целлюлозоразлагающих бактерий, пигментных микробов, грибов, простейших, серобактерий, азотофиксирующих бактерий. Вместе с растениями и животными они составляют сложные и многообразные биогеноценозы, плотность и состав которых, а также функциональная активность и другие важные характеристики зависят прежде всего от типа и структуры почвы, от ее физико-химических показателей, в том числе от влажности и интенсивности инсоляции.

Почвенные микроорганизмы участвуют во всех процессах превращения веществ и энергии. При этом они осуществляют синтез биомассы и аккумуляцию энергии, биологическую фиксацию азота, брожение, гниение, нитрификацию и т. д. Так как все эти процессы протекают в природе с достаточно большой скоростью, то в результате происходит относительно быстрое превращение органических веществ в гумус, определяющий плодородие почвы.

Через почву могут передаваться возбудители многих инфекционных заболеваний, таких как столбняк, газовая гангрена, ботулизм.

Аспорогенные, патогенные и условно-патогенные бактерии, а также многие вирусы способны выживать в почве в течение от нескольких дней до нескольких месяцев, а споры возбудителей столбняка, сибирской язвы, анаэробной раневой инфекции могут сохраняться в течение многих лет. Кроме того, для возбудителей ботулизма, актиномикоза, глубоких микозов и микотоксикозов почва и вовсе является естественной средой обитания. Поэтому ранения кожных покровов, загрязненные землей, требуют безотлагательной профилактики с целью предупреждения развития раневой инфекции.

2. Микрофлора воды

Вода открытых морских и пресноводных водоемов, так же как и почва, является естественной средой обитания разнообразных бактерий, грибов, вирусов, микроскопических водорослей, простейших, также участвующих в циклах превращений соединений азота, углерода, серы, фосфора и других важных элементов. При этом отмечается обеднение микрофлорой грунтовых вод: в них содержатся лишь единичные микроорганизмы. Это объясняется их задержкой более верхними слоями почвы.

Так же как и в различных слоях почвы, состав микроорганизмов в различных слоях воды неодинаков и обусловлен степенью их адаптации к определенным условиям, включающим физико-химические условия, освещенность, степень растворимости кислорода и диоксида углерода, содержание органических и минеральных веществ и др. Этим обусловлены и различия в функциях микроорганизмов на поверхности воды и на дне водоема. Так, на поверхности воды микроорганизмы образуют пленку, в которой протекают процессы фотосинтеза. На дне, в иле, при наличии анаэробных условий активно протекают процессы гниения и брожения, хемоавтотрофного, метилтрофного и гетеротрофного синтеза.

Количественный и качественный состав микрофлоры воды также зависит от состава и концентрации минеральных и органических веществ, физико-химического состояния, рН среды, температуры и иных факторов. Так, в водоемах с низким содержанием органических соединений распространены сапрофитные микроорганизмы, не проявляющие требовательности к питательным субстратам. При повышенном содержании органических веществ в воде отмечается бурный рост популяции микроорганизмов, более требовательных к питательным веществам, что стимулирует их потребление простейшими, а это в свою очередь приводит к разрастанию водорослей с последующим явлением «цветения» воды.

В водах пресных водоемов встречаются кокковидные (микрококки), палочковидные (псевдомонады, аэромонады и др.) и извитые бактерии. При загрязнении воды органическими веществами увеличивается число анаэробных (особенно в иле на дне водоема) и аэробных бактерий, а также грибов. При этом микрофлора воды способна выполнять и роль активного фактора в процессе самоочищения воды от органических отходов, утилизирующихся микроорганизмами.

В отличие от тех возбудителей, которые могут находиться в почве, для водных источников характерна другая группа условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. К ним относят возбудителей заболеваний, имеющих водный путь передачи: лептоспироза, туляремии, гепатита А, острых кишечных инфекций (например, дизентерии, брюшного тифа и холеры, которые могут принимать характер водных эпидемий). Загрязнение водоемов данными видами микроорганизмов происходит в результате поступления в них фекально-бытовых сточных вод из прибрежных населенных пунктов, а также сточных вод животноводческих и птицеводческих хозяйств, попадания в воду трупов животных, погибших от различных инфекций. Таким образом, при массивном поступлении фекально-бытовых, а также ливневых и промышленных сточных вод в водоемах отмечается увеличение содержания заносных условно-патогенных и патогенных микробов. При этом, даже если в воде условия для их жизнедеятельности не являются благоприятными, они способны переживать их какое-то время. Сроки выживания во многом зависят от степени интенсивности процессов самоочищения воды и свойств самих микроорганизмов.