Текст книги "Трещина в мироздании"

Но потом меня осенило: у меня был идеальный кандидат – невероятно талантливый и трудолюбивый постдок из Чехии, время стажировки которого в моей лаборатории подходило к концу. Он уже ходил на собеседования на преподавательские должности, однако упомянул, что ищет какую-нибудь новую тему для своего последнего года в Беркли.

Мартин Йинек был прямой противоположностью Блейка. Блейк – душа компании, а Мартин более сдержан и замкнут. Столкнувшись с какой-нибудь трудностью в проведении эксперимента или с незнакомой техникой, Блейк немедленно находил кого-то, кто мог бы ему помочь; Мартин же в таких случаях обращался к книгам и решал проблему самостоятельно – конечно, если он к этому моменту еще не знал решения. Его познания в биологии и биохимии были энциклопедическими, что доказывал не только обширный список его научных публикаций, но и многообразие его научных интересов. И, что важнее всего, – он разбирался в CRISPR. С того самого момента, как он пришел в мою лабораторию, чтобы изучать РНК-интерференцию у человека, он тесно сотрудничал с Блейком и Рэйчел, помогая им завершить несколько проектов, связанных с CRISPR.

Мартин отреагировал с энтузиазмом, когда я рассказала ему об идее сотрудничества с Эммануэль. Он также предложил пригласить в проект Михаэля (Михи) Хаузера, магистранта из Германии, который должен был прибыть в мою лабораторию летом. Я согласилась: лишняя пара рук никогда не помешает. Чем больше я узнавала о загадочном белке, с которым работала Эммануэль, тем больше убеждалась, что в нем было нечто особенное – нечто, что поможет раскрыть самые сложные тайны CRISPR.

Фермент Csn1 называли по-разному, пока летом 2011-го за ним окончательно не закрепилось название Cas9. И хотя уследить за сменами его названия становилось все сложнее по мере того, как я все глубже погружалась в изучение существующей литературы о Cas9, я была уверена в неоспоримой важности этого белка. Работа Родольфа и Филиппа 2007 года показала, что дезактивация гена, кодирующего белок Cas9, нарушает способность S. thermophilus отражать атаки вирусов. Более того, когда Жозиан и Сильвен обнаружили, что геномы фагов разрезаются во время иммунного ответа CRISPR, они также открыли, что дезактивация гена, кодирующего Cas9, не дает CRISPR уничтожить вирусную ДНК. Подобным образом в опытах Эммануэль с S. pyogenes мутации в гене, кодирующем Cas9, приводили к дефектам в выработке молекул РНК CRISPR и в целом вредили работе иммунной системы. Наконец, результаты работы, проведенной Родольфом и Филиппом осенью 2011 года в лаборатории Виргиниюса Шикшниса, предполагали, что cas9 – единственный известный рабочий cas-ген в системе CRISPR S. thermophilus, абсолютно необходимый для противовирусного ответа.

Чем больше я читала об этом, тем яснее становилось, что белок Cas9, скорее всего, играет ключевую роль на том этапе иммунного ответа систем CRISPR II типа, который связан непосредственно с разрушением ДНК. Это белок был совершенно необходим в бактериях рода Streptococcus, однако казалось разумным, что любой критически важный компонент одной из групп систем II типа будет критически важен и для всех других. Однако какую именно роль играл Cas9, еще только предстояло определить.

Мы с Мартином позвонили Эммануэль по скайпу, чтобы начать строить стратегию наших экспериментов с Cas9. Выбрать момент для этого звонка было непросто, и это лишь подчеркивало организационные сложности нашего сотрудничества. Сама Эммануэль находилась в университете Умео в Северной Швеции, в десяти часовых поясах от Калифорнии, а Кшиштоф Чилински, аспирант, отвечавший за проект ее лаборатории по изучению CRISPR, работал в Венском университете (где раньше располагалась лаборатория Эммануэль). В общем, нам предстояло согласовать работу международной команды: французский профессор в Швеции, польский аспирант в Австрии, а в Беркли – немецкий магистрант, чешский постдок и американский профессор.

Когда удобное для всех время было найдено, мы начали в общих чертах обсуждать предстоящий проект. Мы у себя в лаборатории сначала представляли себе движение к цели весьма прямолинейным: нам нужно понять, как выделить и очистить белок Cas9, – чего пока не смогли сделать в лаборатории Эммануэль. Получив белок Cas9, мы могли бы начать биохимические опыты, чтобы узнать, взаимодействует ли Cas9 с РНК CRISPR (мы предполагали, что да), а также понять, что он делает во время противовирусного иммунного ответа.

Кшиштоф, магистрант Эммануэль, прислал нам искусственную хромосому, содержащую ген cas9 из S. pyogenes, а Михи принялся за работу над очищением белка под пристальным контролем Мартина. Сначала Михи помещал синтетическую ДНК в различные штаммы E.coli, а затем, варьируя условия роста и типы питательных сред, последовательно проверил десятки различных параметров, чтобы подобрать протокол, при котором получается максимальное количество белка Cas9 (словно садовник, пробующий различные комбинации почв и удобрений, чтобы определить оптимальные условия для роста нового цветка). Затем с помощью хроматографии (эта технология позаимствована из химии) Михи протестировал различные методы “вскрытия” клеток и отделения Cas9 от других клеточных белков. Наконец, он определил стабильность очищенного белка Cas9. Некоторые белки капризнее других и портятся после одного лишь применения – обычно они слипаются друг с другом и выпадают в осадок, подобно микроскопическим снежинкам, из-за чего совершенно прозрачная пробирка с белковым раствором становится молочного цвета. Другие же молекулы демонстрируют замечательную выносливость – например, их можно неоднократно замораживать и размораживать. Нам повезло: Cas9 относился ко второй категории.

Наконец, пришло время провести первый биохимический опыт. Когда Михи и Мартин выделяли и очищали белок Cas9, мы предположили, что проявление любой связанной с разрезанием ДНК активности, свойственной конкретному белку, зависит от наличия РНК CRISPR. В системах CRISPR I типа, которые изучали в нашей лаборатории, РНК CRISPR собиралась вместе с множеством Cas-белков для формирования машины для соединения с ДНК и ее разрезания. Мы предполагали, что Cas9 может работать с РНК CRISPR подобным образом. В соответствии с этой идеей компьютерный анализ последовательности аминокислот Cas9 показал возможное присутствие не одной, а двух отдельных структур для разрезания нуклеиновых кислот, или нуклеаз, внутри фермента. Возможно, один или оба эти участка были способны резать ДНК фага.

Так как время Михи в лаборатории уже подходило к концу (ему нужно было вернуться в Германию, чтобы доделать диссертацию, и билет на самолет был уже куплен), они с Мартином поставили перед собой задачу выяснить, способен ли очищенный фермент Cas9 разрезать ДНК. Синтезировав рабочую молекулу РНК CRISPR, которую идентифицировала Эммануэль во время работы над S. pyogenes, они смешали РНК CRISPR, белок Cas9 и образец ДНК. Что важно, использованная в экспериментах ДНК содержала последовательность “букв”, совпадающих с последовательностью на одном из концов РНК CRISPR.

Как это часто бывает в науке, этот эксперимент обернулся разочарованием. Никаких изменений в ДНК не наблюдалось; после воздействия Cas9 и комплементарной РНК CRISPR она оставалась точно такой же, как и до этого. Либо Михи не выполнил эксперимент с должной аккуратностью, либо Cas9 все-таки был лишен способности разрезать ДНК. Михи представил результаты сотрудникам лаборатории и в несколько подавленном настроении отправился домой, уверенный, что целое лето, занятое сложной работой по выделению, очищению и изучению Cas9, потрачено впустую.

Пока наше сотрудничество с Кшиштофом и Эммануэль еще только набирало обороты, Мартин курировал работу Михи в лаборатории, но также продолжал поиски вакансии преподавателя. Он проходил собеседования по всему миру – в том числе, например, в Швейцарии (где он в конце концов и станет доцентом в Цюрихском университете). Однако, к счастью для нас, к тому моменту, когда Михи отправился домой, график поездок Мартина тоже стал значительно менее напряженным, поэтому он смог продолжить начатое Михи, полностью сосредоточившись на Cas9 – и на поисках ответа на вопрос, в чем именно заключается функция этого белка.

Работа Михи и Мартина вроде бы показывала, что Cas9 неспособен разрезать ДНК, однако, возможно, что-то было не так с самим экспериментом? Возможностей было множество: от тривиальных (например, белок мог распасться в пробирке) до более сложных (например, мог отсутствовать необходимый компонент реакции). Чтобы проверить эту вторую версию, Мартин и Кшиштоф начали пробовать различные способы проведения эксперимента по разрезанию ДНК. Благодаря очередной забавной случайности, которых полна эта история, они узнали, что выросли практически через границу друг от друга: Кшиштоф – в Польше, а Мартин – в стране, которая тогда называлась Чехословакия. Оба они говорили по-польски, что стало отличным подспорьем для все более частых разговоров по скайпу, в ходе которых они обменивались мыслями о своих экспериментах.

В конце концов Кшиштоф и Мартин провели опыты, где они использовали не только РНК CRISPR, но и второй тип РНК, названный трансактивационной РНК (tracrRNA), который, как обнаружили в лаборатории Эммануэль, был необходим для выработки РНК CRISPR у S. pyogenes. Результат оказался простым, однако он очень много значил для нас: ДНК, в которой 20 “букв” точно совпадали с эквивалентами в молекуле РНК CRISPR, была аккуратно вырезана. Контрольные эксперименты показали, что совпадение последовательностей РНК CRISPR и ДНК необходимо – как и присутствие белка Cas9 и трансактивационной РНК.

В сущности, эти результаты моделировали то, что происходит в клетке во время иммунного ответа CRISPR с минимальным набором компонентов; никаких клеточных молекул, помимо Cas9 и двух молекул РНК, которые выглядели так же, как они выглядят внутри клетки Streptococcus pyogenes. Плюс еще молекула ДНК с такой же последовательностью, как в геноме фага. Более важным казался тот факт, что двадцать этих “букв” ДНК совпадают с “буквами” РНК CRISPR, – это означало, что РНК CRISPR и одна из двух нитей ДНК способны образовать свою собственную двойную спираль путем комплементарного взаимодействия оснований. Такая двойная спираль ДНК – РНК могла быть ключом к специфичности активности Cas9, связанной с разрезанием ДНК.

Наблюдение за реакцией разрезания ДНК в пробирке требовало высокоточного метода регистрации, поскольку увидеть непосредственно факт разрезания ДНК невозможно. Двойная спираль ДНК в 50 “букв” имеет длину всего 17 нанометров, или 17 миллиардных частей метра, а это приблизительно одна тысячная толщины человеческого волоса. Даже самый мощный микроскоп неспособен нам этого показать, поэтому Мартин и Кшиштоф использовали два любимых инструмента биохимиков, изучающих нуклеиновые кислоты: радиоактивный фосфор и гель-электрофорез. В новых опытах к концам молекул ДНК с помощью химических реакций присоединялись атомы радиоактивного фосфора, и в результате эти молекулы начинали светиться на рентгеночувствительной пленке. Затем электрический ток высокого напряжения прогонял все эти молекулы ДНК через большой брусок желеобразного материала, который работал как молекулярное сито, сортирующее молекулы по размеру. После просвечивания геля рентгеновским излучением на нем становились видны участки (полосы) сигнала, в том случае если ДНК была разрезана Cas9: одна полоса от полноразмерной ДНК и другая – от ДНК, поделенной на два фрагмента.

Cas9 разрезает молекулу ДНК на два фрагмента

В дальнейшем Мартин показал, что обе нити ДНК разрезаются белком Cas9 в одном и том же месте относительно РНК CRISPR. Что важно, РНК CRISPR и молекулы трансактивационной РНК оставались неизменными на протяжении эксперимента и потому могли быть использованы белком Cas9 повторно для определения последовательности ДНК, подлежащей разрезанию.

Проанализировав эти результаты, мы поняли, что у нас есть ключевые компоненты машины, разрезающей ДНК, – механизма, позволяющего S. pyogenes и S. thermophilus (и любой другой бактерии со сходным типом системы CRISPR) не только находить определенные последовательности ДНК фагов, но и уничтожать их. Необходимыми компонентами для разрезания ДНК были фермент Cas9, РНК CRISPR и трансактивационная РНК.

Я ликовала, когда мы получили эти результаты, но при этом меня волновало множество новых вопросов, ответы на которые нам хотелось узнать как можно скорее. Чтобы понять, за счет чего конкретно фермент Cas9 способен разрезать ДНК “по наводке” РНК, нам нужно было определить, какой участок белка обеспечивает его режущую функцию. Чтобы доказать, что разрезание ДНК специфично и требует совпадения между РНК CRISPR и последовательностью ДНК, нам нужно было изменять последовательность ДНК “буква” за “буквой” и показать, что разрезания не происходит, если последовательности РНК и ДНК совпадают не полностью. А чтобы выявить, каким образом работают молекулы РНК CRISPR и трансактивационной РНК, нам предстояло методически убирать разные фрагменты каждой из молекул и определять, без каких из них невозможно обойтись.

Мартин и Кшиштоф работали над решением этих вопросов не покладая рук, и вскоре стала вырисовываться удивительная картина: Cas9 может присоединяться к двойной спирали ДНК, разделять две нити для формирования новой спирали между РНК CRISPR и одной из нитей ДНК, а затем использовать две структуры с нуклеазной активностью, чтобы одновременно разрезать обе нити ДНК, создавая двуцепочечный разрыв. В зависимости от последовательности связанной с ним молекулы РНК Cas9 нацеливается практически на любую произвольную последовательность ДНК и разрезает ее. По сути, молекула РНК CRISPR действует подобно набору GPS-координат, точно наводя Cas9 на нужное место в длинной молекуле ДНК в соответствии с совпадением “букв” РНК CRISPR и ДНК. Это по-настоящему программируемая нуклеаза, которая могла бы нацеливаться на любую произвольную последовательность ДНК, используя все те же правила спаривания оснований – А с Т, Г с Ц и так далее. Для любой двадцатибуквенной последовательности, которую содержит РНК-проводник, Cas9 находит подходящую пару в ДНК и затем разрезает ее.

Функция Cas9 в битве между бактериями и вирусами теперь казалась совершенно объяснимой. Снабженный запасом молекул РНК, взятых из массива CRISPR, в котором были собраны кусочки ДНК фагов, Cas9 можно мгновенно перепрограммировать на разрезание соответствующих участков вирусных геномов. Он оказался совершенным бактериальным оружием: снаряд, который умеет находить вирусы, а потом поражать цель – быстро и с невероятной точностью.

Получив результаты работы Мартина и Кшиштофа, мы были готовы заняться следующим вопросом: если бактерия могла запрограммировать Cas9 на разрезание специфических последовательностей ДНК вирусов, можем ли мы, как и предполагали раньше, запрограммировать Cas9 на разрезание других последовательностей ДНК, не обязательно вирусных? Мы с Мартином были хорошо осведомлены о достижениях в области редактирования генома и о возможных перспективах – а также существенных ограничениях – программируемых нуклеаз на основе ZFN и TALEN. Мы осознавали – и были поражены этим, – что обнаружили систему, на основе которой можно построить самый простой метод редактирования генома из всех, что были открыты и разработаны до сих пор.

Но чтобы превратить эту крошечную молекулярную машину в мощный инструмент редактирования генома, предстояло сделать еще один шаг. К тому времени мы уже разобрали сложный иммунный ответ на простые части, которые можно разделять, изменять и комбинировать по-разному. Более того, тщательно проведя биохимические эксперименты, мы установили молекулярные правила, управляющие функциями этих различных частей. Теперь же мы хотели удостовериться, что можем видоизменять Cas9 и молекулы РНК для нацеливания на любую выбранную последовательность ДНК и для ее уничтожения. Если сможем – значит, CRISPR поистине мощный инструмент.

Процесс программирования машины CRISPR-Cas9 на самом деле состоял из двух этапов: из проработки идеи и собственно эксперимента. Сначала, конечно, идея. Мартин со своей обычной дотошностью методично модифицировал обе молекулы РНК – молекулу РНК CRISPR, отвечающую за наведение на цель, и молекулу трансактивационной РНК, которая удерживает вместе молекулы РНК CRISPR и Cas9 (с тем чтобы определить, каким образом каждая “буква” каждой РНК влияет на ее функции). На основе этой информации мы с Мартином придумали способ слить две молекулы РНК в одну. Если соединить конец одной молекулы с началом другой, то итоговая гибридная РНК – если она вообще окажется работоспособной – поможет нам упростить машину для нарезки ДНК, которую мы программируем: нам не придется добавлять к Cas9 две молекулы РНК – гида (РНК CRISPR) и помощника (трансактивационную РНК). Вместо этого мы сможем использовать фермент в сцепке с единственной молекулой РНК – РНК-гидом, который выполнял бы обе задачи. Снижение сложности системы сильно повысило бы удобство ее применения.

Мы продумали эксперимент в соответствии с этой идеей. Нам нужно было проверить, может ли одна эта гибридная молекула РНК все так же направлять Cas9 к подходящей последовательности ДНК для разрезания последней. Также наш эксперимент должен был показать, действительно ли Cas9 можно запрограммировать на разрезание любой желаемой последовательности ДНК (как мы предполагали), а не только тех последовательностей ДНК фагов, которые были естественным путем отобраны системой CRISPR в ходе эволюции бактерий.

Исходя скорее из удобства, чем какого-либо предпочтения, – мы понимали, что совершили серьезный прорыв, и не хотели откладывать эксперимент из-за того, что под рукой нет подходящего гена, – мы решили использовать ген медузы, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein, GFP). Этот белок широко используется в лабораториях по всему миру для визуализации клеток и белков в их составе и стал настолько важным биотехнологическим инструментом, что в 2008 году принес группе ученых: Мартину Чалфи, Осаму Симомуре и Роджеру Тсиену – Нобелевскую премию по химии. Мартин Йинек выбрал пять различных последовательностей длиной в двадцать “букв” внутри гена-мишени и затем создал пять гибридных молекул РНК, точно совпадающих с ними. Как только гибридные РНК-гиды были готовы, мы использовали их вместе с Cas9 и ДНК медузы в уже привычном для нас опыте по разрезанию ДНК и стали ждать результатов.

Когда Мартин показал мне результаты эксперимента с GFP на одном из лабораторных компьютеров, рентгенограмма на экране монитора выглядела замечательно. Все ДНК GFP были разрезаны в заданных местах. Каждая гибридная молекула РНК сработала именно так, как нужно, выбрав именно тот участок ДНК медузы, который мы хотели надрезать и в паре с Cas9 разбить ее именно в том месте.

Программируемая нарезка ДНК посредством CRISPR-Cas9

Мы сделали это. За короткое время мы создали и протестировали новую технологию, которая, основываясь на исследованиях белков ZFN и TALEN, давала возможность редактировать геном – любой геном, а не только геномы бактериофагов. Из этой пятой системы вооружения бактерий мы сделали средство для переписывания кода жизни.

В тот вечер, пока я стояла у плиты и готовила ужин, в моей голове танцевали видения этой крошечной машины: Cas9 и его направляющая РНК, снующие по бактериальной клетке, охотящиеся на комплементарные последовательности ДНК. Внезапно я осознала, что громко смеюсь. Как же невероятно, что эта бактерия нашла способ запрограммировать для себя белок, сделав из него воина для поиска и уничтожения вирусной ДНК! И как же здорово, какое это фантастическое везение, что мы смогли приспособить этот фундаментальный механизм для совершенно других нужд. Это было удивительное время чистого наслаждения, наслаждения от открытия – такого же чувства, какое я испытала в лаборатории доктора Хеммеса много лет назад.

В июне 2012 года Эммануэль и Кшиштоф прилетели в Беркли на конференцию, благодаря чему у нас с Мартином появился шанс снова увидеться с ними лично. Учитывая, какой путь мы проделали вместе как ученые, было удивительно, что наше общение до того момента было почти полностью виртуальным. После бесчисленных телефонных звонков, бесед по скайпу и обмена электронными письмами мы все сидели в моем кабинете в Беркли, поражаясь результатам нашего недолгого, но интенсивного сотрудничества.

Эммануэль и Кшиштоф прибыли в Калифорнию на пятую ежегодную конференцию, посвященную CRISPR, – мероприятие, которое в 2012 году собрало исследователей из двадцати – тридцати лабораторий. Большинство этих ученых специализировались на науке о продуктах питания и микробиологии. CRISPR пока что еще не привлекал особенного внимания более широкого научного сообщества; за предшествующее десятилетие было опубликовано лишь около двухсот научных статей с упоминанием этой системы. Но мы знали, что скоро все изменится.

Время конференции не могло быть выбрано лучше – или хуже. С одной стороны, мы могли сравнить нашу работу с работами коллег. С другой стороны, предшествующие несколько недель были невероятно, до исступления бурными, и все мы хотели отдохнуть.

После эксперимента с GFP мы решили завершить проект как можно быстрее и опубликовать научную статью по его итогам. Еще до того, как Мартин и Кшиштоф закончили свои опыты, а наши зарубежные коллабораторы стали готовиться к поездке в Беркли, мы с Эммануэль начали писать ее.

Главной темой статьи было объяснение механизма работы CRISPR для противовирусной защиты у S. pyogenes, но мы также хотели отметить некоторые важные следствия из наших результатов. В аннотацию к статье мы включили упоминание того, что программируемый фермент, разрезающий ДНК, может быть использован для редактирования генома. Вдобавок мы завершили статью коротким, но значимым очерком возможных областей применения CRISPR не только в бактериях, но и в других типах клеток. Упомянув ZFN и TALEN, мы в заключение написали следующее:

Мы предлагаем альтернативный метод, основанный на программируемом с помощью РНК ферменте Cas9, который может представлять значительный потенциал для применения в сферах направленного воздействия на гены и редактирования генома[78]78
  M. Jinek et al., “A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity”, Science 337 (2012): 816–821.


[Закрыть].

Сидя за компьютером в солнечную пятницу восьмого июня 2012 года, я нажала на кнопку “Подтвердить” в форме для представления статей на рассмотрение в журнал Science. Ее опубликуют всего двадцать дней спустя, 28 июня, и после этого уже ничто не будет прежним – ни для меня, ни для моих соратников, ни для биологической науки. В тот момент, однако, мое восхищение этим знаковым моментом было приглушено. Я была измотана, как никогда в жизни.

У меня появилось ощущение, что я сидела за столом много недель, поэтому я поднялась и – в некотором оцепенении – вышла из Стэнли-холла в полный зелени кампус Беркли. Лужайка вокруг круглого бассейна перед нашим зданием была подозрительно пустой. Весенний семестр закончился уже почти месяц назад; в кампусе, обычно бурлящем жизнью, было пугающе тихо.

И это, как я теперь понимаю, было затишье перед бурей.