Текст книги "Возможно ли преодолеть старение? Сегодня и завтра клеточной терапии"

Возможно ли преодолеть старение?
Сегодня и завтра клеточной терапии
Леонид Юрьевич Прохоров

© Леонид Юрьевич Прохоров, 2024

ISBN 978-5-0051-6258-8

Создано в интеллектуальной издательской системе Ridero

Р е ц е н з е нт ы:

Виталий Иванович Донцов, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник Федерального информационного центра «Информатика и управление», лаборатории «Системный анализ и информационные технологии в медицине и экологии» РАН;

Александр Александрович Згурский, кандидат биологических наук, генеральный директор ООО «Медбиокор».

В книге кандидата биологических наук Л. Ю. Прохорова описываются методы современной клеточной биологии, которые могут применяться для омоложения кожи, других тканей и органов человека с использованием его собственных клеток. Кратко рассматриваются внешние проявления старения, характеристика кожи человека и причины ее старения, методика получения и культивирования аутогенных (собственных) фибробластов кожи, процедура клеточной терапии, результаты применения аутогенных фибробластов. Показана необходимость долговременного хранения клеток в замороженном виде при низкой температуре (-196ºС) в жидком азоте. Предполагается, что в дальнейшем клеточная терапия сможет применяться не только для омоложения кожи, но и для восстановления старых или больных органов человека, что позволит существенно увеличить продолжительность его жизни.

Также рассматриваются некоторые усовершенствования клеточной технологии, которые при реализации помогут существенно улучшить омоложение кожного покрова человека, а также других тканей и органов.

Книга предназначена для широкого круга читателей, в том числе студентов, аспирантов, научных работников биологических и медицинских ВУЗов, а также для всех, интересующихся вопросами старения и омоложения.

Ключевые слова: продолжительность жизни, омоложение, клеточная терапия, искусственные органы, теломераза, ген теломеразы, старые клетки, молодые клетки.

ВВЕДЕНИЕ

Одна из основных актуальных проблем человечества – это старость и связанные с ней проблемы: старческие болезни, ухудшение внешнего вида, атеросклероз, слабоумие, канцерогенез, ишемическая болезнь, инфаркт миокарда и т. д. Что же делать? Ответ очень прост: надо всегда оставаться молодым, периодически делать омоложение стареющего организма и тогда не будет тех проблем, которые перечислены выше. Для большинства людей это фантастика, однако, уже сейчас есть методы, которые позволяют омолаживать кожу. На очереди омоложение других тканей и органов. Установлено, что число живых, работающих и способных к делению клеток с возрастом постоянно уменьшается (Стрелер, 1964). Отмершие клетки замещаются соединительной тканью. Соединительная ткань играет большую роль в процессе старения организма. В некоторых стареющих органах умершие специализированные клетки замещаются на клетки соединительной ткани, неспособные выполнять функции данного органа. Например, кардиомиоциты (мышечные клетки сердца) при их гибели в результате инфаркта могут замещаться фибробластами, образуя рубец, который лишен способности сокращаться.

Следовательно, важно заменять старые или погибшие клетки на молодые, полноценно функционирующие.

Другая задача – это устранение старой соединительной ткани и замена ее на молодую. Применение того и другого метода в комплексе может дать максимальный эффект.

Частная задача, которая уже решается сегодня – омоложение кожи. Для омоложения кожи, устранения морщин, рубцов после операций, угрей в настоящее время уже разработаны методы, которые дают однозначно положительный результат. Об этом и некоторых других темах, связанных с омоложением тканей и органов человека, будет идти речь в данной публикации.

ВНЕШНИЕ И ВНУТРЕННИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ СТАРЕНИЯ ЧЕЛОВЕКА

С возрастом изменяются общие размеры, форма и состав тела, мягкие части лица и кожный покров, изменяется костная система.

► Изменение кожи начинается обычно после 40 лет, особенно это заметно на структуре верхнего (эпидермального) слоя, который утончается и уплощается. К 80 годам его толщина на 25% меньше, чем в 30 лет. Сглаживается рельеф кожного рисунка на ладонях, подошвах и пальцах рук и ног. Изменения затрагивают сосочковый слой собственно кожи (дермы), который также становится более тонким. Постепенно атрофируется подкожная жировая клетчатка, которая у долгожителей со временем может исчезнуть совсем. На коже появляются коричневые пигментные пятна, что характерно для тыльной стороны кистей, плеч, груди и т. д. (Хрисанфова, 1999).

По другим данным, видимое старение кожи проявляется уже с 25-летнего возраста, когда начинает истончаться подкожная жировая ткань, снижается эластичность коллагеновых структур (Руководство по геронтологии, 2005).

Из-за уменьшения числа потовых и сальных желез кожа становится более сухой, утрачивается ее эластичность. У мужчин понижение салоотделения происходит позже, чем у женщин. Наиболее наглядными признаками старения являются морщины. С возрастом появляются множественные морщины на коже, особенно на открытых участках, таких как лицо, например, так называемые «гусиные лапки» у наружного угла глаза. На рис. 1 приведена фотография пожилой европейской женщины, а на рис.2, для сравнения, – фотография молодой женщины. Лицо стареет быстрее, чем другие части тела (Хрисанфова, 1999). Объясняется это тем, что лицо больше подвержено атмосферным воздействиям, в том числе солнечному свету, по сравнению с другими частями тела.

Старение под воздействием солнечного света принято называть фотостарением, так как солнечный свет ускоряет старение кожи. Особенно влияет на этот процесс ультрафиолетовое излучение, входящее в состав солнечного спектра (Молочков и др., 2005). Ускоряют старение кожи также ветер, пыль, сухость, микроорганизмы, компоненты моющих средств и т. д.

Температура кожи снижается, особенно у долгожителей. Это объясняется общим понижением обменных процессов, но отчасти связано и с ухудшением кровоснабжения и изменениями в потовых железах. Из-за уменьшения их числа ослабляется выделительная функция кожи (Хрисанфова, 1999).

►  Значительные изменения претерпевает и волосяной покров. Начиная уже с 30 лет, уменьшается количество волос на коже (точнее их плотность – число волос на единице поверхности), они седеют, то есть перестают окрашиваться пигментом. Одной из причин поседения считается то, что клетки волосяных луковиц (меланоциты) теряют способность образовывать красящий пигмент. Однако, предполагается, что возможна еще и другая причина – нарушение процесса переноса пигмента от меланоцитов к растущему волосу (Прохоров, 2015б). Хотя рост волос снижается, у пожилых женщин нередко появляются волосы на лице (на верхней губе и на подбородке). В то же время волосы на теле, на конечностях и в области бровей после 60 лет могут исчезать.

► Ухудшается костная система, увеличивается кривизна позвоночника; уплощаются межпозвонковые диски и хрящ суставных поверхностей костей. Постоянным признаком старения в возрасте старше 45—50 лет является разрежение костной ткани — остеопороз.

► С возрастом изменяются общие размеры, форма и состав тела, мягкие части лица.

► Уменьшается рост человека. По некоторым данным, после 60 лет рост мужчин и женщин уменьшается в среднем на 0,5—1 см за пятилетие. Это происходит из-за уплощения межпозвонковых дисков и увеличения сутулости.

► Изменяется соотношение компонентов тела – мускульного и жирового. Количество мышечной ткани максимально в 20—30 лет, затем начинается вначале слабое, а затем нарастающее ее снижение, особенно после 50 лет. В связи с этим происходит и снижение мышечной силы, примерно к 70—80 годам силовые показатели уменьшаются приблизительно в два раза. Уменьшается подкожный жировой слой и увеличивается объем внутреннего жира в брюшной области.

► Старение нервной системы проявляется многообразно. Это касается как центральной нервной системы (мозга), так и периферической нервной системы. Старение проявляется в функциональных и психологических изменениях, отражающихся на умственной и физической работоспособности, памяти, эмоциях, сложных поведенческих реакциях и других сторонах жизнедеятельности. Структурно старение выражается, прежде всего, в уменьшении количества нервных клеток – нейронов. Хотя некоторое снижение может происходить уже вскоре после рождения, заметная их потеря отмечается довольно поздно, начиная с 50—60 лет, и происходит неравномерно в разных зонах головного мозга. Утрата нейронов в коре головного мозга старых людей может достигать 40—50% и более. В старости снижаются плотность расположения и размеры нейронов, в них откладывается пигмент. Возрастные явления отмечаются также в спинном мозге и периферической нервной системе, наблюдаются они и во всех звеньях вегетативной нервной системы (Хрисанфова, 1999).

► При старении ухудшаются состояние и функции других систем, тканей и органов организма, в том числе органы чувств, сердечно-сосудистая, вегетативная и иммунная системы, пищеварительные органы, органы эндокринной системы и др. (Руководство по геронтологии, 2005).

Сейчас уже можно однозначно утверждать, что старческие изменения не могут быть полностью устранены диетами, голоданием, настоями трав, лекарствами, витаминами или препаратами, физическими упражнениями и тому подобным.

Как же можно остановить старение? В следующих разделах будет описано, что первый шаг уже сделан и это – клеточная терапия кожного покрова собственными клетками. Следующие шаги будут направлены на совершенствование такой методики и на распространение ее на другие ткани, системы и органы человека.

ХАРАКТЕРИСТИКА КОЖИ ЧЕЛОВЕКА И ПРИЧИНЫ ЕЕ СТАРЕНИЯ

Основными клеточными элементами соединительной ткани являются фибробласты. Фибробласты – это клетки мезенхимального происхождения, круглой или удлиненной, веретенообразной плоской формы с отростками и овальным ядром (Рис. 3). Состояние и функция основных внеклеточных компонентов соединительной ткани, коллагеновых, эластических и ретикулярных волокон и межклеточного матрикса зависят от функциональной активности фибробластов. В результате дифференцировки фибробласты превращаются в менее активные зрелые клетки – фиброциты.

Фибробласты являются основными клетками среднего соединительнотканного слоя кожи, называемого дермой (Рис. 4, 5). Основная функция фибробластов дермального слоя кожи – участие в метаболизме клеточного вещества. Фибробласты кожи синтезируют и выделяют в окружающую среду большое количество биологически активных веществ, среди которых можно выделить различные факторы роста, компоненты внеклеточного матрикса и ферменты. Этот процесс происходит непрерывно, и благодаря ему межклеточное вещество постоянно обновляется. Особенно интенсивно протекает метаболизм гиалуроновой кислоты (Крихели и др., 2004). Как и во всех органах и тканях человеческого организма, в коже происходят возрастные изменения в течение жизни.

В стареющей коже уменьшается толщина дермы, содержание влаги в ней падает, в результате кожа теряет упругость и эластичность. Следствием этого является образование морщин. Старение кожи на различных участках тела протекает неравномерно. Особенно быстро стареют открытые участки кожи. Причина этого, как описывалось выше, – фотостарение (облучение солнечным светом), а также атмосферные воздействия. В то же время на закрытых областях возрастные изменения кожи менее выражены.

Существует мнение, что одной из основных причин старения кожи является снижение способности фибробластов кожи к делению (размножению) с возрастом. В результате этого процесса количество живых фибробластов в коже уменьшается, и они становятся менее активны. Следовательно, если каким-либо образом стимулировать пролиферативную и синтетическую активность фибробластов, то можно улучшить состояние кожи (Крихели и др., 2004).

Кроме того, в коже уменьшается количество коллагеновых волокон и снижается их гидратируемость, они утрачивают способность к разбуханию и становятся ригидными, в результате уменьшается тургор, происходит образование морщин. Одновременно кожа теряет липиды, нарушается ее защитная мантия, она становится легко ранимой, шелушится (Руководство по геронтологии, 2005).

Так как количество и активность фибробластов снижается, оставшиеся не могут компенсировать происходящие старческие изменения кожи. Поэтому, если увеличить число молодых активных клеток – фибробластов в коже, то логично ждать улучшения ее состояния вследствие того, что фибробласты будут вырабатывать молодой коллаген и эластин, а это повысит упругость кожи, ее тургор, в результате чего морщины разгладятся.

МЕТОДЫ ОМОЛОЖЕНИЯ КОЖИ

Для коррекции возрастных изменений кожных покровов в настоящее время используются самые разнообразные методы (пилинги, шлифовка, лифтинг и др.) и препараты (токсин ботулизма, компоненты внеклеточного матрикса и соединительной ткани и т.д.). Многие из этих методов направлены на стимуляцию собственных клеток кожи, в частности, фибробластов. Однако можно решить проблему и другим образом – увеличить количество фибробластов в коже с помощью их пересадки в те места, где это необходимо.

Прежде чем пересадки фибробластов стали реальностью, исследователям пришлось решать много методических вопросов, в том числе вопросы безопасности подобных процедур.

Значительный прогресс в этом направлении был достигнут, когда исследователи научились культивировать, т. е. поддерживать жизнеспособность фибробластов вне организма, или другими словами in vitro. В 1961 г. L. Hayflick и P. S. Moorhead (Hayflick, Moorhead, 1961) представили данные о том, что даже в оптимальных условиях культивирования in vitro фибробласты эмбриона человека способны делиться только ограниченное число раз (50 ± 10). В последующих исследованиях это наблюдение было многократно воспроизведено. Последняя фаза жизни клеток в культуре была определена как клеточное старение, а сам феномен получил по имени автора название лимит Хейфлика.

После установления лимита Хейфлика в результате многочисленных исследований было выявлено, что нормальные фибробласты в культуре сохраняют диплоидный кариотип и имеют ограниченную продолжительность жизни. Кроме того, у нормальных клеток отсутствуют онкогенные потенции. Эти требования к культурам нормальных клеток были оформлены в виде нормативных документов.

При соблюдении этих требований появилась возможность использования культивируемых вне организма фибробластов человека для производства иммунобиологических медицинских препаратов, а затем и для терапевтических целей. Научные исследования и клинические разработки в данном направлении протекают очень интенсивно, что связано с общим подъемом клеточных технологий на основе стволовых клеток.

В настоящее время можно выделить два основных подхода к лечению кожи с помощью препаратов, содержащих живые фибробласты. С одной стороны, широкую известность получили методики и препараты для лечения дефектов кожи раневого и ожогового характера с помощью культур аллогенных (другого организма) эмбриональных фибробластов. Альтернативой этим методикам является возможность использования аутогенных (собственных) фибробластов человека для заместительной клеточной терапии кожных покровов (Згурский, 2004).

Считается, что наилучшие результаты клеточной терапии получаются при использовании культур эмбриональных фибробластов, которые имеют больший пролиферативный потенциал по сравнению с культурами от взрослых доноров. Однако, применение клеток, полученных из эмбрионов, имеет ряд ограничений, в том числе этического характера. В то же время накапливаются данные, что собственные фибробласты сохраняют свой потенциал при старении, несмотря на уменьшение их числа в стареющем организме (Терехов, 1984; Згурский, Прохоров, 2020).

Для достижения первичных результатов необходимо получить культуры фибробластов от взрослых доноров. Было установлено, что пролиферативные способности полученных фибробластов по сравнению с эмбриональными кожными фибробластами вполне достаточны, чтобы использовать их для клеточной терапии (Згурский, 2004).

Методика получения и культивирования аутогенных фибробластов кожи

Клеточный материал для получения культуры аутогенных фибробластов берут путем биопсии кожи (срез небольшого участка кожи размером примерно 0,5 см²) пациента в области предплечья или в заушной области при местной анестезии.

Получение и культивирование фибробластов из биоптата кожи проводят по стандартной методике. Для получения первичной культуры клеток ткань промывают физиологическим раствором, содержащим антибиотики, помещают в стерильную чашку Петри и обрабатывают раствором, содержащим трипсин или коллагеназу (оба ферменты). Под действием раствора ткань размягчается и из нее на дно чашки выходят живые клетки (фибробласты). Затем в чашку заливают питательную ростовую среду (см. ниже) и помещают в СО₂-инкубатор (специальный плотно закрывающийся шкаф, в котором поддерживается постоянная температура 37⁰С и повышенная концентрация (5—7%) углекислого газа в воздухе (Рис. 6); обычная концентрация СО₂ в атмосфере 0,03—0,04%, при которой фибробласты расти не могут. Клетки начинают размножаться и после заполнения всей чашки фибробластами их снимают с ростовой поверхности смесью растворов Версена (раствор ЭДТА – этилен диамин тетрауксусной кислоты и неорганических солей) и трипсина. Клетки первичной культуры центрифугируют, отмывают от компонентов раствора и суспендируют в среде культивирования.

Далее клетки переносят в культуральные флаконы (Рис. 7а и 7б), содержащие питательную ростовую среду. Ростовая среда содержит набор аминокислот, глюкозу и др. питательные вещества для клеток и 10—20% эмбриональной телячьей сыворотки (плазма крови), содержащей необходимые ростовые факторы, обеспечивающие деление клеток. Сами флаконы помещают в СО₂-инкубатор. Флаконы закрывают не плотно, а так, чтобы воздух с повышенным содержанием углекислого газа из инкубатора мог поступать внутрь флаконов. Можно использовать также флаконы с вентилируемыми крышками (с встроенным стерильным фильтром) через которые предусмотрен воздухообмен с воздухом в инкубаторе. Этим способом обеспечиваются условия для роста (деления) клеток.

Все работы проводятся в строго стерильных условиях в ламинарном шкафу (Рис. 8а и 8б), в который вентилятором через стерилизующий воздушный фильтр, расположенный сзади или сверху шкафа, под небольшим давлением нагнетается стерильный (очищенный от бактерий) воздух. За счет избыточного давления внутри ламинарного шкафа внешний воздух с бактериями внутрь не проникает, поэтому культуры клеток остаются стерильными. Работа внутри шкафа осуществляется высококвалифицированным специалистом с использованием стерильной лабораторной посуды, в том числе флаконов, пипеток, чашек Петри и др. Дополнительная стерильность осуществляется за счет обжига поверхностей посуды (горлышка флаконов, рабочих частей пипеток) в пламени спиртовой или газовой горелки, которая установлена внутри ламинарного шкафа и включена постоянно в течение всего времени работы с биологическим материалом. Сам специалист находится вне шкафа, но все действия осуществляет руками в стерильных хирургических перчатках внутри ламинарного шкафа через открытую нишу, из которой постоянно выходит стерильный воздух, не позволяющий поступать внутрь нестерильному воздуху (с бактериями) извне.

Полученные от пациентов культуры клеток используют для наработки необходимого количества клеток, достаточного для процедур (6—8 пассажей или делений клеток в культуре). Далее фибробласты тестируются на отсутствие контаминации (заражения) ВИЧ, гепатитов А, В и С, микоплазмы и хламидий. Тестирование проводится при помощи ПЦР (полимеразная цепная реакция) и иммуноферментными методами. Отсутствие онкогенных потенций клеток определяют на бестимусных (без иммунитета) мышах. Далее монослойные культуры клеток снимают с поверхности флаконов смесью растворов Версена и трипсина и суспендируют (перемешивают) с применением серологических пипеток в стерильном физиологическом растворе для инъекций. Затем 2—3 раза центрифугируют и отмывают клетки от Версена и трипсина в таком же физрастворе. Готовые суспензии сохраняют при +4⁰С. Препараты клеток используют в течение 24 часов после получения суспензии.

Жизнеспособность клеток в суспензии определяют с помощью высевания суспензионной культуры через различные сроки инкубации и подсчета количества прикрепившихся клеток, по их способности к образованию колоний.