Текст книги "Репликация ДНК: учебное пособие"

6.5. Координация ядерных и цитоплазматических процессов во время клеточного цикла

Важным вопросом регуляции клеточного цикла является то, каким образом Cdks координируют ядерные и цитоплазматические функции клетки. В частности, эти белки гораздо менее статичны, чем было принято думать раньше, основыввясь на результатах их иммунофлуоресцентного окрашивания. К примеру, Cdks комплексы циклинов Е и А на препаратах фиксированных клеток имеют преимущественно ядерную локализацию. В тоже время анализ живых клеток показал, что эти комплексы постоянно перемещаются между цитоплазмой и ядром. Такое челночное перемещение позволяет им фосфорилировать одновременно ядерные и цитоплазматические субстраты и, вероятно, позволяет им самим быть доступными для белков-регуляторов, расположенных в различных клеточных компартментах. Такое постоянное перемещение представляется одним из важнейших свойств Cdks.

Глава 7. Пострепликативные модификации ДНК

7.1. Метилирование ДНК

Кроме того, что ДНК связана с различными белками, она также подвергается и энзиматическим модификациям, в первую очередь – метилированию. Нити образовавшихся при репликации молекул ДНК в течение какого-то периода времени различаются между собой: материнская нить метилирована, а дочерняя – нет. Процесс репликации ДНК сопровождается обязательным последующим метилированием дочерней ДНК. Несмотря на изучение энзиматического метилирования эукариот более 50 лет, мы еще далеки от всестороннего понимания функциональной роли этой модификации генома. При ее изучении был обнаружен СрG-тип метилирования ДНК животных и растений и СрNрG-тип (N – любой нуклеозид) метилирования ДНК высших растений.

Современный этап исследований энзиматического метилирования ДНК эукариот связан с революционными достижениями современной биологии в области молекулярной генетики, секвенирования метилированных ДНК, а также с выделением и исследованием самих ДНК-метилтрансфераз (ДНК-метилаз). В настоящее время установлено участие энзиматического метилирования ДНК эукариотических организмов в регуляции транскрипции генов, клеточной дифференцировке и эмбриональном развитии, эпигенетическом контроле геномного импринтинга и инактивации мобильных генетических элементов. Оно обнаружено как у млекопитающих, так и у высших растений. Нарушение нормальной картины метилирования ДНК сопровождает канцерогенез и генетические заболевания человека. Существенные успехи в исследовании функций метилирования ДНК достигнуты после открытия белков, связывающихся с метилированными СрG – последовательностями ДНК и мобилизующих в эти участки гистоновые деацетилазы, которые формируют транскрипционно неактивную структуру хроматина. В этом смысле «метилирование встречает ацетилирование», т. е. метилирование ДНК и деацетилирование гистонов могут быть прочно сопряжены с формированием нетранскрибируемой структуры хроматина.

В структурно-функциональном исследовании энзиматического метилирования эукариотических ДНК существует значительный пробел, обусловленный изучением только СрG-типа этой модификации. В настоящее время выясняется связь других сайт-специфических типов метилирования эукариотических ДНК с разными генетическими функциями. Анализ же картины метилирования целого эукариотического генома, на фоне которого развиваются нормальные и нарушенные процессы жизнедеятельности клетки, позволит понять функциональное значение этих типов метилирования ДНК и определить роль индивидуальных ДНК-метилаз в специфических генетических процессах.

Цитозин(С5) – ДНК-метилтрансферазы катализируют перенос метальной группы с 3-аденозилметионина на остатки цитозина в специфических последовательностях двунитевой ДНК с образованием 5-метилцитозина и 5-аденозилгомоцистеина. Эта реакция необратима. Сравнительный анализ первичных структур прокариотических и эукариотических ДНК-метилаз позволяет отнести их к одному классу ферментов, имеющих одинаковую структуру каталитического домена. Все эти ферменты являются мономерными белками и отличаются присутствием в их структуре ряда консервативных гомологичных областей (мотивов), детерминирующих специфические ферментативные функции. В структуре большинства цитозин(С5) – ДНК-метилтрансфераз присутствует до 10 консервативных участков, расположенных в строго определенной последовательности. В результате сравнения первичных структур цитозин(С5) – ДНК-метилтрансфераз обнаружена связь каталитической функции этих ферментов с их консервативными мотивами, в то время как функция сайт-специфического узнавания связана с вариабельным участком TRD (target – recognizing domain). Анализ аминокислотных последовательностей цитозин(С5) – ДНК-метилтрансфераз выявляет среди 10 консервативных блоков аминокислот четыре мотива с умеренной гомологией (II, III, V и VII), которые могут отсутствовать у некоторых ферментов, и шесть мотивов с высокой степенью гомологии (I, IV, VI, VIII, IX и X). Между VIII и IX мотивами расположена вариабельная область ТRD, существенно различающаяся у сайт-специфических метилтрансфераз по ее аминокислотной последовательности и длине. Таким образом, консервативные мотивы ответственны за осуществление обшей для всех метилтрансфераз функции каталитического переноса метильной группы с молекулы 5-аденозилметионина на ДНК, в то время как вариабельная область ТRD определяет узнавание специфической последовательности ДНК и метилирование в ней гетероциклического основания. Схема структуры Dnmt1 приведена на рис. 34.

Рис. 34.Структура Dnmt1 – семейства ДН К-метилтрансфераз.

На рис. 34 видно, что N– и С-концевые домены белка разделены G-К-повторами. Римскими цифрами обозначены основные консервативные мотивы С-концевого каталитического домена. В N-концевом регуляторном домене отмечены функциональные последовательности, определяющие связывание ядерного антигена пролиферируюших клеток (РСNА), сигнал ядерной локализации (NLS), нацеливание белка в точки репликации ДНК (ТRF), связывание с ионами Zn²⁺ (Суs-rich), гомологию с полибромо-1-белком (РВНD). Меt(s))и Меt(о) показывают N-концевые положения соответственно соматической и ооцит-специфической форм белка.

Эукариотические ДНК-металазы осуществляют метилирование цитозина в полуметилированной реплицирующейся ДНК в симметричных последовательностях СрG и СрNpG. Это соответствует полуконсервативному (как и синтез ДНК) типу наследования картины метилирования родительской ДНК, называемое поддерживающим метилированием, а также метилирование полностью неметилированных последовательностей ДНК, называемое метилированием dе поvо.

Структурно-функциональное исследование генов эукариотических ДНК-метилаз началось значительно позднее аналогичных исследований у прокариот. Впервые кДНК гена DNMT1 (DNA-metyl-transpherase 1), кодирующего полноразмерный ген мышиной ДНК-метилазы, была клонирована в 1988 г. Это белок, состоящий из 1620 аминокислотных остатков с молекулярной массой 190 кДа, проявляющий оптимальную метилтрансферазную активность на полуметилированной ДНК. Размер этого фермента по сравнению с прокариотическими ферментами значительно увеличен, что обусловлено наличием на N-концевой части Dnmt1 регуляторного домена, составляющего две трети всей молекулы. В клетке ДНК-метилаза Dnmt1 выполняет функцию поддерживающего метилирования ДНК, специфичность которой контролирует N-концевой домен. N-концевой домен ДНК-метилазы Dnmt1 позволяет ферменту различать в ДНК неметилированные и полуметилированные СрG-последовательности и предпочтительно метилировать in vitro и in vivo эти полуметилированные сайты. Лишенный своего N-концевого домена, фермент теряет это свойство и превращается в обычную прокариотическую ДНК-метилазу. Однако недавно это положение пересмотрено и показано, что существенная часть N-концевого домена без первых 300 аминокислот требуется также и для энзиматической активности метилазы Dnmt1. Предполагается, что N-концевой домен нужен для правильного формирования третичной структуры метилазы Dnmt1. кДНК гена Dnmt1 человека клонирована и охарактеризована. Структура этой метилазы, включая N-концевой домен, близка к структуре соответствующей метилазы мыши.

По-видимому, ген DNMT1 возник путем слияния гена прокариотической ДНК-метилазы с одним или двумя генами, кодирующими ДНК-связывающиеся белки.

ДНК-метилаза Dnmt1 ассоциирована с областью репликации ДНК в течение S-фазы и распределена диффузно в нуклеоплазме в клетках, находящихся вне S-фазы. Метилаза Dnmt1 человека и животных является компонентом репликативного комплекса. На это указывает, в частности, способность фермента связываться с ядерным антигеном пролиферируюших клеток человека. N-концевой регуляторный и С-концевой каталитический домены молекулы Dnmt1 связаны GК-аминокисдотными повторами. Следует отметить, что ДНК-метилаза Dnmt1 содержит в своем N-кониевом домене аминокислотные последовательности, гомологичные транскрипционному репрессору НRХ, посредством которого фермент ассоциирован in vivo с гистоновыми деацетилазами. Список некоторых белков, способных ассоциировать с эукариотическими ДНК-метилазами, представлен в табл. 3.

Рис. 35. Субстратная специфичность ДНК-метилтрансфераз семейства Dnmt1.

Хотя Dnmt1 предпочтительно работает на полуметилированных сайтах, этот фермент способен также метилировать необычные субстраты с различными структурными аномалиями. Мышиная ДНК-метилаза способна метилировать также и однонитевую ДНК, если она содержит в своей цепи m⁵С. Предполагается, что фермент распознает присутствующий в однонитевой цепи ДНК m⁵С в качестве сигнала для метилирования немодифицированных остатков цитозина в последовательностях СрG и работает на петлевых участках однонитевой цепи. Аналогичной способностью модифицировать однонитевые ДНК обладает ДНК-метилаза Е. соli dam, участвующая в процессах репликации и репарации ДНК. Сайт m⁵С может также служить сигналом для Dnmt1 на полуметилированной и полностью неметилированной последовательностях СрG в двунитевых субстратах, причем скорость метилирования de novo таких полуметилированных субстратов в несколько раз выше скорости метилирования немодифицированных субстратов.

Dnmt1 человека может избирательно узнавать и метилировать полуметилированные асимметричные двунитевые ДНК, несущие «целевую мишень» СрG на одной цепи и спаренный с ней метилированный цитидиновый остаток в комплементарной цепи. Интересно, что соседство этого метилированного цитидина в своей цепи с гуанозином не обязательно: соседом может быть любой нуклеозид или его производное. На рис. 35 показано, как полуметилированная дуплексная последовательность детерминирует метилирование цитозина (*С) в СрG-последовательности нижней цепи. Видно, что С не обязательно должен быть спарен с G верхней цепи. Асимметричный сайт узнавания заключен в рамку.

Оптимальные для метилирования de novo субстраты содержат между немодифицированными динуклеотидами СрG другие последовательности длиной 13-17нуклеотидов. Важно также отметить метилирование de novo мышиной ДНК-метилазой остатков цитозина в последовательностях, отличающихся от СрG, и более выраженное проявление этой способности на однонитевой ДНК. Вероятно, наблюдаемый в клетках различных эукариот несимметричный тип метилирования в ДНК остатков цитозина может осуществляться ДНК-метилазами при участии специальных регуляторных факторов, модулирующих специфичность узнавания метилируемой последовательности.

Инактивация гена мышиной метилазы Dnmt1 приводит к значительному (до 70 %) снижению общего уровня метилирования генома и к гибели развивающихся эмбрионов. Данные о сохранении 30 %-ного уровня метилирования ДНК и способности эмбриональных стволовых клеток, лишенных метилазы Dnmt1, метилировать ретровирусную ДНК de novo указывали на выполнение этих функций другими ДНК-метилазами. Поиск таких ДНК-метилаз у животных выявил новые ферменты семейств Dnmt2 и DnmtЗ.

ДНК-метилаза Dnmt2 состоит из 415 аминокислотных остатков и лишена N-концевого домена. Активность этого фермента была обнаружена в клетках человека и дрозофилы. В эмбриональных стволовых клетках мыши инактивация гена Dnmt2 путем гомологичного нокаута не выявила заметного изменения в поддерживающем метилировании и метилировании ДНК de novo, что оставляет функцию этого фермента неясной. У растений и грибов также выявлены гены «коротких» ДНК-метилаз.

Функцию метилирования ДНК de novo выполняют ДНК-метилазы Dnmt3а и Dnmt3b. Dnmt3а и Dnmt3b человека состоят из 908 и 859 аминокислотных остатков соответственно, причем ген DNMT3B путем альтернативного сплайсинга может кодировать и ряд более коротких полипептидов. кДНК генов DNMT3A и DNMT3B мыши проявляет высокую гомологию с соответствующими кДНК человека. На функцию метилирования ДНК de novo этих белков указывает равная эффективность модификации ими последовательностей СрG в полуметилированных и неметилированных нативных и синтетических субстратах, а также значительное уменьшение их активности в зрелых соматических тканях. Высокая экспрессия генов DNMT3A и DNMT3B отмечена в недифференцированных эмбриональных стволовых клетках. В этих клетках метилазы DnmtЗа и DnmtЗb играют важную роль не только в установлении, но и в поддержании обшей картины метилирования ДНК. В то же время в этих дифференцирующихся клетках и в соматических тканях взрослого организма экспрессия этих генов крайне мала. Инактивация генов DNMT3A и DNMT3B путем гомологичного нокаута в эмбриональных стволовых клетках приводила к потере способности этих клеток метилировать ретровирусную ДНК de novo. Эти гены существенны также для нормального постэмбрионального развития мышей: дефектные по этим генам животные погибали спустя четыре недели после рождения.

Хотя ферменты Dnmt3а и Dnmt3b выполняют сходные или перекрывающиеся функции, они проявляют и специфические различия. Так, метилаза Dnmt3b отвечает за метилирование центромерных линкерных сателлитных повторов, а мутации гена DNMT3B у человека приводят к развитию ICF-синдрома (immunodeficiency, centromeric instability, facial anomalies). IСF-синдром – редкое аутосомное рецессивное заболевание, характеризующееся различными иммунологическими дефектами и аномальным строением лица. Он связан с нестабильностью центромерного гетерохроматина. При IСF-синдроме отмечается гипометилирование сателлитных ДНК II и III – главных компонентов конститутивного гетерохроматина.

Важно отметить присутствие в клетках млекопитающих особого белка семейства Dnmt3, обозначенного как Dnmt3L. Этот белок не проявляет метилтрансферазной активности, так как у него отсутствуют или укорочены несколько ключевых аминокислотных мотивов каталитического домена. В то же время в клетке Dnmt3L стимулирует активность ДНК-метилаз Dnmt3а и Dnmt3b и взаимодействует с ними напрямую. Устаноатена совместная локализация всех белков семейства Dnmt3 в ядре и необходимость наличия Dnmt3L для регуляции метилирования ДНК de novo и установления геномного импринтинга. Следует отметить, что в ассоциации с гистоновой деаиетилазой Dnmt3L выполняет также функцию транскрипционного репрессора.

При анализе ДНК эмбриональных стволовых клеток мыши был выявлен высокий уровень метилирования в ней последовательностей СрА и в меньшей степени – СрТ (15–20 % общего метилирования цитозина). Это «не-СрG»-метилирование отмечено как в симметричных Ср(N)_nрG-последовательностях, так и в несимметричных сайтах. В эмбриональных стволовых клетках с инактивированным геном ДНК-метилазы Dnmt1 доля «не-СрG»-метилирования увеличивалась до 45 % общего метилирования ДНК, что указывало на связь этой ДНК-метилазной активности с генами DNMT3A и DNMT3B. Действительно, ДНК трансгенных клеток дрозофилы с экспрессируемым в них геном DNMT3A наряду с последовательностью СрG содержала метилированный цитозин и в последовательности СрА. Метилазы Dnmt3 имеют значительно укороченный N-концевой домен по сравнению с метилазой Dnmt1, но в этом домене имеются области связывания с различными репрессорами (см. табл. 3). Благодаря этому свойству все метилазы семейства Dnmt3 способны выполнять функцию транскрипционных репрессоров, независимую от их каталитической ДНК-метилтрансферазной функции.

7.2. Регуляция экспрессии и модуляция активности метилтрансфераз

В связи с участием метилирования ДНК в переключении различных генетических программ клетки, должны существовать и механизмы регуляции экспрессии и модуляции активности самих ДНК-метилаз. Исследование этих механизмов находится пока на начальной стадии. Отмечена скоординированная транскрипция генов ДНК-метилаз DNMT1, DNMT3A и DNMT3B в нормальных тканях человека, однако она нарушена в опухолях. При этом на фоне умеренного повышения экспрессии генов DNMT1 и DNMT3А наблюдается значительное повышение экспрессии гена DNMT3B. Сложная структура генов эукариотических ДНК-метилаз и кодируемых ими белков предполагает наличие у них разнообразных регуляторных элементов. На генном уровне одним из способов регуляции экспрессии этих генов является альтернативный сплайсинг и транскрипция с разных промоторов. Так, ген DNMT1 мыши (>56 тпн) состоит из 39 экзонов размером от 32 до 352 пн. Большая изоформа ДНК-метилазы Dnmt1 транслируется с третьего АТG-кодона первого экзона, она присутствует в эмбриональных стволовых клетках и соматических тканях, а короткая изоформа транслируется с четвертого АТG-кодона четвертого экзона и обнаружена в ооцитах и преимплантированных эмбрионах.

Два секс-специфических экзона гена DNMT1 контролируют его экспрессию в ооцитах млекопитающих. Вероятно, различные изоформы ДНК-метилаз могут обладать разной субстратной специфичностью. Транскрипция человеческого гена DNMT1 может происходить с одного главного и трех минорных участков инициации и регулироваться независимыми промоторами и энхансерами, что соответствует существованию различных изоформ этого фермента в зародышевых и соматических клетках. Область главного промотора гена DNMT1 Р1 отличается высоким содержанием последовательностей СрG, характерным для «хаус-киппинг» генов, а область минорных промоторов Р2—Р4 – дефицитом этих последовательностей. Показана тканеспецифичность и различных изоформ ДНК-метилазы DnmtЗb человека.

Метилирование самого ДНК-метилазного гена может регулировать его экспрессию. В эмбриональных стволовых клетках мышей с высокой экспрессией гена DNMT1 все динуклеотиды СрG в его промоторной области не метилированы, в то время как в дифференцированных клетках и тканях они метилированы. Между промоторами Р1 и Р2—Р4 расположены три энхансера, активируемых протоонкогенным сигналом Ras-с-jun и репрессируемые супрессором опухолей Rb. Таким образом, регуляция транскрипции гена DNMT1 играет существенную роль в реализации нормальных и онкогенных программ клетки. В структуре гена DNMT1 мыши содержится регуляторный элемент АР-1, активируемый Ras-jun-протоонкогенным сигнальным путем. В АР-1-регуляторной области расположены 29 динуклеотидов СрG, выполняющих функцию сенсора состояния метилирования генома. Выдвинута гипотеза о регуляции экспрессии гена DNMT1 по принципу обратной связи. Согласно этой гипотезе конечный продукт реакции метилирования, т. е. метилированная ДНК, регулирует экспрессию гена DNMT1 в цис-положении. Эта гипотеза объясняет парадоксальное явление сосуществования в раковых клетках общего недометилирования ДНК и высокого уровня ДНК-метилазной активности.

В ядре растительной клетки существует система контроля метилирования ДНК фитогормонами. Добавление к ядерным экстрактам проростков пшеницы гиббереллина, 6-бензиламино-пурина и фузикокцина повышает на 30–65 % уровень метилирования ДНК пшеницы. В то же время эти фитогормоны не оказывают стимулирующего воздействия на активность частично очищенных ДНК-метилазных препаратов, что указывает на их опосредованное действие через ядерные белки. Как отмечено выше, в N-концевом домене большинства эукариотических ДНК-метилаз присутствуют разнообразные функционально значимые последовательности, определяющие их ассоциацию с ядерными белками. Это позволяет предположить, что происходит регуляция активности ДНК-метилаз на уровне белок-белковых взаимодействий. Так, супрессор опухолей Rb способен модулировать активность метилазы Dnmt1 человека.

Модификация метилазы Dnmt3a убиквитиноподобным пептидом SUМО-1 модулирует ее взаимодействие с деацетилазами гистонов и функцию транскрипционного репрессора. Метилаза Dnmt3b также модифицируется пептидом SUМО-1. В настоящее время изучается роль метилирования ДНК в иерархии процессов установки эпигенетического статуса хроматина. Так, метилирование ДНК растений в последовательностях СрNрG контролируется первичным метилированием гистона НЗ. Этот процесс осуществляется через взаимодействие хромометилазы СМТЗ с гомологом гетерохроматинового белка НР1, который, в свою очередь, взаимодействует с метилированным лизином 9 гистона НЗ (НЗК9), модифицированным специфической лизиновой гистон-НЗ-метилтрансферазой. У N.сrassа экспрессия активности ДНК-метилазы dim-2 контролируется также гистоновой Н3К9-метил-трансферазой. В свою очередь, метилирование Lys9 в гистоне НЗ может зависеть от первичного метилирования в ДНК последовательностей СрG. В последнее время установлено, что у большинства эукариотических организмов геномное метилирование осуществляют множественные ДНК-метилазы, специфически участвующие в различных генетических процессах, причем иногда даже без проявления своей каталитической метилтрансферазной функции. В клетках низших эукариот, обладающих только одной ДНК-метилазой. этот фермент способен выполнять множественные функции и модифицировать цитозин в различных специфических последовательностях ДНК за счет действия модулирующих факторов.

Особый тип контроля метилирования ДНК осуществляется на уровне ДНК-белковых взаимодействий. Так, фактор транскрипции Sр1 часто ассоциируется с неметилированными СрG-островками в промоторах хаус-киппинг-генов, запрещая de novo метилирование таких СрG-островков и поддерживая конститутивную экспрессию этих генов. Делеция промоторной области гена АРRТ с GС-боксами или мутации в них Sр1-узнаваемых последовательностей с СрG-сайтами приводили к метилированию de novo СрG-островков этого гена. Белки, так или иначе связанные с функционирование ДНК-метилаз приведены в табл. 5.

В то же время белки, связывающиеся с метилированной ДНК, могут поддерживать ее метилированное состояние. Поэтому следует отметить существование особого класса ДНК(m⁵СрG) – связывающихся белков. Вероятно, такие белки могут опосредовать жесткую обратную связь между СрG– и СрNрG-типами метилирования специфических генетических областей. Также эти белки могут определять безальтернативный СрG-типа гиперметилирования при некоторых формах рака.

Таблица 5

Белки, ассоциированные с метилтрансферазами

Для диагностики, прогнозирования и терапии заболеваний, связанных с аномальным метилированием ДНК, также важен вопрос о статусе различных сайт-специфических типов метилирования в картине метилирования генома в норме и при патологии. Надо отметить, что в клетке ДНК-метилазы действуют не на уровне простых ДНК-белковых комплексов, а на уровне ДНК в структуре сложно устроенного хроматина. Именно на уровне хроматина окончательно реализуются взаимосвязи между модификацией генома и многочисленными эпигенетическими модификациями белков хроматина. В настоящее время детально изучается причинно-следственная взаимосвязь метилирования ДНК и модификаций ядерных белков в процессах организации хроматина.

Дальнейшие исследования структурно-функциональной картины метилирования эукариотического генома и путей его регуляции имеют большое значение для понимания молекулярных основ эпигенетических процессов.