Текст книги "Репликация ДНК: учебное пособие"

Важнейшим механизмом негативной регуляции комплексов циклин – Cdk является взаимодествие с малыми белками-ингибиторами. Все они представлены на рис. 31. У млекопитающих описано два различных семейства ингибиторов Cdk (Cdk-inhibitors – CKIs). Семейство Ink4 (inhibitor kinase 4), включающее белки р15, р16, р18 и р19, названные так по способности ингибировать Cdk4, связываются с мономерами Cdk4 и Cdk6.

Ингибиторы связываются с Cdk4 и Cdk6 в той же области, что и циклин D. Таким образом, высокая экспрессия Ink4 блокирует образование активных комплексов циклин D – Cdk4. Так как Ink4 препятствуют образованию комплексов циклин D – Cdk4, то они увеличивают пул р27, способного связываться с комплексами циклин Е – Cdk2 и ингибировать их. Следовательно, повышение экспрессии Ink4 напрямую ингибирует активность комплексов циклин D – Cdk4 и опосредованно – активность комплексов циклин Е – Cdk2. Вторая группа белков CKIs, Cip/Kip (cycline inhibitor/kinase inhibitor) семейство, включающее белки р21^cip, p27^kip и р57^kip, ингибируют комплексы, содержащие Cdk2. Это семейство ингибиторов связывается с формирующимися комплексами, блокируя таким образом их доступ к субстрату. Р21, главный из этих ингибиторов, является белком, экспрессия которого активируется белком р53 в ответ на повреждение ДНК.

Рис. 31.Ингибиторы комплексов циклин-CDKs

Ассоциация киназы с циклином приводит к частичной активации киназного комплекса. Для полной активации требуется фосфорилирование по треонину-168 в районе Т-петли в С-конце киназы. Киназы, способные наносить такое активирующее фосфорилирование, называются Cdk-activating kinases (Cak). Активность самих Cak постоянна в течение клеточного цикла и, вероятно, даже небольшие ее модуляции могут оказывать влияние на движение по циклу.

Фосфорилирование некоторых аминокислот на N-конце Cdks также подавляет их киназную активность. Подавление активности комплекса Cdk1-циклин В в фазе G2 является наиболее полно охарактеризованным примером ингибирующего фосфорилирования Cdks. Впрочем, активность циклин А – Cdk2, циклин Е – Cdk2 и циклин D – Cdk4 комплексов тоже регулируется таким способом. Ингибиторное фосфорилирование осуществляется рядом с АТР-связывающим сайтом киназной субъеиницы. У человеческой Cdk1 мишенями ингибирующего фосфорилирования являются треонин-14 и тирозин-15. Фосфорилирование по тирозину-15 в основном осуществляется ядерной киназой Wee1, а фосфорилирование по треонину-14 проводит протеинкиназа Myt1, локализованная в цитоплазме и связанная с мембранами цитоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи. Различная локализация этих киназ предполагает механизм, по которому Cdk1 может негативно регулироваться как в ядре, так и в цитоплазме. Ингибирующие фосфорилирование Cdks снимается фосфатазами двойной специфичности семейства Cdc25. В клетках млекопитающих экспрессируются три формы Cdc25. Cdc25А действует в начале клеточного цикла, способствуя дефосфорилированию и активации комплекса циклин Е – Cdk2. Две другие фосфатазы Cdc25В и Cdc25С принимают участие в дефосфорилировнии комплекса циклин В – Cdk1 и переходе G2-M. Любопытно, что сами Cdc25 являются субстратами для Cdks: Cdc25А фосфорилируется и активируется комплексом циклин Е – Cdk2, а Cdc25С – циклин В – Cdk1. Это предполагает, что быстрая и полная активация Cdks стимулируется по принципу положительной обратной связи.

Каждая фаза клеточного цикла характеризуется тем, какой именно комплекс циклин – Cdk присутствует и активен. Поэтому важно, какие комплексы циклин – Cdks вовремя инактивированы или разрушены. Убиквитин-опосредованная деградация является основным путем устранения из клеток белков клеточного цикла, уже выполнивших свои функции и гарантии того, что события клеточного цикла будут происходить в надлежащей последовательности. Присоединение убиквитиновых остатков к белкам-субстратам является сигналом для их деградации с помощью 26S протеосом, мультибелкового комплекса, специализирующегося на анфолдинге и протеолизе убиквитин-меченых белков. Этот процесс продвижения белка к 26S протеосоме контролируется активностью двух структурно и функционально близких комплексов – Skp-Cullin F box complex (SCF) и Anaphase promoting complex (APC). Специфичность и временная правильность деградации достигается комбинацией различных механизмов. В случае SCF особые распознающие белки, известные как F-box белки, привлекают белки-мишени к SCF-комплексу. Большая часть белков-мишеней, то есть р27 и циклин Е распознаются только в том случае, если они фосфорилированы Cdks. Таким образом, их деградация находится под прямым контролем Cdk-активности. В случае АРС-комплекса были идентифицированы два специальных фактора – Cdc20 и Cdh1. Как следует из названия, активность АРС необходима в начале анафазы. Она завершается деградацией белков, предотвращающих расхождение сестринских хроматид. Регуляция начала анафазы строго контролируется чекпойнтом веретена, гарантирующим, что сегрегация не может осуществиться до того, как все хромосомы правильно прикрепяться к митотическому веретену. Увеличение экспрессии Cdc20 в митозе инициирует деградацию субстратов АРС-Cdc20. Фосфорилирование Cdc20 и компонентов кора АРС комплексом циклин В-Cdk1 в дальнейшем стимулирует их убиквитин-лигазную активность. Циклин В и Cdc20 оба являются субстратами АРС. Таким образом, они сами стимулируют ту активность, которая является причиной их будущей деструкции. Активность АРС-Cdh1 в ранней G1 гарантирует разрушение всех митотических белков до начала инициации репликации ДНК в следующем цикле.

6.4. Точка рестрикции клеточного цикла – узел митогенных и ингибирующих сигналов

Во время клеточного деления удваиваются и разделяются по двум дочерним клеткам все молекулы и органеллы материнской клетки. Удвоение ДНК происходит только в фазе S. У всех эукариот имеются сходные белковые комплексы, участвующие в инициации репликации и сходные белки, разрешающие репликацию. После образования, компоненты этого комплекса активируются циклин-зависимыми киназами. Начавшись, репликация ДНК должна быть завершена. Таким образом, внеклеточные сигналы типа ростовых факторов не могут и не должны влиять на прохождение S-фазы. Так как S-фаза независима от ростовых сигналов, то к ее остановке могут приводить только массивные повреждения ДНК или отсутствие пула нуклеотидов, но такой арест часто оканчивается гибелью клетки.

После успешного завершения синтеза ДНК клетки переходят в G2-фазу и готовятся к митозу. Активированные в G2-фазе протеинкиназы предотвращают повторную репликацию. Покоящиеся клетки млекопитающих являются диплоидными, так что после удвоения ДНК они должны разделиться. То есть в G2-фазе контроль ростовых факторов также не нужен. Не нужны и свободные нуклеотиды, и остановить вступление клетки в митоз могут внутриклеточные сигналы, генерируемые в ответ на повреждение ДНК.

В процессе митоза циклин В-cdk1 фосфорилирует ламинин, белок ядерной мембраны, что приводит к растворению ядерной оболочки. В метафазе митоза конденсация хромосом совпадает с формированием митотического веретена. Эндоплазматический ретикулюм и комплекс Гольджи распадаются на маленькие пузырьки. Во время митоза хромосомы конденсированы, белки гиперфосфорилированы, а транскрипция и биосинтез резко ограничены или отсутствуют. Прохождение митоза определяется мониторингом функционирования микротрубочек, способствующих правильному расхождению хромосом. Внешний контроль ростовых факторов в такой момент представляется просто вредным, так что и митоз также является фазой цикла, независимой от них. В анафазе митоза две группы хромосом расходятся в разные стороны. Во время телофазы и цитотокинеза в клетке как бы в обратном порядке идет процесс восстановления внутриклеточных мембран. Вокруг ядер формируются оболочки, эндоплазматический ретикулум и комплекс Гольджи заново выстраиваются в цитоплазме. Микротрубочки разбираются. Транскрипция и биосинтез нормализуются, восстанавливаются внутриклеточные мембранные пути. После выхода из митоза клетки готовы к следующему клеточному циклу, допуская установление нового компетентного к репликации состояния в G1-фазе. Таким бразом, из простых логических умозаключений следует, что только G1-фаза клеточного цикла может зависеть от ростовых факторов.

Основные регуляторные события, приводящие к пролиферации, происходят в G1-фазе цикла. In vivo, так же, как и в клеточных культурах, большинство покоящихся клеток имеют количество ДНК, соответствующее таковому в G1. Рост нормальных клеток в культуре регулируется комплексом взаимодействий между факторами роста, плотностью клеток и степенью их прикрепления к субстрату. Факторы роста необходимы для инициации и поддержания движения по фазе G1, приводящего к фазе S. Удаление ростовых факторов до определенного момента фазы G1 предотвращает наступление фазы S в нормальных клетках. Точка G1-фазы, после которой клетка не нуждается более в ростовых факторах для завершения клеточного цикла, была названа точкой рестрикции. Ее время было определено примерно за 2–3 ч до начала синтеза ДНК. Единожды в точке рестрикции или точке, после которой нет пути назад, клетки настраиваются на синтез ДНК и в дальнейшем не нуждаются во внеклеточных ростовых факторах в течение всего клеточного цикла. Было высказано предположение, что прохождение точки рестрикции, определяется накоплением особого лабильного (короткоживущего) белка, который получил условное название «R-белок».

Определение точки рестрикции могло бы быть маркером для различения нормальных и опухолевых клеток. Но какова ее биохимическая природа? Была высказана гипотеза, что R-белок является функциональным короткоживущим регуляторным белком, синтез которого чувствителен к ростовым факторам и который должен накопиться в достаточном количестве до того, как клетка пройдет точку рестрикции и двинется вперед, к синтезу ДНК. К моменту постановки этого вопроса еще не были известны онкогены и пути передачи клеточных сигналов. Многие из открываемых впоследствии белков анализировали с точки зрения критериев R-белка.

Поиск экспрессирующегося только в поздней G1-фазе и отсутствующего в покоящихся клетках белка позволил предложить несколько различных вариантов. Выявление потенциального R-белка было сделано методом дифференциального дисплея. К сожалению, в том случае, если накопление белка происходит путем его стабилизации, а не повышения экспрессии, данный метод не работает.

R-белок является короткоживущим белком, который индуцируется, или стабилизируется в ответ на действие ростовых факторов, причем накопление R-белка ведет к независимости от них. Открытие циклинов G1-фазы D и E было крайне важным. Циклин D1, короткоживущий ядерный белок, накапливается под действием ростовых факторов. Он обычно сверхэкспрессирован в опухолевых клетках. То же с циклином Е, свойства которого отвечают всем требованиям к R-белку, включая повышение в поздней G1, задержку появления после ингибирования синтеза белка в нетрансформированных клетках и быстрое восстановление в трансформированных клетках.

Движение по циклу осуществляется под действием Cdks. Их активаторы циклины нестабильны и их экспрессия циклична в течение клеточного цикла. Таким образом, именно наличие циклинов контролирует активность Cdks и играет ключевую роль в регуляции клеточного цикла. За время прохождения клетки по циклу последовательно продуцируются четыре основных циклина – D, E, A, B. Циклин В ассоциирован с p34/cdk1 и является триггером митоза. Движение по S-фазе требует наличия циклина А и его ассоциации с р33/Cdk2. Циклины D и Е приводят клетку к S-фазе. Три типа циклина D: D1, D2, D3 очень похожи, но существенно отличаются от циклина Е. Во время клеточного цикла D-циклины начинают накапливаться в середине G1, в то время как циклин Е появляется позже, почти прямо перед переходом из G1 в S. Зависимое от митогенного сигнала продвижение по G1 связано с индукцией циклинов D-семейства. Факторы роста регулируют циклин D, как это показано на рис/32 четырьмя способами одновременно:

1) индукция транскрипции;

2) стабилизация белка циклина D;

3) перемещение в ядро;

4) объединение с их каталитическими партнерами Cdk-4 Cdk-6.

Промоторы D-циклинов отвечают на большое число митогенно-активирующихся сигналов, таких как Ras и β-катенин-Tcf/lef.. Индукция транскрипции циклина D1 зависит от Ras/Raf-1/Mek/ERK сигнального пути. К тому же циклин D1 быстро деградирует и имеет короткое время существования. Важно подчеркнуть, что не только уровень циклинов D и Е, но и других белков, которые регулируют или осуществляют точку рестрикции, может повышаться путем стабилизации (как р53, обычно без специального фосфорилирования идущий путем протеосомной деградации). Подобным же образом протеосомной деградации подвергаются ингибиторы Cdks р27 и р21, сам циклин Е и транскрипционный фактор Е2F-1. Циклин D1 подвергается убиквитинированию и протеосомной деградации после фосфорилирования по треонину-286. Это фосфорилирование может быть ингибировано через сигнальный путь, в котором частично задействованы Ras, Pi3-киназа и протеинкиназа В (Act). Такой оборот циклина D1 является митоген-зависимым, а перенос в ядро и ассоциация с Cdk4 – митоген-независимым.

После объединения циклина D c Cdk в ядре, этот комплекс фосфорилирует белок Rb, нарушая его связывание с факторами транскрипции E2F, активирующими E2F-зависимую транскрипцию. Транскрипционный фактор E2F активирует транскрипцию генов, продукты которых вовлечены в ядерный метаболизм и синтез ДНК. Для понимания природы точки рестрикции нужно помнить, что E2F трансактивирует циклины Е и А. Циклин Е в комплексе с Cdk2 сотрудничает с циклин D – Cdk4/Cdk6 комплексами для полного фосфорилирования белка Rb. Циклин E-Cdk2 обладает более широкой активностью, чем циклин D-Cdk4/Cdk6. К примеру, циклин E-Cdk2 фосфорилирует ингибитор р27, что ведет к его деградации. Напротив, в низкой концентрации ингибиторы Cdks р21 и р27 коактивируют циклин D – Cdks. Другой класс ингибиторов р15, р16, р18 и р19 специально ингибируют циклин D – Cdks.

Факторы роста активируют собственные рецепторы и другие тирозинкиназы, а через них Ras и митоген-активирующиеся сигнальные пути, кульминацией этого процесса является индукция транскрипции многочисленных генов, включая протоонкогены. Сходным образом, многие гены, кодирующие факторы роста, рецепторы, рецептор-ассоциированные белки и киназы сами являются протоонкогенами.

Одним из важнейших загадок в понимании регуляции клеточного цикла является связь митогенной стимуляции с машиной клеточного цикла. Экспрессия циклина D, его продвижение в ядро, стабилизация и ассоциация с Cdks4 или 6 в активный киназный комплекс регулируется ростовыми факторами. Следовательно, циклин D является сенсором ростовых факторов. Способность циклин D – зависимых киназ начинать фосфорилирование Rb в средней и поздней G1 показывает, что инактивация Rb также является митоген-зависимым шагом. Rb является фактором, супрессирующим клеточный рост, и участвует в контроле G1/S перехода, связывая семейство транскрипционных факторов E2F.

Рис. 32.Регуляция экспрессии циклина D

Отсутствия функционально активного белка Rb достаточно для вхождения в фазу S в условиях, ограничивающих клеточный рост. Накопление E2F приводит к преодолению G1-ареста, вызванного подавлением активности циклин D и Е-Cdks киназной активности. Зависимость от ростовых факторов заканчивается при полном фосфорилировании Rb, приводящем к проходу через точку рестрикции в средней G1 и дальнейшему движению по клеточному циклу. Достаточно ли способности циклинов D фосфорилировать Rb для того, чтобы считаться R-белками? Не полностью. Их способность быть сенсором факторов роста зависит не только от их быстрой индукции в ответ на митогенные сигналы, но также от их белковой нестабильности, гарантирующей их быструю деградацию в клетках, лишенных ростовых факторов. То, что циклины D являются короткоживущими белками, гарантирует быстрое сокращение их пула при отсутствии митогенов. Индукции одного циклина D недостаточно для перехода покоящейся клетки через G1 в S.

Комплекс циклин Е/Cdk2 возникает позже по отношению к комплексу циклина D/Cdk4 и завершает фосфорилирование Rb. Этот шифт между комплексами циклин ЕCdk2 и циклин DCdk4 объясняет потерю зависимости от факторов роста. Точнее, точка рестрикции расположена между пиками активности циклина Е и циклина D. Переход из G1 в S сопровождается множественными петлями обратной связи, приводящими к ситуациям, при которых нижележащие события связаны с регуляцией самих себя на более высоком уровне. Например, и Rb/р130 и р27 оба являются негативными регуляторами циклина Е. Экспрессия с-myc зависит от р21, CDKs и E2F, при том, что c-myc сам является регулятором р21 и CDKs.

Таким же образом циклин Е расположен ниже по отношению к Rb и E2F-1, так как он трансактивируется E2F-1. В тоже время завершение фосфорилирования Rb циклином Е и приводит к высвобождению E2F. Позитивная регуляция представляется необратимой. Тот же циклин Е, единожды экспрессировавшись становиться в дальнейшем независимым от митоген-зависимого циклина D. Таким образом, циклин Е является более удачным кандидатом на роль R-белка, чем циклин D. Зависимость от ростовых факторов заканчивается в момент полного фосфорилирования Rb, после чего клеткам остается только пройти через точку рестрикции и двигаться по циклу дальше. Таким образом и циклин D и циклин Е, а также и циклин А связанные CDKs фосфорилируют Rb. R-белок разделяется, как минимум, надвое.

Кроме того, E2F-1 частично тоже обладает свойствами R-белка. Именно он необходим для начала фазы S. История поиска R-белка показывает, как, расширяясь, наши знания приводят к выводу о существовании не точки, а узла (knot) рестрикции. Современные представления о точке рестрикции показаны на рис. 33.

Рис. 33. Предсталение о природе точки рестрикции.

Вероятно, точка рестрикции расположена между пиками накопления циклинов D и Е и активацией циклин Е/Cdk2. Какова же тополгическая связь между зависимой от факторов роста точкой рестрикции и вызванным повреждениями ДНК G1-чекпойнтом?

ДНК-повреждения действуют на CDKs двумя путями. Первый – быстрое и проходящее удаление циклина D. Путь, индуцированный повреждениями ДНК, влияет на циклин D и комплекс циклин ЕCdk2. После ДНК-повреждения циклин D быстро деградирует в 26S протеасомах. Деградация циклина D приводит к высвобождению белка р21 из комплекса с Cdk4 и ингибирования им Cdk2. Т. е. в ответ на повреждение ДНК р21 может перераспределяться в ядре без увеличения своего количества. Это р53-независимый процесс (как, собственно, р53-независим и сам контроль точки рестрикции). Отсутствие выраженного G1-ареста в клетках с функционально неактивным р53 связано с тем, что «резервуар» р21, связанного с циклин D/Cdk4 комплексом, после повреждения ДНК быстро истощается.

Второй путь – р53-зависимая индукция р21, также приводящая к подавлению активности циклин Е/Cdk2 комплекса. Одновременно происходит накопление самого р53. Это приводит к индукции р21 и выраженной остановке роста. Белок Rb также является важным компонентом этого чекпойнта. Этот чекпойнт– ответ использует обычную машину клеточного цикла для того, чтобы индуцировать накопление Rb в гиперфосфорилированной форме, супрессирующей рост и пролиферацию клетки.

Ингибитор протеинкиназ стауроспорин останвливает движение по клеточному циклу в нормальных нетрансформированных клетках в G1 фазе между пиками активности циклинов D и Е. Напротив, ингибитор гистоновых деацетилаз FR901228 прводит к нефизиологическому G1-аресту путем подавления циклина D и активации циклина Е в опухолевых клетках, лишенных нормального контроля клеточного цикла. Очевидно, что результаты воздействия на системы контроля клеточного цикла в нормальных и трансформироанных клетках существенно различаются.

Отдельный активирующий сигнал, поступающий после точки рестрикции, вызывает вход в S-фазу. Но в некоторых случаях может вызвать и апоптоз. Апоптоз подавляется ЕGF-зависимыми событиями, происходящими до точки рестрикции. С другой стороны, выбор между пролиферацией и остановкой роста в ответ на действие ростовых факторов и ингибиторов определяется состоянием «узла рестрикции» (restriction knot). Это всегда нужно учитывать при постановку эксперимента.

Хорошо известно, что экзогенные стимулы, такие как EGF, TGFβ, CSF-1, интерлейкины и форболовые эфиры, а также внутриклеточные сигнальные молекулы, такие как Ras, PKC, Raf-1, ERK могут вызывать как продвижение по циклу, так и его арест. Понимание этого столь просто, что часто оказывается вне зоны наблюдения: стимуляция роста происходит тогда, когда агент действует на покоящуюся клетку, в то время как остановка цикла – при его действии на клетку пролиферирующую.

Это очевидно, так как мы знаем, что митогенный сигнал одновременно активирует экспрессию циклина D и ингибиторов р21 и р27. Не уровень сигнала, а статус клетки определяют ответ. В покоящихся клетках можно обнаружить низкий базовый уровень циклинов DI и Е, но высокий уровень ингибитора CDK р27. В пролиферирующих клетках наоборот, обнаруживается высокий уровень циклинов DI и Е, но низкий – р27. В покоящихся клетках низкий уровень активности Raf-1 индуцирует циклин DI и пролиферацию, а в делящихся фибробластах высокий уровень Raf-1 приводит к остановке деления через активацию р21.

Факторы транскрипции E2F-1 и H-Ras могут влиять на промотор р21, причем индукция р21 активированным Ras частично опосредуется E2F-1.

Один и тот же стимул может вызывать различные последствия в зависимости от Rb-статуса. Индуцированная цитокинами экспрессия р21, которая в нетрансформированных клетках блокирует переходы G1/S или G2/M, не может предотвратить переход G1/S в клетках с отсутствующей или подавленной активностью белка Rb, что приводитдит к эндоредупликации ДНК и нарушению хромосомной стабильности.

Для клеточного ответа также важен и уровень белка р21. Например, в клетках с низким базовым уровнем р21, повреждения ДНК вызывают только G2-арест, но не G1-чекпойнт. Более высокий уровень р21 останавливает клетки и в G1.