Текст книги "Репликация ДНК: учебное пособие"

5.5. Теломеры и репарация

Теломеры являются единственными «легально разрешенными» двунитевыми разрывами ДНК в клетке.

Двунитевые разрывы ДНК (DSBs, double-strand breaks) возникают под действием ионизирующей радиации и некоторых других повреждающих агентов. Известны два оснвных пути репарации DSBs: гомологическая рекомбинация и достраивание недостающих нитей, и негомологичное соединение концов ДНК (NHEJ, Non-homologous end joining). Считают, что первый путь преобладает в S и G2 фазах клеточного цикла и в активно делящихся клетках, например дрожжей, а второй – в G0/G1 фазах и в редко делящихся клетках, в частности клетках млекопитающих. С другой стороны, показано, что разрывы геномной ДНК могут активно стимулировать гомологичную рекомбинацию в клетках млекопитающих.

Независимо от механизмов репарации, и DSBs, и незащищенные теломеры активируют протеинкиназу АТМ (ataxia-telangiectasia mutated), что приводит, как уже отмечалось ранее, к активации р53 и далее – к остановке пролиферации и индукции механизмов клеточного старения или апоптоза. При образовании t-петли, однонитевой участок теломер, спаривающийся со «стволом», имитирует гомологичную рекомбинацию и при определенных условиях может стимулировать достраивание новой цепи ДНК. По этому принципу происходит удлинение теломер, независимое от теломеразы.

В составе теломерного нуклеопротеидного комплекса как у дрожжей, так и в клетках человека постоянно присутствует белок Кu, один из компонентов NHEJ. Гетеродимер Кu человека состоит из субъединиц молекулярной массой 69 и 83 кДа, называемых Кu70 и Кu80 (или Кu86). У дрожжей гомологичные белки называются HDF1 (или yКu70) и НDF2 (соответственно, уКu80). Этот гетеродимер связывает как одно-, так и двунитевые разрывы ДНК не только в области теломер, но и в любой другой части хромосомы, и предположительно препятствует дальнейшей деградации порежденого участка ДНК.

Участие Кu в функционировании теломер изучается не столь давно, но его присутствие в области телосомы неоднократно отмечалось в разных лабораториях. Противоречие между ролью Кu в репарации DSВs и участием этого белка в защите теломер, в том числе, от слияний, достаточно очевидно, поскольку это два прямо противоположных процесса. Вероятно, Кu выполняет во всех случаях лишь защитные функции, а дальнейшие процессы происходят при участии специфических для них белков, т. е. либо TRF, либо систем репарации и рекомбинации. В частности, на теломерах Кu ингибирует деградацию и рекомбинацию теломерных повторов. При недостатке этого белка теломеры укорачиваются; в участках генома, прилегающих к концам хромосом, активность которых в норме подавлена, инициируются перестановки последовательностей. К сожалению, единого мнения по вопросу о роли белка Кu в телосоме пока нет.

После связывания белка Кu на DSВ и активации DNА-РК в репарации участвует еще множество белков. Среди них комплекс Rad50/Mre11/NBS1. Кроме NHEJ эти белки участвуют также в гомологичной рекомбинации и в поддержании целостности теломер.

Белок Rad50 (Radiation mutant 50) первоначально изучали на дрожжах, однако в 90-е гг. был найден его гомолог и у человека. Rad50 – вытянутая палочкообразная молекула, напоминающая по форме миозин. Молекулярная масса ортологов у дрожжей и человека – 153 кДа. Полипептид имеет два ДНК-связываюших домена, расположенных на N– и С-концах молекулы и проявляющих ферментативную АТРазную активность. Это наиболее консервативные по аминокислотной последовательности участки молекулы, идентичные у дрожжей и человека на 50 % и более. Энзиматические домены соединены протяженным суперспирализованным участком, изогнутым под острым углом в районе Zn-связываюшего мотива, расположенного в центре молекулы, так что ДНК-связываюшие домены колокализованы. Zn-связываюший домен служит для димеризации белков Rad50, так что димер из двух палочковидных молекул может одновременно удерживать молекулы ДНК, расположенные на расстоянии до 1200Å. Mre11 (meiotic recombination 11) – нуклеаза, которая также изучалась на дрожжах, и гомологи которой присутствуют во всех царствах, включая животных и человека. При репарации Mre11 подвергает деградации шпильки и прочие неправильные структуры в молекуле ДНК, в частности, образующиеся в районе поврежденных вилок репликации. При гомологичной рекомбинации нуклеазная активность необходима для спаривания двух молекул ДНК, в котором участвуют 3'-концевые однонитевые участки протяженностью в несколько сотен пар нуклеотидов. Комплекс Rad50/Мге11, в котором Мге11 связывается в районе АТРазного домена Rad50, проявляет эндонуклеазную, а также экзонуклеазную активность в направлении от 3'– к 5'-концу ДНК, но не в обратном направлении. Очевидно, Мre11 – не единственная нуклеаза, участвующая в катализе рекомбинации. Некоторые мутации Мre11, приводящие к блокированию взаимодействия с Rad50, сопровождаются укорочением теломер, не нарушая при этом процессы репарации; другие, напротив, снижают энзиматнческую активность белка, но не влияют на его участие в защите теломер. Следовательно, функции этого белка в репарации и в поддержании структуры теломер различны.

Третий компонент комплекса MRN у дрожжей и человека не гомологичен. У S.сегevisеае это белок Хгs2 (X-ray sensitivity), а у человека – нибрин или Nbs1) (Nijmegen breakage syndrome 1), белок, мутация которого на клеточном уровне приводит к изменениям, сходным с вызванными мутацией АТМ, хотя клиническая картина соответствующего наследственного заболевания в двух указанных случаях различается. NBS1 имеет три сайта фосфорилирования и таким образом модулирует энзиматическую активность Rad50 и Мге11. В то же время он придает комплексу способность в присутствии АТР раскручивать двунитевуюДНК.

5.6. Функции белков, связанных с теломерами

Нередко трудно понять, действительно ли тот или иной белок важен для теломер и играет какую-то роль в их защите, репликации, репарации или передаче сигнала об их состоянии к каким-то еще субклеточным структурам. Неоторые белки, выявленные в составе телосомы, не проявляют специфичности именно к теломерам и их активность в отношении ДНК не связана с теломерной нуклеотидной последовательностью. Так, например, обстоит дело с белками репарации, которые выявляют, разумеется, не только на теломерах; из них Кu и комплекс Rad50/Мге11/NBS1 считают постоянно присутствующими в составе телосомы, в то время как к другим участкам ДНК они транслоцируются по мере необходимости. Среди белков такого рода можно также упомянуть UP1, который, вероятно, участвует в поддержании структуры теломер и некоторых других G-богатых участков ДНК.

Тем не менее, белки, связанные с теломерами, можно разделить по функциональному признаку на следуюшие группы: 1) белки, поддерживающие пространственную структуру теломер. К ним, в частности, относится семейство TRF и другие белки с телобоксом; 2) белки, которые обеспечивают и регулируют образование теломерного гетерохроматина, а также модулируют активность генов, прилегающих к теломерам, путем их включения в гетерохроматин. К этой группе можно отнести белки Rap, Sir, а также Rif, гистоновые ацетилазы, метилтрансферазы и др.; 3) белки, отвечающие за подготовку теломер к репликации и взаимодействию с теломеразой. Это танкираза, а также белки, непосредственно регулирующие теломеразу, такие как РinX1 и некоторые другие, например, комплекс Stn1/Сdс13/Ten1 у дрожжей; 4) белки, осуществляющие репарацию повреждений теломер, а также, возможно, негативно регулирующие их длину, т. е. нуклеазы. В качестве примера можно привести Rad50/Мге11/NBS1 и Кu; 5) сигнальные белки, передающие информацию о защите или повреждениях теломер в другие субклеточные компартменты, а также инициирующие клеточное старение и апоптоз. Это протеинкиназа АТМ, р53, р16INК4, рRb и другие белки сигнальных путей, регулирующих пролиферацию и гибель клеток.

Разумеется, распределение собственно теломерных и ассоциированных с теломерами белков по указанным группам не исключает их участия в нескольких различных механизмах, изучение которых еще продолжается.

5.7. Теломеры и старение

Неоднократно упоминавшееся выше репликативное или клеточное старение не обязательно может быть связано со старением многоклеточного организма, а его молекулярный механизм – с укорочением теломер. У человека известны по меньшей мере два вида патологически быстрого старения, молекулярный механизм которого в настоящее время изучен. Синдром Вернера или прогерия взрослых вызывается мутацией в гене геликазы WRN, что приводит кзатруднениям в процессе репликации ДНК и клеточной пролиферации. Больные умирают от старости в возрасте 35–50 лет. Синдром Хатчинсона-Гилфорда или прогерия детей, связан с мутацией в гене ламина А, что затрудняет пролиферацию вследствие дисфункции ядерной оболочки. В результате старение наступает уже в детском возрасте, и больные не доживают до 20 лет. И в том, и в другом случае генетические аномалии приводят к патологически заторможенному обновлению тканей, которое не является следствием укорочения теломер, хотя при синдроме Хатчинсона-Гилфорда теломеры резко укорочены уже у новорожденных. Тем не менее, нормальное старение у человека, по-видимому, все-таки связано с исчерпанием лимита Хейфлика. Длина теломер у пожилых людей приближается к пределу в 1–2 тпн, необходимых для образования t-петли минимальных размеров. Если это так, то именно теломерный механизм старения следует считать причиной естественной смены поколений у человека.

В ходе индивидуального развития большая часть клеток человека и животных утрачивает способность экспрессировать теломеразу и, следовательно, их теломеры могут только укорачиваться. Дойдя до известного предела, после которого защита концов линейных хромосом становится невозможной, теломеры через АТМ/р53– и р16/рRb-зависимые сигнальные пути инициируют блок пролиферации и отмирание клетки.

Несмотря на кажущуюся простоту этого механизма, его изучение далеко от завершения, и в ходе исследований возникают все новые вопросы. Например, в организме существуют стволовые клетки, обеспечивающие способность тканей к регенерации и так же, как и половые клетки, экспрессирующие теломеразу. Некоторые соматические клетки, способные к клональной экспансии в определенных условиях, такие как лимфоциты, тоже экспрессируют теломеразу. Тем не менее длина теломер в лимфоцитах, как и в остальных соматических клетках, уменьшается. Очевидно, продолжительность жизни и старение регулируются не только теломеразой.

Поиск генов, связанных с регуляцией старения, позволяет выявить ряд белковых продуктов, таких, например, как Сlk2. Соответствующий ген был обнаружен у С. elеgans; его мутация вызывает увеличение продолжительности жизни нематоды. Гомологичный ген известен у дрожжей под названием Те12. Оба эти гена кодируют белки, регулирующие длину теломер, хотя молекулярные механизмы их действия остаются пока неясными.

Среди других генов, влияющих на скорость старения модельных животных ген. daf-2 С. е1еgans, мутация которого может сопровождаться увеличением средней продолжительности жизни в несколько раз, а мутация гена Inr – гомолога daf-2 у дрозофилы – увеличивает продолжительность жизни мухи на 85 %. Оба гена кодируют рецепторы инсулиноподобных лигандов. Явление увеличения продолжительности жизни при ограничении калорийности питания известно давно, но идентификация рецепторов инсулина и/или инсулиноподобных факторов роста как части стоящего за этим феноменом механизма на молекулярном уровне только начато. Предполагают, что существует нейроэндокрннная система регуляции жизненного цикла животных, и она увеличивает продолжительность жизни особи при недостатке питания.

Возможность участия теломер в этой системе пока изучена недостаточно. По меньшей мере, некоторые из ее компонентов появились еще у одноклеточных. Например, продолжительность жизни материнских клеток почкующихся дрожжей зависит от присутствия питательных веществ. В регуляции жизненного цикла калорийностью питания каким-то образом участвует ассоциированный с теломерами ген Sir2. Следует также заметить, что у животных рецепторы инсулина и факторов роста могут контролировать теломеры через танкиразу. С другой стороны, короткие теломеры могут передавать информацию о своем состоянии на сигнальный путь, начинающийся от рецепторов факторов роста и ведущий к танкиразе. Показано, что р53 регулирует передачу сигнала от указанных рецепторов через адапторный белок р66Shс. Мутации в генах р53 и р66Shс могут приводить к изменению продолжительности жизни мышей.

5.8. Теломеры и рак

Рак – еще одна проблема прикладного характера, решение которой также связано с функционированием теломер. Клеточное старение считают одним из барьеров на пути развития раковых опухолей. В результате злокачественной трансформации соматические клетки приобретают ряд свойств, в норме им не присущих, в том числе способность к неограниченной и нерегулируемой пролиферации. У них начинается экспрессия теломеразы, или длина теломер поддерживается на стабильном уровне каким-либо альтернативным механизмом. Значительная часть описанных к настоящему времени онкобелков и опухолевых супрессоров либо участвует в регуляции теломер, либо передает сигналы об их состоянии. Среди таких белков р53, Rb, АТМ, NBS1, а также Ras и другие онкобелки сигнального пути Ras-МАРК, который контролирует танкиразу и опосредует митогенную активность Src и других тирозинкиназных рецепторов.

Глава 6. Клеточный цикл у эукариот

6.1. Понятие о клеточном цикле

Молекулярные процессы, происходящие во время репликации ДНК, в основном похожи у эукариот и прокариот. Тем не менее, существуют и различия. Во-первых, репликация ДНК у эукариот происходит на определенной стадии клеточного цикла. Во-вторых, если бактериальная хромосома представляет собой единицу репликации – репликон, то репликация ДНК эукариотической хромосомы осуществляется посредством разделения ее на множество отдельных репликонов. По эукариотической хромосоме в каждый момент времени может двигаться независимо друг от друга множество репликативных вилок. Остановка продвижения вилки происходит только при столкновении с другой вилкой, движущейся во встречном направлении, или по достижении конца хромосомы. В результате вся ДНК хромосомы в короткий срок оказывается реплицированной.

Клеточные циклы эукариот качественно не различаются у разных видов и в клетках разных тканей одного вида. Замечены различия, главным образом, в длительности цикла. Среди высших эукариот некоторые клетки делятся каждые 10 мин, другие каждые 3 ч, третьи – 200 ч.

6.2. Стадии клеточного цикла

Клеточный цикл большинства соматических клеток высших эукариот подразделяют на 4 стадии: G1 (gap1, предсинтетический период, или период подготовки к синтезу ДНК), S (synthesis, период синтеза ДНК), G2 (дар 2, постсинтетический период подготовки к клеточному делению) и М (mitosis, собственно процесс клеточного деления). Иногда выделяют G0 – стадию между М и G1 или стадию покоя. В культуре клеток человека весь цикл занимает примерно 24 ч, при этом на стадии G1, S, G2 и М приходится 10, 9, 4 и 1 ч соответственно. Фазы G1, S и G2 вместе составляют интерфазу

Наиболее подробные сведения получены при изучении клеточных циклов дрожжей. Данные генетических и молекулярных исследований показали, что клеточные циклы включают ряд этапов, на которых осуществляется контроль продвижения клетки от одной фазы к другой – точки проверки или чекпойнты (checkpoints). Первая стадия проверки у дрожжей называется START, у млекопитающих – G1-checkpoint. Если клетка не выросла до необходимых размеров и окружающая среда недостаточно богата_; клетка будет оставаться в G1, т. е. не будет получено сигнала для начала синтеза ДНК (S-фазы).

В S-фазе разные участки генома реплицируются в разное время. В культуре клеток человека сначала синтезируется ДНК, которая выявляется в обогащенных генами R-бэндах метафазных хромосом. В конце S-фазы синтезируется ДНК G-бэндов. Полагают, что между этими отрезками S-фазы также существует стадия проверки (проверка целостности ДНК, checkpoint DNA intregritу).

Стадия проверки G2 находится на границе G2 и М. Если не завершилась репликация всей ДНК, если клетка не выросла до нормальных для этой фазы размеров и окружающая среда недостаточно хороша, клетка не способна перейти к стадии М.

Третья проверка происходит в течение фазы М: чтобы началось разделение хроматид, хромосомы должны быть надежно прикреплены к нитям митотического веретена. Схема клеточного цикла дана на рис. 29.

Нарушения регуляции клеточного цикла и чекпойнт-контроля часто приводят к геномной нестабильности и предрасположенности к возникновению опухолей. Понимание молекулярных механизмов, которые регулируют эти процессы важно как для прикладной медицины, так и для фундаментальных научных исследований. Клеточный цикл проходит одинаково во всех эукариотических клетках, поэтому изучение его у различных модельных организмов создает общее понимание того, как различные события клеточного цикла контролируются и координируются у человека.

Рис. 29. Схема клеточного цикла эукариот.

Успешное деление зависит от того, насколько высоко скоординированно прошли удвоение и сегрегация клеточных компонентов. Осуществления событий клеточного цикла координируется и контролируется сложно регулируемыми протеинкиназами, известными как циклин-зависимые киназы (cycline-dependent kinases, Cdks).

6.3.Регуляция клеточного цикла у эукариот

Различные клеточные процессы, необходимые для успешной репликации и деления клеток, управляются последовательной активаций и дезактивацией семейства циклин-зависимых киназ (Cdks). Активация Cdks преимущественно управляется периодической экспрессией циклинов и нуждается в активирующем фосфорилировании киназы. Инактивация контролируется во-первых, ингибирующим фосфорилированием киназ, во-вторых убиквитин-опосредованной деградацией циклинов и в-третьих – взаимодействием всего комплекса с малыми белками-ингибиторами.

Основные принципы, положенные в основу регуляции прохождения клетки по циклу таковы:

1) Активация Cdks управляется последовательно экспрессией и объединением с циклинами;

2) Активность каждой пары Cdk-циклин необходима для активации последующей;

3) Разрушение циклинов приводит к однонаправленному клеточному циклу;

4) Ингибирование комплексов Cdks-циклины путем фосфорилирования или путем связывания с белками-ингибиторами задерживает активацию Cdks и замедляет движение клетки по циклу в неблагоприятных условиях.

Рис. 30.Экспрессия циклинов втечение клеточного цикла.

Как это следует из названия, Cdks являются протеин-киназами, которые для своей активации должны связаться с соответствующими циклинами. Процесс синтеза и деградации циклинов высоко координирован, в то время как основной уровень контроля активности Cdks заключается в периодичности присутствия или отсутствия циклиновой субъединицы. Сравнение динамики экспрессии различных циклинов в течение клеточного цикла показано на рис. 30.

Если покоящиеся клетки стимулировать к вхождению в клеточный цикл ростовыми факторами, то первым будет экспрессирован циклин D, который может объединяться с Cdk4 или Cdk6. Этот комплекс входит в ядро, где фосфорилирует белок ретинобластомы Rb и два других покет-белка р107 и р130. Фосфорилирование Rb приводит к высвобождению семейства транскрипционных факторов E2F, активирующих транскрипцию генов, вовлеченных в процесс репликации ДНК, и таким образом способствует экспрессии белков, необходимых для G1 и S-фаз клеточного цикла. Схема работы белка Rb показана на рис. 31.

Тот же митогенный сигнал, который вызвал экпрессию циклина D, также вызывает и экспрессию второго циклина – Е и двух ингибиторов Cdks – р21^cip1 и р27^kip1. Экспрессия белков-ингибиторв в тот момент, когда клетка входит в новый цикл роста и деления, кажется контрпродуктивной. Тем не менее, р21 и р27 связываются с коплексом циклин D-Cdk4, не ингибируя его киназную активность, и на самом деле оказываются необходимыми для создания этого комплекса и его транспорта в ядро. Напротив, р21 и р27 являются эффективными ингибиторами активности комплекса циклин Е-Cdk2. Таким образом, присутствие этих белков в ранней G1-фазе способствует образованию комплексов циклин D– Cdk4 и, в то же время, задерживает активацию циклин Е-Cdk2 комплексов.

Циклин Е-Cdk2 взаимодействует с циклин D-Cdk4/6 в фосфорилировании и инактивации Rb и покет-белков. Двойное фосфорилирование Rb необходимо для полной активации транскрипционной программы S-фазы. После этого с какого-то момента, называемого точкой рестрикции (restriction point) движение клетки по циклу происходит независимо от внеклеточных сигналов. Внутренние или внешние события могут замедлить или предотвратить продвижение клетки по циклу, но если никакого останавливающего это движение сигнала получено не будет, то инициированный клеточный цикл, включая рост, репликацию, сегрегацию и деление клетки, будет продолжаться сам по себе без дальнейших внеклеточных посылов.

Рис. 31.Роль бкелка Rb в регуляции клеточного цикла.

Активация циклин Е-Cdk2 ведет к инициации репликации ДНК, причем описано большое число белков, необходимых для осуществления задачи удвоения и сегрегации клеточного содержимого. Циклин Е-Cdk2 также фосфорилирует белок-ингибитор р27. Это делает р27 мишенью для распознавания убиквитин-лигазой, а убиквитинированная форма белка затем идет путем протеосомной деградации. Таким образом, циклин Е-Cdk2 включает диструкцию своего отрицательного регулятора. Циклин Е-Сdk2 также сам фосфорилирует свою циклиновую субъединицу (циклин Е), что тоже делает его мишенью для деградации. Это свойство подготавливать к деградации как ингибитор, так и сам циклин, делает киназный комплекс одновременно самоактивирующим и самоограничивающим.

Циклин А экспрессируется сразу же после циклина Е на границе G1 и S фаз. Активность обоих комплексов – циклин Е-Cdk2 и циклин А-Cdk2 необходима для инициации и правильного протекания ДНК-репликации, а также для гарантии того, что репликация ДНК инициируется и проходит в течение каждого клеточного цикла только один раз. К тому же циклин А-Cdk2 способствует эффективному протеканию S-фазы, повышая транскрипцию гистоновых и других генов, необходимых для согласованной репликации.

После роста и удвоения клетка оказывается перед необходимостью делиться на две жизнеспособные дочерние клетки. Все завершается митозом, который начинается профазой с конденсацией хромосом и формированием веретена деления. В прометафазе микротрубочки веретена прикрепляются к кинетохорам двух сестринских хроматид, а оболочка ядра растворяется. Если все произошло правильно, то в анафазе веретено деления растаскивает сестринские хроматиды в разные стороны. Вслед за разделением удвоенного генома в телофазе деконденсируются хроматиды и начинают образовываться новые ядерные оболочки. Наконец, при цитокинезе образование двух дочерних клеток завершается разделением цитоплазмы. Эти драматические морфологические изменения происходят под контролем Cdk1 (Cdc2), ассоциированной с циклинами А и В. Экспрессия циклина В запаздывает по отношению к экспрессии циклина А, возрастая в поздней S-фазе и сохраняя высокий уровень в фазах G2 и М. Так как комплекс циклин В-Cdk1 преимущественно пребывает в неактивной фосфорилированной форме, то постепенное возрастание количества циклина В не сопровождается таким же постепенным возрастанием киназной активности этого комплекса. Дефосфорилирование и активация циклин В-Cdk1 строго коррелирует с морфологическими изменениями, сопровождающими митоз. Ядерные ламины, белки ядрышек, центросомные белки и Eg5 (белок, связанный с движением кинезинов) являются субстратами циклин В-Cdk1 комплекса. Многокопийные органеллы, такие как митохондрии, распределены по цитоплазме равномерно, так, что дочерние клетки наследуют их вероятностно, случайным образом. С другой стороны, органеллы, существующие в единственном числе, такие как аппарат Гольджи, должны быть разделены активно. Cdk1 при ассоциации с другой субъединицей циклина В – В2 и, локализуясь преимущественно в зоне эндоплазматического ретикулума, может играть ведущую роль при диспергировании аппарата Гольджи и гарантировать его разделение при цитокинезе таким образом, чтобы в обеих дочерних клетках оказались компоненты, достаточные для построения заново этого секреторного комплекса. Разные стадии митоза характеризуются очень быстрым и скоординированным исчезновением циклинов А и В. Разрушение митотических циклинов необходимо для того, чтобы гарантировать переход клеток в интерфазу до инициации следующего раунда ДНК-репликации. Это разрушение опосредуется специальным белковым комплексом АРС (anaphase promoting complex).