Текст книги "Репликация ДНК: учебное пособие"

Несмотря на то, что молекулярная структура теломеры была к началу 90-х гг. в основном охарактеризована, сохранилась проблема неполной репликации на конце линейной молекулы ДНК.

Было показано, что укорочение теломер у человека непостоянно и имеет свою возрастную динамику. В первичной культуре фибробластов, растущих in vitro, каждое удвоение количества клеток сопровождается уменьшением теломер на 48 ± 21 пар нуклеотидов, а in vivo теломеры фибробластов человека в среднем укорочиваются примерно на 75 пн за один акт митоза. Теломеры периферических клеток крови детей до 4 лет теряют более 1000 пн в год, в возрасте от 4 до 20 лет укорачиваются все медленнее, а в зрелом и пожилом возрасте их длина падает с практически постоянной скоростью около 30–60 пн ежегодно. Критическая длина теломер фибробластов человека, при которой наступает репликативное старение (торможение и полное прекращение пролиферации), не более 5–7 тпн.

Длины теломер у разных видов, разных особей в популяции любого вида, в разных клетках одного и того же организма и даже на разных хромосомах одной и той же клетки или на разных плечах одной и той же хромосомы могут различаться в несколько раз. Обычно длина теломеры составляет от нескольких тысяч до нескольких десятков тысяч пар оснований. Одна из нитей теломерной ДНК всегда длиннее комплементарной нити и формирует участок 3'-концевой однонитевой ДНК, длина которого может превышать двести нуклеотидов.

В 1985 г. Грейдер и Блэкберн выяснили, что природа выработала механизм удлинения (элонгации) самого конца хромосомы, т. е. теломерного концевого повтора. Это связано с активностью особого фермента – теломеразы. Теломераза является рибонуклеопротеидом, она содержит короткую молекулу РНК (примерно 150 нуклеотидов), в составе которой присутствуют 2 копии теломерного повтора 5'-СААССС-3'.

Перед началом репликации ДНК теломераза добавляет несколько копий теломерных повторов к 3'-концу ДНК. После этого репликация идет в обычном порядке. На отстающей нити синтезируются РНК-праймеры, при этом самое важное то, что концевой праймер синтезируется на досинтезированном теломеразой теломерном повторе. После завершения репликации остается незаполненным только участок РНК-праймера, синтезированного именно на этом участке теломерной последовательности. В результате дочерние нити ДНК получаются той же длины, что и родительские.

Механизм работы теломеразы на примере инфузории тетрахимены может быть описан следующим образом, как это показано на рис. 24. Теломераза обладает своей молекулой РНК, имеющей матричный участок, с помощью которого фермент распознает теломерный повтор. Последовательность 5'-СААССССАА-3' в составе молекулы теломеразы спаривается с последовательностью теломерного повтора 5'-ТТGGGG-3'. Нуклеотиды ААС в РНК теломеразы остаются неспаренными, и на них достраиваются ТТG. Фермент перемещается на самый конец теломерной последовательности, т. е. на всю длину ТТGGGGТТG, и нуклеотиды ААС из молекулы теломеразной РНК спариваются с ТТG теломерной ДНК, после чего достраивается вся последовательность повтора. Интересно, что теломераза, по-видимому, избирательно удлиняет наиболее короткие теломеры.

Рис. 24. Работа теломеразы у инфузории тетрахимены.

Теломеры в клетках зародышевого пути благодаря постоянно высокой активности теломеразы сохраняют нормальную длину. Однако в соматических клетках, культивируемых in vitro, теломераза неактивна, и теломеры постоянно укорачиваются. Этим можно объяснить существование лимита Хейфлика. В раковых клетках, которые также являются соматическими, клеточные деления не прекращаются. Оказалось, что почти во всех образцах опухолевых клеток, взятых как из культуры, так и из целого организма, активность теломеразы сохраняется на высоком уровне.

В последнее время накапливаются данные о том, что нарушения в механизме удлинения теломерного повтора не только непосредственно связаны с формированием злокачественных новообразований, но также играют важную роль в процессе клеточного старения. Искусственное удлинение теломер путем экспрессии теломеразы позволяет предотвратить клеточное старение и получить иммортализованную клеточную линию. Так же преодолевают старение спонтанно иммортализуюшиеся опухолевые клетки: они либо начинают экспрессировать теломеразу, либо поддерживают на стабильном уровне длину теломер альтернативными способами. В ряде случаев прекратить рост культуры раковых клеток можно ингибируя теломеразу.

5.4. Белки теломерного комплекса у человека

Для того, чтобы выполнять все многочисленные функции по поддержанию геномной стабильности, теломерная ДНК должна функционировать в комплексе с определенными специфическими белками. Лучше всего они к настоящему времени изучены у человека.

Два главных белка, способных специфически связываться с теломерным повтором ДНК получили названия TRF1 и TRF2 (Теlomeric repeat binding protein 1 и 2) У человека эти белки способствуют образованию гигантской теломерной петли (t – loop), размеры которой у человека сопоставимы с размерами теломер.

Первое сообщение о белке TRF1 было опубликовано в 1992 г. В 1997 была определена его аминокислотная последовательность и показано, что есть два несколько различающихся по размеру белка, являющихся продуктами альернативного сплайсинга. Меньший получил название Pin1. Доменная структура ТRF1-2 и устройство t – петли схематически представлена на рис. 25. На С-конце этой молекулы имеется ДНК-связывающий домен типа Муb. Для того, чтобы белок взаимодействовал с нуклеиновой кислотой, необходима его олигомеризация, для которой служит ТRF-домен. По данным электронной микроскопии, тетрамер ТRF1 с высокой специфичностью связывает до 12 теломерных повторов ДНК позвоночных, но не теломер растений или нематоды. В насыщающей концентрации этот белок покрывает теломеры как сплошная оболочка 10-нм толщины. Каждая молекула ТRF1 изгибает ДНК под утлом около 120⁰. В последовательности ДНК белок связывает два сайта 5'-YTАGGGТТR-3', которые могут быть расположены на разном расстоянии и под разным углом, в связи с чем предполагается, что ДНК-связывающие участки ТRF1 связаны с остальной частью белковой молекулы регионами, обладающими повышенной эластичностью. При этом ТRF1 не связывается с однонитевой ДНК, расположенной на конце теломер человека.

Рис. 25. Схема строения t-петли и белков TRF1,2 у человека

Белок ТRF2 был найден в конце 90-х годов. По структуре он сходен с ТRF1, но ТRF домен последнего не взаимодействует с гомологичным доменом второго представителя данного семейства, так что оба белка в клетке могут существовать в виде гомо-, но не гетеродимеров. У ТRF2, как и у ТRF1, в результате альтернативного сплайсинга образуются два варианта. На теломерах белок ТRF2 связывается в существенно меньшем количестве, чем ТRF1. С помощью электронной микроскопии была уточнена область теломеры, в которой концентрируется этот белок. Оказалось, что ТRF2 расположен в узле, образующемся в точке касания однонитевого G-конца теломер со «стволом». Тогда же впервые было обнаружено, что подавление ТRF2 может приводить к активации АТМ/р53-зависимого пути ответа клетки на повреждение ДНК и затем к апоптозу, поскольку незащищенные t-петлей (развернутые) концы хромосом подобны двунитевым разрывам ДНК и так воспринимаются клеткой.

Теломерные петли были обнаружены на хромосомах клеток НеLа, периферических лейкоцитов человека, первичных клеток печени мыши, а также на теломерах трипаносом и на микроядерных, но не макроядерных хромосомах инфузории Oxitricha. Размеры t-петель в клетках человека составляют от 5 до 40 тпн. У трипаносом t-петли сравнительно небольших размеров, около 1 тпн, хотя теломеры у этих простейших и у человека сравнимы по длине. По-видимому, это минимальные размеры t-петель, обнаруженных на сегодняшний день.

Для связывания ТRF2 на конце хромосомы необходим однонитевой участок теломерной ДНК длиной не менее одного повтора из шести нуклеотидов ТТАGGG. Наличие более одного повтора в однонитевом участке улучшает связывание. Добавленный в избытке этот белок связывается на теломерах в количестве не менее трех, а в среднем около десяти димеров.

Предполагают, что в этом участке 3'-концевая однонитевая ДНК гибридизована с антипараллельной нитью частично расплетенной двойной спирали «ствола», так что образуется так называемая d-петля (displacement 1оор), или соединение подобное структуре Холлидея. Строение t-петли подробно показано на рис. 26.

Открытие и изучение теломерных белков дало дополнительную информацию о роли теломер в регуляции клеточного старения.

В функциональных исследованиях белков ТRF выяснилось, что резкое увеличение концентрации ТRF1 при его экспрессии под вирусным промотором в культуре клеток приводит к преждевременному вступлению в митоз и последующей гибели клеток. В аналогичных условиях ингибирование ТRF1 в клетках, экспрессирующих теломеразу, сопровождается медленным увеличением длины теломер. Очевидно, ТRF1, способствуя образованию t-петли, тем самым препятствует удлинению теломер за счет теломеразной активности.

Рис. 26. Строение t-петли у человека

Совсем иначе проявляются последствия экспериментального воздействия на белок ТRF2. Его подавление с помощью доминантно негативных делеционных мутантов приводит к морфологическим изменениям в строении модельных клеток, напоминающим старение и к индукции в них характерных для клеточного старения молекулярных маркеров, а также к немедленному и необратимому прекращению пролиферации. Концы хромосом в этих клетках часто сливаются концами и образуют кольцевые структуры, хотя и не теряют теломерные повторы. Одновременно на концах уцелевших теломер исчезают однонитевые участки, хотя активность теломеразы не изменяется. Таким образом, не теломеры сами по себе защищают хромосомы от нуклеаз, слияния и последующих разрывов при митозе. Это функция белка ТRF2.

Увеличение концентрации ТRF2 в первичной культуре фибробластов сопровождается некоторым возрастанием скорости укорочения теломер в ходе старения клеточной популяции. В то же время этот эффект не приводит к преждевременному старению: напротив, в ходе эксперимента клетки продолжают пролиферировать, когда контрольная культура уже прекращает расти. Пороговая для репликативного торможения пролиферации длина теломер у контрольных клеток составляет 6–7 тпн. У экспериментальной культуры, экспрессирующей большое количество ТRF2, эта точка на 2–2,7 тпн ниже, что позволяет им пройти еще около 15 делений, прежде чем наступает старение. Более того, в клетках с критически короткими теломерами, сенильных или мутантных по р53 и Rb, повышенная экспрессия ТRF2 предотвращает слияния и разрывы хромосом. Полученные данные можно интерпретировать следующим образом: не длина теломер важна для индукиии клеточного старения, а их состояние, связанное с защитной функцией белка ТRF2. Например, сенильные теломеры могут быть недостаточно длинными для защиты конца хромосомы в узловой точке t-петли, но когда концентрация ТRF2 повышена, то вероятность образования нормальной t-петли возрастает.

Известно, что онкобелки некоторых вирусов позволяют соматическим клеткам преодолеть пролиферативные барьеры и делиться бесконечно долго. В экспериментах на первичной культуре фибробластов было показано, что ингибирование ТRF2 не только приводит к фенотипическим изменениям, характерным для старения, как это ранее наблюдалось на клетках фибросаркомы, но также сопровождается характерными для старения генетическими изменениями. В частности, экспрессия доминантно негативного аллеля ТRF2 сопровождается частым слиянием хромосом, формированием во многих клетках более двух центросом и тетраплоидного кариотипа. После ингибирования ТRF2 в клетках активирован р53, гипофосфорилирован Rb, увеличена концентрация р16 и понижен уровень циклина А, что характерно для клеточного старения. Одновременная инактивация р53 и Rb при помощи Т-антигена вируса SV40 и другими способами предотвращает старение экспериментальных клеток, вызванное ингибированнем ТRF2.

Рис. 27.Роль t-петли в индукции клеточного старения и апптоза

Эти эксперименты вновь указывают, что белки р53 и Rb, индуцирующие старение, могут быть активированы теломерами, когда те развернуты и не защищены белком ТRF2. Схема взаимодействия этих белков представлена на рис. 27.

Интересно, что р5З имеет повышенное сродство к однонитевому участку теломер, к узловому региону t-петли и даже несколько повышает вероятность образования t-петли в присутствии ТRF2.

Уточнение состава теломерного нуклеопротеидного комплекса и выяснение роли теломерных белков в индукции клеточного старения позволяет перейти к исследованию естественных регуляторов состояния теломер. Кроме уже известной теломеразы, за последние годы было найдено еще несколько белков, которые могли бы играть подобную роль.

Хотя влияние ТRF2 на теломеры в условиях эксперимента проявляется наиболее отчетливо, его модуляторы практически неизвестны. Лишь белок hRap1 (repressor-activator protein) был недавно идентифицирован как партнер ТRF2, преимущественно связываемый на теломерах, хотя он может также взаимодействовать с некоторыми другими участками хромосом. Зато активность белка ТRF1, относительно мягко изменяющего длину теломер, может регулироваться in vivo несколькими различными способами.

Например, ТRF1 может быть поли-АDР-рибозилирован, что сопровождается его диссоциацией от ДНК. Эту посттрансляционную модификацию катализирует танкираза (теломерная анкириновая полимераза поли-АDР-рибозы), белок, проникающий в ядро и в неактивном состоянии связанный с TRF1. После активации танкираза подвергает поли-АDР-рибозилированию себя и ТRF1, что приводит к распаду теломерного нуклеопротеидного комплекса и высвобождению теломер. В результате теломеры становятся доступными для теломеразы и других ферментов. Из-за этого танклразу считают позитивным регулятором теломеразы.

У человека и позвоночных животных имеется два изозима танкиразы, несколько различающихся по молекулярной массе (142 и 127 кДа в немодифицированном состоянии), называемые ТNKL или танкираза 1 и ТNKS или танкираза 2. Кроме энзиматического домена, гомологичного соответствующему домену РАRР, у танкиразы имеется большой анкириновый домен, состоящий из 24 повторов, а также SАМ-домен, участвующие в различных белок-белковых взаимодействиях. У танкиразы 1 в отличие от танкиразы 2 имеется также дополнительный N-концевой домен, функция которого до сих пор не ясна. Ни одна из танкираз не имеет собственного сигнала ядерной локализации, поэтому большая часть фермента находится в цитоплазме. Здесь танкираза подвергается фосфорилированию и активации МАР-киназой, хотя пока остается неясным, переносится ли активированный фермент в ядро, или ядерный пул танкиразы активируется МАР-киназой, которая, как известно, сама может быть транслоцирована из цитоплазмы в ядро. МАР-киназа через сигнальный путь Ras-МАРК регулируется инсулином и факторами роста; поэтому следует предположить, что с помощью танкиразы организм держит теломеры всех клеток под контролем гормонов.

Активность ТRF1 может быть увеличена за счет возрастания его концентрации, которая наблюдается на поздних стадиях клеточного цикла перед митозом. По-видимому, ТRF1 необходим для упаковки митотических хромосом, так как экспериментальное увеличение его концентрации, как уже отмечалось выше, провоцирует преждевременный вход в митоз. Для предотвращения вступления в митоз, например, когда ДНК нуждается в репарации, ТRF1 может быть фосфорилирован протеинкиназой АТМ; той же самой протеинкиназой, которая активирует р53 и индуцирует апоптоз и клеточное старение по р53-зависимому механизму. Если в клетках больных АТ (у которых отсутствует активная АТМ) ингибировать ТRF1, то они смогут поддерживать нормальную длину теломер, которые обычно укорачиваются существенно быстрее, чем в клетках здоровых людей.

Недавно был найден еще один теломерный белок, взаимодействующий с ТRF1, который получил название TINF2 или ТIN2 (ТRF1 intracting nuclear factor 2). Его молекулярная масса около 40 кДа и по структуре он напоминает белки ТRF, так как на его С-конце также расположен ДНК-связываюший домен типа Муb. Как и ТRF1, этот фактор способствует укорочению теломер и негативно регулирует активность теломеразы. Например, если в контрольной культуре иммортализованных фибробластов средняя длина теломер в ходе эксперимента через 43 удвоения популяции уменьшалась от 6,4 тнп до 5,7 тпн, то при высоком уровне экспрессии TINF2 длина теломер падала до 5 тпн. В том же эксперименте ингибирование ТINF2 путем экспрессии его доминантно негативного мутанта, напротив, привело к удлинению теломер до 9 тпн. Считается, что ТINF2 опосредует действие ТRF1.

Механизм действия ТRF1 на теломерах вряд ли заключается только в закручивании ДНК в суперспираль и облегчении последующего образования t-петли, как было указано ранее. Благодаря взаимодействию с множеством регуляторных белков, ТRF1 может концентрировать их в области теломер. В частности, ТRF1 связывает мощный ингибитор теломеразы, белок РinX1, который действует непосредственно на фермент, в отличие от остальных ранее упоминавшихся модуляторов, влияющих на доступность субстрата теломеразы, т. е. теломер. Совсем недавно был обнаружен еще один теломерный белок, связывающийся на ее однонитевом участке, Роt1. Вероятно, функция этого 71 кДа полипептида состоит в защите особенно уязвимой со стороны нуклеаз, облучения и химических агентов однонитевой ДНК, чем и объясняется его название (рrotection of telomeres, РОТ). Роt1 взаимодействует с ТRF1. Предполагают, что, влияя на связывание Роt1, белок ТRF1, концентрация которого пропорциональна длине теломер, передает на однонитевые концы информацию об общей протяженности теломерной ДНК.

Возможно, упомянутыми здесь белками список различных компонентов теломерного нуклеопротеидного комплекса, называемого также телосомой, не исчерпывается. В следующем разделе будут приведены дополнительные данные, указывающие на наличие еще не исследованных теломерных белков и белков, ассоциированных с теломерами структурно и/или функционально.

Параллельно с работами на клетках человека развивались исследования и на модельных организмах. Примечательно то, что лишь у некоторой части теломерных белков других эукариот в геноме человека имеются гомологи, функции которых известны на сегодняшний день.

Вслед за открытием белков семейства ТRF у человека гомологичный им белок Таz1 был найден у делящихся дрожжей Scizosaccahoromyces pombe. Кроме того, по структуре подобные ТRF теломерные белки с ДНК-связывающим доменом типа Мyb найдены у табака и некоторых других растений. Характерный для этого семейства домен типа Мyb, связывающий теломеры, предложено именовать телобоксом. Дрожжи S.cereviseae отличаются от Scizosaccahoromyces pombe отсутствием теломерного белка семейства ТRF. Теломерный белок S.cereviseae Tbf1, в структуре которого обнаружен телобокс, за пределами ДНК-связываюшего региона не имеет гомологии с белками ТRF человека и не может быть отнесен к этому семейству. Столь же уникальна структура белка ТINF2 (TIN2) человека. У него есть телобокс, но ни у дрожжей, ни у каких-либо еще модельных организмов, за исключением мышей, его гомологи не найдены.

Белок человека hRap1 (Repressor-activator protein), связывающийся на теломерах через ТRF2, и его дрожжевой гомолог scRap1 также имеют ДНК-связываюший домен типа Мyb, но не один на субъединицу, а два, и их сходство с телобоксом считают недостаточным для объединения белков Rар в один класс с другими теломерными белками. Белок scRap у пекарских дрожжей связывается непосредственно на ДНК, а не так, как его гомологи у S.pombe — через sрTaz1, или у человека – через белок ТRF2. Дрожжевой Rap1 изучают уже много лет. Известно, например, что этот белок, связываясь на теломерах, привлекает сюда белки семейства Sir (silent information regulator), контролирующие активность генома и образование гетерохроматина, а также белки семейства Rif (Rар interacting factor), контролирующие длину теломер.

Белки Sir, многочисленные и у дрожжей, у млекопитающих значительно эволюционировали. Один из дрожжевых представителей этого семейства, Sir2 (Sirt2), имеет не менее семи гомологов в геноме человека. Связываясь на теломерах дрожжей, Sir2 инициирует образование гетерохроматина и подавление активности прилегающих к теломерам генов, взаимодействуя с SirЗ и Sir4, гомологи которых у человека пока не найдены. У млекопитающих до сих пор не найдены гомологи дрожжевых белков Rif. Хотя в геноме человека предположительно имеются гены, кодирующие белки, функционально подобные Rif, их активность пока не охарактеризована.

Рис. 28. Белки теломерного комплекса у дрожжей.

Белки Sir проявляют энзиматическую активность, деацетилируя гистоны, т. е. являются гистоновыми деацетилазами. В регуляции активности генома также участвуют гистоновые ацетилазы, в том числе и в районе теломер. Другие ферменты, участвующие в посттрансляционной модификации гистонов, например, дрожжевые метилтрансферазы, такие как Set1 и Dot1, также представлены в районе теломер и имеюют гомологи у человека. Set1/СОМРАSS – мультибелковый комплекс, состоящий, как минимум, из семи компонентов разного типа. Показано, что один из этих компонентов (YAR003) участвует в регуляции Rb, однако полностью функции этих белков еще не охарактеризованы. Dot1 – метилтрансфераза, которая не имеет домена Set, и регулирует, в частности, связывание белка SirЗ на теломерах дрожжей.

Танкираза, один из регуляторов ТRF1, у дрожжей не обнаружена, но гомологи генов танкиразы человека присутствуют в геномах дрозофилы, нематоды и других животных. По-видимому, эволюция танкираз происходила в пределах царства животных; при этом в геномах беспозвоночных найдено лишь по одному гомологу танкиразы. в то время как у позвоночных имеется по два таких гена.

У S.pombe имеется ортолог белка Роt1 человека. В то же время у S.cereviseae белок, связывающий однонитевую часть теломерной ДНК, Сdс13, как и многие другие теломерные белки пекарских дрожжей, не гомологичен функционально сходному белку человека и S.pombe, хотя в его вторичной пространственной структуре и наблюдается некоторое подобие белка Роt1. На рис. 28 приведено строение теломерного комплекса у дрожжей.

Из представленного материала достаточно очевидно, что не всегда правомерно проводить параллели между строением теломерного нуклео-протеидного комплекса у человека и у модельных организмов, особенно S.cereviseae. Эволюция почкующихся дрожжей явно пошла в ином направлении, чем у одноклеточных, от которых произошли Меtazoa.