Текст книги "Репликация ДНК: учебное пособие"

В ходе процессинга фрагментов Оказаки, равно как и в процессе репарации ДНК, в качестве промежуточных продуктов реакции возникают структуры ДНК, имеющие свисающий 5'-конец (флэп). Главная причина появления таких структур – активность Ро1δ, обеспечивающая синтез с вытеснением цепи («strand-displasment»). Основным ферментом, выщепляющим флэп-структуры, является флэп-эндонуклеаза-1 (FEN-1). Предполагается, что при выщеплении таких структур FEN-1 взаимодействует с различными белками, в том числе с RРА и PCNA. Количественная оценка связывания RРА и FEN-1 с ДНК отчетливо показала конкуренцию RРА с FEN-1 за флэп-структуры протяженного размера, так как относительно длинный флэп позволяет RРА находиться в вытянутой конформации и обеспечить эффективное связывание с ДНК за счет всех его ДНК-связывающих доменов. Это может указывать на возможность ингибирования активности FEN-1 RРА. В тоже время связь с короткими флзпами у глобулярной конформации RPA не столь велика, что позволяет преиммуществено связыаваться с ними FEN-1.

ДНК-лигазы соединяют нити ДНК при репликации, репарации и рекомбинации. Все известные лигазы способны образовывать фосфодиэфрные мостики между 5'-фосфорильной и 3'-гидроксильной группами соседних дезоксинуклеотидов в местах разрывов ДНК. Лучше всего описана ДНК-лигаза, индуцируемая в Е. соli после заражения клетки фагом Т4 (Т4-лигаза). Она обладает уникальной способностью соединять двунитевые фрагменты ДНК по концам разрыва. Физиологическая роль этой реакции неизвестна, но практическое ее значение в манипуляциях с рекомбинантной ДНК неоценимо.

ДНК-лигазы некоторых бактерий, бактериофагов и млекопитающих выделены и их структура и механизм каталитической активности установлены. ДНК-лигазы Е. coli, фагов Т4 и Т7 являются одиночными полипептидами, а тонкая структура ДНК-лигаз млекопитающих неизвестна. Для образования фосфодиэфирных связей между соответствующими концами нуклеотидных цепей лигазы используют энергию гидролиза либо АТР, либо его производного – никотинамид-адениндинуклеотида Реакция протекает в несколько этапов, как это показано на рис. 17. Аденилильная единица переносится на Е-аминогруппу лизинового остатка лигазы с одновременным высвобождением никотинамид мононуклеотида или неорганического фосфата соответственно; затем аденилильная группа переносится от лигазы на 5'-фосфорильную группу концевого остатка цепи ДНК с образованием пирофосфосфатного производного, аденилил-ДНК и замешается 3'-гидроксильной группой прилегающего конца ДНК. В результате этих реакций происходит образование фосфодиэфирных связей в цепи ДНК за счет энергии гидролиза пирофосфосфатной связи NАD+ или АТР. Для образования фосфодиэфирной связи во всех случаях, кроме лигазы фага Т4, должно произойти соединение нуклеотида, содержащего акцепторную 3'-гидроксильную группу, с соседним нуклеотидом, несущим активированную 5'-фосфатную группу. ДНК-лигазы Е. соli и фага Т4 могут соединять концы двух разных дуплексных фрагментов или разорванные концы цепей линейной или кольцевой ДНК. Таким образом, С помощью ДНК-лигаз могут образовываться и линейные, и кольцевые двунитевые молекулы ДНК.

Рис. 17. Схема работы ДНК-лигазы

У эукариот описано несколько лигаз. Лигаза I необходима для сшивания фрагментов Оказаки и некоторых репарационных реакций, ее уровень коррелирует с пролиферативной активностью, она колокализуется в «фокусах репликации» и соочищается вместе с высокомолекулярным репликативным комплексом. Лигаза II появляется как продукт деградации лигазы III, а лигаза III имеет несколько изоформ, вовлеченных в процессы репарации и рекомбинации. Недавно описана лигаза IV, которая необходима для V(D)J рекомбинации и негомологичного соединения концов ДНК при репарации двунитевых разрывов.

Для осуществления комплементарного копирования цепей двунитевая ДНК должна постепенно раскручиваться. Раскручивание, или расплетание, спирали происходит только в локальном участке репликативной вилки. Раскручивание не является спонтанным процессом, в нем участвуют особые ферменты – ДНК-геликазы (у E.coli это продукт гена dnaВ). Геликазы связываются с белками, инициирующими процесс репликации, а затем переходят на молекулу ДНК. Этот фермент движется по одиночной нити ДНК и, встречая участок двойной спирали, разрывает водородные связи между основаниями, разделяет нити и продвигает репликационную вилку, используя для разделения нитей энергию, высвобождающуюся при гидролизе АТР до АDР.

Рис. 18. Строение гексамера геликазы.

Геликазы часто функционируют в составе комплекса, осуществляющего перемещение репликативной вилки и репликацию раскрученных цепей. Хотя для раскручивания достаточно одного геликазного белка, но для того, чтобы максимально ускорить процесс, несколько геликаз могут действовать совместно. ДНК-геликазы используют энергию АТР для движения вдоль нити со скоростью более 1000 нуклеотидных пар в секунду. Молекулы геликазы образуют гексамер, надевающийся на однонитевую ДНК, как кольцо, причем АТР присоединяются к активному центру каждого мономера последовательно, а не одновременно. Как это происходит, показано на рис. 18. (А. Сборка комплекса на однонитевой ДНК, В – положение геликазы в вилке репликации, С– Структура гексамера).

Разворачивание матрицы в вилке репликации осуществляют две различные ДНК-геликазы, работающие на разных нитях и, соответственно, в разных направлениях. Главная роль принадлежит геликазе отстающей нити.

Процесс раскручивания двойной спирали в репликативной вилке порождает механические и топологические проблемы. В принципе раскручивание линейной двунитевой ДНК может происходить благодаря вращению родительской спирали вокруг собственной оси. Но такое вращение очень длинных цепей ДНК вокруг длинных же осей во внутриклеточном пространстве механически затруднено. При репликации замкнутых кольцевых ДНК раскручивание цепей в вилке создает дополнительные проблемы, По мере раскручивания цепей степень отрицательной сверхспирализации сегментов, находящихся перед вилкой репликации, постепенно уменьшается и в них возникает положительная сверхспирализация. Дальнейшее перемещение вилки вдоль кольца затрудняется и в конце концов блокируется. Это блокирование снимается путем внесения однонитевого или двунитевого разрыва. Тем самым образуется «шарнир», который дает возможность нереплицированному дуплексу, находящемуся перед вилкой, вращаться вместе с ней. Такие разрывы вносятся в ДНК с помощью ферментов, имеющих общее название ДНК-топоизомеразы. Эти ферменты изменяют степень сверхспиральности и тип сверхспирали. У различных организмов идентифицированы топоизомеразы двух основных типов. Одни ферменты, называемые топоизомеразами типа I надрезают одну из двух нитей, в результате чего фланкирующие дуплексные области могут повернуться вокруг интактной цепи, и затем воссоединяют концы разрезанной цепи, как показано на рис. 19. Эта реакция не требует энергии АТР, поскольку энергия фосфодиэфирной связи сохраняется благодаря тому, что тирозиновый остаток в молекуле фермента выступает то в роли акцептора, то в роли донора фосфорильного конца разрезанной нити.

Отмечены два интересных, но, возможно, не связанных друг с другом различия между топоизомеразами I типа у про– и эукариот: во-первых, топоизомеразы I прокариот взаимодействуют с 5'-фосфорильным концом разорванной цепи, а эукариот– с 3'-фосфорильным концом, а во-вторых, топоизомеразы I прокариот устраняют только отрицательные сверхвитки, а эукариотические – как отрицательные, так и положительные.

Топоизомеразы II типа устраняют как отрицательные, так и положительные сверхвитки. В отличие от топоизомераз I типа, топоизомеразы II вносят временные разрывы в обе комплементарные нити, пропускают двунитевой сегмент той же самой или другой молекулы ДНК через разрыв, а затем соединяют разорванные концы, как это показано на рис. 20. Топоизомеразы II типа тоже используют тирозиновые остатки (присутствующие по одному в каждой из субъединиц ферментов) для связывания 5'-конца каждой разорванной нити в то время, когда другой дуплекс проходит через место разрыва. В результате внесения двунитевого разрыва и прохождения через него другого дуплекса за одну реакцию снимаются два отрицательных или положительных сверхвитка. В некоторых случаях дуплексом, проходящим через место разрыва, оказывается другая замкнутая молекула ДНК; это приводит к разделению сцепленных кольцевых ДНК или, напротив, к образованию таких сцепленных комплексов (катенанов). Этот механизм может использоваться и для распутывания или запутывания клубков, а также для раскручивания или конденсации крупных дуплексных ДНК.

Рис. 19. Принцип действия топоизомеразы I

Топоизомеразы типов I и II снимают сверхвитки, образующиеся при репликации кольцевой ДНК. Однако существует особая топоизомераза II, называемая гиразой, и обнаруженная пока только у бактерий. Эта топоизомераза способна индуцировать образование отрицательных свсрхвитков в релансированных кольцевых ДНК. Для этого гираза делает двунитевые надрезы и затем особым способом воссоединяет концы, снимая таким образом положительные сверхвитки и внося отрицательные в релаксированную ДНК.

У бактерий топоизомераза I и гираза являются ключевыми ферментами, определяющими степень суперскрученности ДНК при ее ответе на стрессовые внешние воздействия, такие как повышение температуры, изменении рН и оксидативный стресс. Сбалансированное действие топоизомеразы I и гиразы у бактерий регулирует степень сверхспиральности ДНК и влияет на скорость движения репликативной вилки.

Рис. 20. Принцип работы топоизомеразы II

У эукариот ТорII является одним из компонентов клеточного ответа на различные типы повреждений ДНК. Она способна образовывать комплексы с важнейшими регуляторами клеточного цикла, включая Р53, BRCT-содержащий белок TopBP1 и Cdк1-киназу. Ассоциация топоизомеразы II с Cdк1 указывает на начальную раннюю стадию конденсации хроматина в митозе. Регуляция этого взаимодействия, вероятно, является одним из механизмов, влияющих на вступление клеток в митоз. Конденсация хромосом и их сегрегация при переходе в анафазу находятся под контролем белкового комплекса, состоящего из топоизомеразы II и конденсина.

В кроссоверном разрешении холидеевских структур могут принимать участие различные эндонуклеазы, в том числе XPF. При некроссоверном разрешении, при котором также нужны топологические изменения ДНК, их могут проводить RecQ-подобные геликазы вместе с топоизомеразой III. Она так же, как и топоизомераза II, способна генерировать и воссоединять двунитевые разрывы ДНК.

RecQ-подобные геликазы вместе с топоизомеразой III играют важную роль не только в гомологической рекомбинации, но и в других клетчных процессах, таких как репликация и контроль клеточного цикла.

Глава 5. Терминация репликации

5.1. Завершение репликации у E.coli

Последовательности, которые обеспечивают терминацию репликации кольцевой молекулы ДНК у Е. coli, называются ter-сайтами. Они содержат короткую (около 23 пн) последовательность. В участке терминации находится несколько таких ter-сайтов. Они располагаются примерно на 8 тпн дальше точки, в которой встречаются вилки репликации.

Рис. 21. Терминация репликации у E.coli

Для терминации также необходим продукт гена tus, который опознает эту последовательность, связывается с ней и предотвращает дальнейшее продвижение вилки репликации. Схема терминации у Е. coli представлена на рис. 21.

5.2. Завершение репликации у эукариот. Теломеры

К началу 1980-х гг были накоплены факты, свидетельствующие о наличии на концах хромосом особых структур. Метафазные пластинки клеток разных видов демонстрировали видоспецифичные стабильные наборы хромосом. Хромосомы не склеиваются друг с другом концами, что свидетельствует о существовании особой структуры, запрещающей объединение концов.

Еще в 1927 г. Генри Мёллер открыл возможность получения мутаций в результате облучения клеток дрозофилы рентгеновскими лучами. При этом мутации могут быть точковыми или сопровождаться перестройками хромосом (инверсиями, транслокациями, делециями и дупликациями). Перестройки образуются в результате появления разрывов в различных участках хромосом и последующего воссоединения фрагментов в новом порядке. Исследуя закономерности образования хромосомных перестроек, Мёллер в 1932 г. пришел к двум важным выводам о поведении наиболее дистальных частей нормальных хромосом: искусственно образовавшиеся концы фрагментов хромосом объединяются только с такими же искусственно образовавшимися фрагментами и никогда – с концевыми фрагментами, существующими в нормальных хромосомах. В свою очередь, концевые участки нормальных хромосом в результате облучения никогда не перемещаются во внутренние районы хромосом. Для объяснения результатов этих наблюдений Мёллер предположил, что участки хромосом (или «гены», как он их называл), расположенные во внутренних районах хромосом, обладают свойством биполярности, т. е. они могут соединяться с другими фрагментами каждым из двух своих свободных концов. Тот «ген» (или фрагмент хромосомы), который в нормальной хромосоме расположен на самом ее конце, по мнению Мёллера, униполярен, т. е. способен к объединению только с той стороны, которая обращена к внутренней части хромосомы. Мёллер предположил, что этот концевой униполярный «ген» необходим для особой функции «запечатывания конца хромосомы». Такой «ген» был назван специальным термином – «теломера» (от греч. «телос» – конец, «мерос» – часть).

Барбара МакКлинток в 1941 г. на основании полученных ею результатов по индукции хромосомных перестроек у кукурузы пришла к тем же выводам, что и Мёллер и постулировала, что пассивность теломер в объединении с другими участками хромосом играет исключительно важную роль, предотвращая склеивание хромосом конец в конец, а это, в свою очередь, способствует сохранению индивидуальности отдельных хромосом и всего кариотипа в целом.

Молекулярно-генетическое изучение теломер осложняелсь тем, что число их в каждой клетке невелико: по две в каждой хромосоме (другими словами, 46 теломер на 3 х 10⁹ пн генома человека).

В 1978. Элизабет Блакберн (лауреат Нобелевской приемии 2009 г.) и Джон Голл выделили из макронуклеуса инфузории тетрахимены («мешка с генами») фрагмент ДНК длиной 22 тпн, содержащий два сцепленных друг с другом гена рибосомной РНК. Секвенировав этот фрагмент, они определили, что на обоих его концах находится относительно простая последовательность 5'-ССССАА-3' / 3'-GGGGТТ-5', повторенная несколько раз подряд. При этом последовательность ориентирована так, что ТТGGGG-повторы находятся на 3'-конце одной цепи ДНК, в то время как ССССАА-повторы формируют 5'-конец другой цепи. Для удобства первую из цепей называют G-цепью, вторую – С-цепью. На рис. 22 приведено схематичное устройство хромосомы другой инфузории – окситрихи с теломерами (G4T4).

Рис. 22. Схема хромосомы инфузории Окситрихи 1– теломеры, 2– собственно сама хромосома

В последние годы с помощью различных биохимических методик теломеры были выделены из ДНК многих организмов. Оказалось, что у большинства видов животных и растений теломерные районы имеют в целом очень похожее строение. Как правило, в состав теломерного района входят два типа фрагментов: собственно конечная часть хромосомы (или теломерный концевой повтор – telomere repeat, ТR) и последовательность, связанная с теломерой (telomere associated sequence, ТАS), которая располагается проксимальнее.

К настоящему времени известно, что теломерные фрагменты у большинства живых существ очень схожи, они обогащены нуклеотидами G и С, которые располагаются в определенной, похожей у всех организмов последовательности. Несколько отличается структура ТR у некоторых видов грибов и особенно сильно – у дрозофилы. У Saccaromyces cerevisiae сравнительно короткие теломеры построены из нуклеотидов С и Т в последовательности, которая имеет непостоянную структуру. Данные о строении теломер приведены в таблице 4.

Кроме инфузории тетрахимены, теломерные повторы изучены у многих других представителей простейших, в том числе у инфузорий стилонихии и окситрихи, у которых повторяющейся единицей является октамер 5'-ССССАААА-3'/3'-GGGGТТТТ-5'. Этот октануклеотид расположен на концах хромосом особым образом, так что часть G-цепи ДНК остается однонитевой из-за отсутствия второй цепи. Выступающие концы нитей ДНК обнаружены в теломерах всех организмов. Этот октануклеотид, выступающий за обычную двойную уотсон-криковскую спираль, называют одно однонитевым свободным G-концом. Длина простого повторенного дуплекса, расположенного проксимальнее, может варьировать от менее чем 50 пн (у Euplоtеs) до более чем 100 тпн (у мыши). Интересно, что теломерные однонитевые свободные G-концы фактически одинаковы у многих представителей совершенно различных филогенетических таксонов, за исключением дрожжей. Анализ показал, что четыре молекулы гуанина на выступающем конце, не имеющие возможности контактировать с молекулами цитозина, как это бывает в обычной молекуле ДНК, все же спариваются. Они располагаются в одной плоскости и образуют водородные связи между собой.

Таблица 4

Строение теломер у разных видов животных

Особенность формирования этой структуры заключается в том, что соединение нуклеотидов происходит не по принципу комплементарности оснований, а между молекулами одного и того же основания – гуанина.

Как уже отмечалось, рядом с теломерным повтором располагаются участки ДНК большой протяженности, называемые субтеломерными повторами – ТАS.

У дрожжей описано два субтеломерных повтора, X и Y’. X имеет размеры 0,3–3,75 тпн и менее консервативен, чем Y’ (5,2–6,7 тпн). Они чередуются, или повтор может состоять только из Х-элементов. Последние имеют открытые рамки считывания. На основании обнаруженной слабой гомологии в первичных последовательностях этих повторов с мобильными элементами предположили, что Y'-элементы возникли из одиночной инсерции в предковый геном дрожжей. Субтеломерные повторы обнаружены у многих видов. Общая длина их может быть очень большой – у хирономуса, например, до 300 тпн в каждой теломере.

По иронии судьбы термин «теломера» возник в результате исследований на дрозофиле. В то же время до сих пор нет никаких доказательств того, что в геноме дрозофилы есть короткие теломерные G-богатые последовательности, характерные для большинства других видов.

Рис. 23. Строение теломер у дрозофилы

Рис. 23. Теломеры дрозофилы.

У дрозофилы на концах хромосом расположены теломеро-специфичные ретротранспозоны – НеТ-А и ТАRТ. В общих чертах они имеют похожее строение. У обоих на 5'– конце присутствуют небольшие повторенные последовательности, а на 3'-конце – более протяженный повтор, завершающийся длинным фрагментом, содержащим только нуклеотиды с аденином (А)_n. Различаются они тем, что НеТ-А имеет две частично наложенные одна на другую рамки считывания (ОRFs), кодирующие белки, в то время как ТАRТ тоже две, ОRF1 и ОRF2, но расположенные тандемно. Оба рстротранспозона присутствуют во многих копиях, главным образом в прицентромерных районах. Они могут перемещаться по геному и в случае утраты теломерного района встраиваются на самый конец хромосомы, восстанавливая теломерную структуру (рис. 23).

5.3. Теория недорепликации теломер

После открытия структуры ДНК и механизмов ее репликации молодой российский ученый А. М. Оловников заинтересовался тем, как завершается процесс репликации на конце линейной молекулы ДНК. Дело в том, что каждая хромосома содержит единственную непрерывную молекулу ДНК, и концы этой молекулы совпадают с концами хромосомы. В соответствии со стандартной моделью репликации ДНК процесс удвоения отстающей нити ДНК начинается с синтеза коротких РНК-праймеров, или затравок, с начиная с 3'-концов которых синтезируются отрезки ДНК – фрагменты Оказаки. Затем РНК-праймер удаляется, образовавшиеся бреши (гэпы) заполняются фрагментами ДНК. Эти замещающие РНК-праймеры фрагменты ДНК синтезируются, используя в качестве праймеров З'-концы предыдущих фрагментов Оказаки. Поскольку для замещения крайнего РНК-праймера нет соответствующего предыдущего фрагмета (а, следовательно, и праймера), вновь образованная цепь оказывается на 8-12 нуклеотидов (длина РНК-праймера) короче исходной. В результате после каждого цикла репликации молекула ДНК должна становиться все короче: одна из четырех нитей укоротилась на 8-12 пн, т. е. на одном из концов хромосомы средняя длина нитей ДНК (двух материнских и двух вновь синтезированных) уменьшилась на 2–3 пн.

Исходя из этих особенностей самого процесса репликации ДНК, А. М. Оловников пришел к выводу, что если в клетке нет особых механизмов, компенсирующих потери нуклеотидов с каждого конца нити ДНК, то хромосома начнет укорачиваться, при этом сначала исчезнут теломерные районы, затем ближайшие к теломерам гены, потом более удаленные гены и т. д. Очевидно, что это в конце концов приведет к гибели клетки.

Действительно, у клеток, например, человека, растущих в культуре (in vitro), есть лимит на число делений. Американским ученым Л. Хейфликом в 1965 г. было показано, что, если для культивирования взять клетки у новорожденных, они могут пройти 80–90 делений, клетки же, взятые у 70-летних, делятся только 20–30 раз. Ограничение числа клеточных делений называют лимитом Хейфлика. Обычно клетки не преодолевают лимит из 20–90 делений, а в среднем, по мнению Хейфлика, он составляет 50±10. В своей статье в 1971 г. Оловников объяснил феномен лимита Хейфлика укорочением хромосом в процессе репликации и предложил следующую формулу для расчета продолжительности жизни любого клона клеток in vitro:

Т= k(lt/lm – n),

где Т – срок предстоящей жизни клеток; k– коэффициент корреляции между сроком жизни клона клеток и числом репликаций ДНК; lt – длина теломерного участка; lm – длина фрагмента ДНК, утрачиваемого в ходе каждого цикла репликации; п – число уже прошедших репликаций. Размер утрачиваемого фрагмента коррелирует с размером РНК-праймера, инициирующего синтез фрагментов Оказаки при репликации ДНК.

Таким образом, Оловников впервые напрямую связал срок жизни клеточных клонов с длиной теломерной ДНК и предположил, что «в качестве временной защиты концевых репликонов, локализующихся вблизи торцов хромосомы, клетка должна использовать телогены, которые находятся на торцах теломер». Также он определил «телоген», функция которого оставалась тогда неясной, как «неинформационный ген, имеющий „буферную" функцию и монотонную нуклеотидную последовательность», который. «укорачивается в митозах и тем самым защищает информационные гены от усечения при репликации».

Так что хотя часть нуклеотидов на 3'-конце отстающей цепи все же не будет реплицироваться, эта неполная репликация произойдет в зоне теломерного повтора, что не причинит никакого вреда генам, расположенным рядом. Однако через несколько циклов репликации теломерный повтор «растает» и недорепликация начнет затрагивать гены.