Текст книги "Репликация ДНК: учебное пособие"

8.4. Роль протеасомы в представлении антигенов комплекса МНС (Major complex of histocompatibility)

Синтезирующиеся в клетке аномальные и чужеродные белки также подвергаются деградации 26S протеасомой по АТР– и убиквитин-зависимому пути. В результате гидролиза этих белков образуется набор полипептидов длиной от 5 до 24 аминокислот, часть из которых может являться антигенными эпитопами. Полипептиды длиной от 8 до 11 аминокислот соединяются в цитозоле с ТАР (Transporter associated with antigen presentation) и переносятся в эндоплазматический ретикулум, где они связываются в комплексы с молекулами класса I МНС и выносятся на поверхность клетки. Презентация этих антигенов дает возможность иммунной системе при помощи цитотоксических Т-лимфоцитов обнаруживать и разрушать клетки, экспрессирующие вирусные или другие необычные полипептиды. Центральная роль протеасомы в этом процессе была доказана опытами с использованием ее ингибиторов.

Связь протеасомы с иммунным ответом подтверждается и тем, что гены двух из трех γ-интерферон-индуцибельных β-субъединиц протеасомы – LMP2 и 7 (Low molecular mass polypeptides) расположены в локусе генов комплекса МНС. В присутствии γ-интерферона три конституционные β-субъединицы, X, У и Z замещаются на свои иммунные изоформы LMP2, LMP7 и MECL-1 (Multicatalytic endopeptidase complex-like-1) соответственно с образованием так называемой иммунопротеасомы. Хотя скорость протеолиза белков при подобной замене не возрастает, но существенно изменяется спектр образуемых при протеолизе полипептидов: в несколько раз возрастает количество потенциальных антигенных полипептидов с «правильным» С-концом, необходимым для связывания с ТАР. В лимфоидных органах (селезенка, тимус и лимфатические узлы) эти субъединицы экспрессируются постоянно. Сравнение содержания конститутивно-экспрессируемой субъединицы X и замещающей ее индуцибельной субъединицы LPM7 выявило различное их содержание в таких органах, как печень, селезенка, язык и гипофиз. Было показано, что специфичность разрезания пептидных субстратов сильно различается у протеасом, выделенных из мозга и гипофиза, где обнаруживается только обычная протеасома, и из селезенки, где присутствует преимущественно иммунопротеасома.

В эукариотических клетках обнаружен еще один активатор 20S протеасомы – РА28 (REG или 11S регулятор), который может ассоциировать in vitro с 20S протеасомой в отсутствие АТР, образуя комплекс РА28-20S-РА28 (рис. 36). Две субъединицы этого комплекса – РА28α и РА28β – индуцируются в ответ на действие основного иммуномодуляторного цитокина γ-интерферона, что указывает на важную роль этого активатора и его участие в иммунном ответе. Комплекс РА28 имеет молекулярную массу около 180 кДа. Он, как и РА700, присоединяется к дистальным α-кольцам 20S протеасомы. Рентгеноструктурный анатиз показал, что при образовании комплекса между 20S протеасомой и РА28, происходит, как и при взаимодействии 20S протеасомы с РА700, открытие канала в α-кольце, однако это не приводит к утилизации таким комплексом белковых субстратов. РА28 активирует только гидролиз коротких полипептидов.

Физиологическое значение активации гидролиза пептидов активатором РА28 не совсем ясно, так как содержание свободных пептидов в клетках очень мало. Вероятно, роль РА28 может заключаться в регуляции продукции антигенных пептидов для представления молекулами класса 1 МНС. Во-первых, как уже говорилось, содержание субъединиц РА28 повышается под действием γ-интерферона. Во-вторых, РА28 изменяет специфичность разрезания полипептидов. В-третьих, повышенная экспрессия РА28α после трансфекции приводит к более эффективной презентации антигенов. Существует два объяснения того, как РА28 осуществляет более эффективную презентацию антигенов. Комплекс РА28-20S-РА28 может гидролизовать более длинные полипептиды, первоначально образуемые 26S протеасомой после деградации убиквитинированных белков. Также оба активатора – РА700 и РА28 – могут присоединяться к 20S протеасоме одновременно с образованием гибридной молекулы – комплекса РА700-20S-РА28. Возможно, гибридная протеасома способна осуществлять более эффективный гидролиз ряда субстратов с образованием антигенных полипептидов – убиквитинированный белковый субстрат узнается РА700 и транспортируется в полость 20S ядра, протеолитическая способность которой модифицирована активатором РА28. Было показано, что под действием γ-интерферона происходит накопление в цитоплазме формы РА700-20S-РА28. Предполагается также, что in vivo действие РА28 может заключаться в стимуляции высвобождения продуктов деградации.

8.5. Механизмы регуляции активности протеасомы

Механизмы, регулирующие экспрессию протеасомных субъединиц, содержание в клетке и внутриклеточное распределение различных типов протеасом, только еще начинают изучаться. В настоящее время можно предположить, что регуляция активности протеасомы осуществляется на следующих этапах:

1. При экспрессии изоформ β-субъединиц, а также при индукции иммунных изоформ β-субъединнц под действием γ-интерферона (в ответ на вирусную инфекцию). Эта экспрессия является тканеспецифической и зависящей от стадии дифференцировки. При этом происходит регуляция набора образуемых при протеолизе полипептидов без изменения скорости самого протеолиза. Например, у млекопитающих в норме в таких органах, как печень, селезенка и мышцы спектр β-субъединиц существенно отличается, а у дрозофилы на различных стадиях развития в различных тканях экспрессируются разные изоформы одной и той же субъединицы. Есть данные, что в незрелых дендритных клетках присутствуют как конституционная, так и иммунопротеасома. а в зрелых – только иммунопротеасома.

2. Скорость протеолиза в определенной области клетки может регулироваться путем изменения внутриклеточного распределения 20S и 26S протеасом. Расположенный на α-субъединицах сигнал ядерной локализации NLS (Nuс1еаг localization signal) позволяет протеасоме перемещаться сквозь ядерные поры из цитоплазмы в ядерный матрикс. Например, при созревании ооцитов аксолотля происходит перемещение 26S протеасомы в ядро; такое же запрограммированное изменение в распределении форм протеасомы происходит и в клеточном цикле. Локализация 26S протеасомы в определенных клеточных компартментах, видимо, связана с необходимостью ускоренного протеолиза в этих областях, как это, напрмер, происходит при ассоциации 26S протеасомы с центросомой.

3. Превращение 20S комплекса в 26S может регулироваться различными внутриклеточными факторами. Таким фактором может быть увеличение внутриклеточного содержания кальция. Также превращение 26S протеасомы в 20S и РА700 и обратно имеет место на различных пролиферативных стадиях у дрожжей.

4. Фосфорилирование/дефосфорилирование различных субъединиц как 20S, так и 26S протеасомы может являться одним из механизмов изменения соотношения этих двух форм, а также гибридной (РА28-20S-РА700) протеасомы и иммунопротеасомы.

5. Ряд вирусных белков (НIV-1 Таt-белок, онкобелок 16 Е7 папилломавируса человека, белок Е1А аденовируса) могут взаимодействовать с протеасомными АТРазами, увеличивая скорость протеолиза внутриклеточных белков и приводя к более эффективной вирусной репликации. Другой путь регуляции активности протеасомы при вирусной инфекции (белок X вируса гепатита В) заключается во взаимодействии вирусных белков с субъеднницами 20S протеасомы или регулятора РА28, супрессии в представлении вирусных антигенов и. тем самым, "ухода" вируса из-под контроля иммунной системы;

6. Процесс авторегуляции активности протеасомы может осуществляться на уровне транскрипции. У дрожжей S.cerviseae белок Rpn4 является активатором транскрипции генов, кодирующих субъединицы протеасомы и некоторые другие компоненты системы убиквитинирования. Сам Rpn4 представляет собой короткоживущий белок с расположенным в N-концевой области деградационным сигналом, благодаря которому Rpn4 напрямую взаимодействует с субъединицей Rpn2 активатора РА700 и не нуждается в предварительном убиквитинировании для 26S-протеасомной деградации.

7. Изменение сродства протеасомы к различным субстратам может происходить и за счет субъединиц активатора РА700. Субъединица Rpn10 экспрессируется в тканях мыши в виде 5 различных изоформ (Rpn10а-е), образующихся за счет альтернативного сплайсинга мРНК. При этом Rpn10а экспрессируется постоянно, а Rpn10е выявляется только в эмбриональных тканях, особенно в развивающемся мозге. Из этого можно сделать вывод, что 26S протеасома существует, по крайней мере, в двух функционально различных формах, одна из которых может играть специфическую роль в раннем эмбриональном развитии. Эти же две изоформы оказывают различное действие на деградацию циклина В в экстрактах яйцеклеток Хепорих.

8.6. Основные субстраты протеасомы

Использование ингибиторов активности протеасомы позволило показать, что в клетках млекопитающих до 90 % всего клеточного белка (все короткоживущие и 70 %-90 % долгоживущих белков) подвергается первичной деградации по убиквитин-зависимому протеасомному пути. Осуществляя деградацию короткоживущих и ключевых регуляторных белков, данный протеолитическлй путь играет важнейшую роль в регуляции основных клеточных процессов, таких как клеточный цикл и деление, дифференцировка, эмбриогенез, апоптоз, сигнальная трансдукция, репарация ДНК, трансмембранный и везикулярный транспорт, реакция на стрессовые воздействия, в том числе иммунный и воспалительный ответ.

Нарушения в этой системе могут быть причиной развития многих заболеваний человека как врожденных, так и приобретенных. Среди них известны различные формы мышечных дистрофий, мужская стерильность, некоторые формы злокачественного перерождения, нейродегенеративные заболевания (некоторые формы болезни Альцгеймера), нарушения иммунного и воспалительного ответа при вирусной и бактериальной инфекции. Предполагается, что изменения в функционировании протеасомного пути деградации связаны с накоплением окисленных белков при старении. В табл.6. приведены примеры белков, протеолиз которых осуществляется 26S протеасомой.

Таблица 6

Белки, протеолиз которых осуществляется 26S протеасомой

Глава 9. Рекомбинация ДНК: связь с репликацией и репарацией

Процесс генетической рекомбинации был подробно разобран нами в учебном пособии «Повреждение и репарация ДНК». В данном случае необходимо остановиться на тесной связи рекомбинации и репликации.

9.1. Роль двунитевых разрывов ДНК в процессе рекомбинации

Двунитевые разрывы хромосом (double-strand breaks, DSBs) образуются после воздествия ионизирующего излучения или химических мутагенов, получивших название радиомиметиков. Также DSBs могут быть результатом действия ферментов, особенно во время процесса репликации ДНК. Например, к появлению DSBs может привести нарушение работы топоизомеразы II. Главную роль в репарации подобных DSBs играет гомологическая рекомбинация, которая осуществляется чаще всего по принципу генной конверсии. Также в некоторых случаях гомологическая репликация может инициировать процесс праймер-независимой репликации. Недавние открытия утверждают, что генная конверсия и индуцированная разрывами репликация являются связанными процессами, причем оба начинаются с образования репликативной вилки, на обеих нитях которой, лидирующей и запаздывающей, идет синтез ДНК. Также произошел большой прогресс в описании и определении биохимической роли белков рекомбинации, являющихся высоко консервативными у всех эукариот от дрожжей до человека.

Репарация DSBs крайне важна для клеточного гомеостаз и в нее вовлечены большие ресурсы. Оставшись неотрепарированными, такие повреждения ведут к потере хромосом иили индукции клеточной гибели. Будучи неточно репарированными они приводят к мутациям и хромосомным перестройкам. Мы остановимся на репарации ДНК путем одного из процессов гомологической рекомбинации, известного как генная конверсия, при котором разорванная хромосома «залатывается» с помощью копирования информации с гомологичной хромосомы или сестринской хроматиды. Генная конверсия наиболее консервативный способ репарации, при котором повреждение репарируется с минимальным количеством ошибок, по сравнению с другими репарационными системами, использующими рекомбинацию, например NHEJ и рекомбинация с кроссинговером (то есть с обменом нитями ДНК), обязательно сопровождающимися обширными делециями или маленькими инсерциями в районе разрыва.

Впрочем, и генная конверсия иногда сопровождается кроссинговером взаимодействующих последовательностей, что может приводить к потере гетерозиготности в митотических клетках. Очень похожие процессы наблюдаются и в мейозе, причем они также инициируются DSBs. Обычно они описываются под названием мейотического кроссинговера.

В клетках млекопитающих, в противоположность дрожжевым, нерекомбинацонные пути репарации гораздо более действенны, чем путь, использующий гомологическую рекомбинацию. Но недавно было показано, что гомологическая рекомбинация крайне востребована в тех случаях, когда DSBs появляются в результате различных биохимических процессов.

9.2. DSBs и процесс репликации

В лаборатории DSBs обычно классически получают путем действия на клетку ионизирующего излучения. В последнее время также часто используют индукцию DSBs эндонуклеазами во время таких процессов как мейоз или V(D)J рекомбинация иммуноглобулиновых генов у высших эукариот или переключение спаривания у дрожжей. DSBs могут возникать и при перемещении мобильных элементов. Все это крайне важно для специализированных клеток, таких, например, как клетки лимфоцитарного ряда.

Одновременно стало понятно, что сам процесс репликации может быть источником эндогенных DSBs, приводящих к рекомбинации. Об этом свидетельствует возникновение при ~ 10 сестринских хроматидных обменов на клетку. Из-за этого любые позвоночные животные без Rad51 нежизнеспособны. Гомологическая рекомбинация играет еще одну важную роль в репликации – она способствует ресинтезу, то есть восстановлению движения остановившейся репликативной вилки. Вилка репликации может быть остановлена спонтанным разрывом или при проходе уже существующего конца нити. Репарация в таком случае может идти путем генной конверсии или репликации, индуцированной разрывом (break-induced replication, BIR). Сейчас стало понятно, что эти два процесса имеют гораздо больше общего и гораздо теснее связаны, чем предполагалось ранее. Оба эти процесса начинаются с образования активных 3’-концов ДНК, которые внедряются в интактный дуплекс и спариваются с донорной матрицей. Это основной шаг для инициации синтеза ДНК при репарации DSBs.

9.3. Репликация, индуцированная разрывами. BIR (break induced replication)

Это процесс репликации, независимый от наличия ориджина репликации и праймера, но зависимый от рекомбинации. Впервые он был изучен на примере репликации фага Т4. К настоящему времени стало понятен механизм этого процесса: свободный 3’-конец ДНК проникает в ДНК-матрицу и образует репликативную вилку. Инициация репликации подтверждается наблюдением о наличии внепланового синтеза ДНК как при репарации DSBs, так и при восстановлении вилки репликации. Подобная же модель применима для объяснения репарации DSBs у дрожжей, когда более проксимальная от центромеры часть плеча хромосомы реплицируется путем BIR.

Рис. 38.Генная конверсия и репликация, индуцированная разрывами ДНК

В гаплоидном геноме этот процесс может приводить к нереципрокным транслокациям в том случае, если спаривание произойдет в неаллельном участке (а аллельно оно произойти не может из-за отсутствия аллельного партнера). По этому же механизму может идти встраивание линейной ДНК в неповрежденное плечо хромосомы дрожжей. В опухолевых клетках млекопитающих этот процесс приводит к удлинению теломер в отсутствие теломеразы.

На рис. 38 показано сходство репликации, индуцированной разрывами в сравнении с генной конверсией. В обоих случаях необходим активный однонитевой конец ДНК.

9.4. Генная конверсия

К настоящему времени предложено несколько различных моделей репарации DSBs. Долгое время наиболее популярной была модель, предложенная Шостаком. Она предполагает внедрение в матрицу двух 3’– концов (по одному от каждой стороны разрыва) и образование двух структур Холлидея, разрешение которых может идти как по кроссоверному, так и по некроссоверному типу. По этой модели вновь синтезированная ДНК присутствует и в донорной и в реципиентной ДНК, то есть является «полуконсервативной». Этот механизм, впрочем, не нашел своего экспериментального подтверждения. Во-первых, оказалось, что кроссоверные обмены при репарации DSBs крайне редки, что свидетельствует о том, что Холлидеевские структуры в этом случае разрешаются преимущественно без обмена нитей, или просто крайне редки, или даже вовсе не формируются. Во-вторых, появляющаяся в результате неполного спаривания донорной и реципиентной ДНК гетеродуплексная ДНК (то есть отличающаяся по последовательности в образующих ее нитях), редко обнаруживается у донора, но часто – у реципиента. Этого не могло бы быть при обычной (по модели Шостака) расчистке разрыва с последующим спариванием нитей ДНК и синтезом, которая предполагает выравнивание последовательностей и отсутствие гетеродуплексности у реципиента. В-третьих, если зона рекомбинации содержит ДНК-повторы, то более 50 % участков генной конверсии содержат их измененное (увеличенное или уменьшенное) количество копий, причем все эти изменения затрагивают реципиентную ДНК. Исходя из этих противоречий, было предложено несколько новых моделей репаративной рекомбинации, получивших общее название зависимого от синтеза ДНК отжига нитей (synthesis-dependent strand annealing, SDSA). На рис. 39 для сравнения приведены модели Шостака и модели зависимого от синтеза ДНК отжига нитей.

Рис. 39. Модель Шостака (слева) и модель зависимого от синтеза ДНК отжига нитей (справа).

Впрочем, нужно понимать, что SDSA может осуществляться и по модели Шостака – две полуконсервативные отреплицированные нити могут открутиться от их доноров и взаимно отжечься. В этом случае вся новосинтезированная ДНК оказывается у реципиента, а Холлидеевские структуры разрушаются за ненадобностью. Это хорошо согласуется с тем, что измененное число повторов встречается только в реципиентной ДНК.

Одновременно было высказано предположение, что новосинтезированная нить продолжает наращиваться за счет передвижения небольшого «пузырька» репликации, вроде того, что наблюдается при исследовании репликации «in vitro». Обычно вновь синтезированная нить спаривается со вторым концом DSB, но было показано, что этот второй конец сам может формировать «пузырек» репликации, и таким образом приводить к появлению Холлидеевской структуры, разрешающейся путем кроссинговера. Количество кроссоверных событий зависит от того, как часто формируются эти альтернативные структуры.

9.5. Захват репарационно-репликационной вилки

BIR и генная конверсия – тесно связанные процессы. При генной конверсии, как и в случае BIR, все начинается с внедрения в донорную ДНК одного конца DSB. Это внедрение формирует репликативную вилку, и на обеих нитях – отстающей и ведущей – начинается синтез ДНК. Генная конверсия произойдет, если вилка захватит второй конец DSB, который может отжечься или с перемещающейся матрицей движущейся репликативной вилки, или с вновь синтезированной нитью, если она открутится от вилки репликации. В последнем случае не произойдет никакого кроссинговера, в первом – разрешение может пройти как по кроссоверному, так и по некроссоверному типу. Если в процессе митоза второй конец разрыва утрачен или деградирован (как на концах хромосом в клетках, утративших теломеразу) – то инициируется BIR. Из этого следует, что если митоз пройдет до того, как разрыв отрепарируется, то бесцентромерный участок будет утерян. Оставшаяся укороченная хромосома может быть впоследствие восстановлена также только путем BIR.

Рис. 40. Захват репарационно-репликационной вилки. Генная конверсия (а) и BIR(б).

Недавно было показано, что вилка репликации при репарации ДНК включает в себя ДНК-полимеразы как ведущей, так и отстающей нитей и множество сопутствующих факторов. Хотя вилка репликации при рекомбинации может не содержать некоторых факторов, например, ДНК-геликаз, связанных с ориджинами репликации. Это может объяснить то, почему репаративная репликация часто приводит к перемещению вновь синтезированной нити и почему генная конверсия у дрожжей не приводит к синтезу протяженных участков ДНК (более 10 кб), хотя такая длина не является проблемой для нормальной вилки репликации.

Многие наблюдения подтверждают, что обе вновь синтезированные нити ДНК откручиваются от матриц и отжигаются друг с другом в реципиетном локусе. Это требует участия геликаз в перемещении нити, причем эти геликазы должны быть подобны RuvAB E.coli, связывающейся с холлидееевской структурой и способствующей ее разрешению. Белки RuvAB играют важнейшую роль в ориджин-независимом, рекомбинационно-зависимом синтезе ДНК.

Конечно, механизм репарации DSBs, основанный на захвате репарационно-репликационной вилки, может осуществляться одним или несколькими различными описанными ниже путями. Выбор пути зависит от степени совершенства гомологии донора и реципиента. Также крайне важно, будет вовлечен в процесс один или оба конца двунитевого разрыва. Этапы возможных механизмов репарации DSBs, основанных на захвате репарационно-репликационной вилки представлены на рис. 40.