Текст книги "Репликация ДНК: учебное пособие"

Глава 8. Протеасомная деградация белков и ее роль в регуляции процессов ДНК-метаболизма

Процесс деградации белков как механизм регуляции содержания индивидуальных белков в протеоме уже давно не вызывает сомнения. Однако только сравнительно недавно появилась возможность экспериментально доказать определяющую роль убиквитин-протеасомного пути деградации в таких критических процессах, как клеточный цикл, онкогенез, транскрипция, дифференцировка, рост и атрофия тканей, продвижение субстратов по метаболическим путям, селективное удаление аномальных белков, процессинг антигенов. На сегодняшний день известно, что эукариотическая клетка имеет две основные системы деградации белков. Первая – это лизосомы, содержащие набор кислых протеаз и других гидролаз. Однако, к настоящему времени стало ясно, что лизосомы участвуют только в разрушении белков, ассоциированных с мембранами, и чужеродных белков, захваченных во время эндоцитоза. Вторая система – это гидролиз белка по АТР– и убиквитин-зависимому протеолитическому пути, основным действующим элементом которого является мультисубъединичный белковый комплекс, называемый 26S протеасомой. Протеасома обнаружена как у самых примитивных эукариот, так и у высших организмов, и присутствует как в ядре, так и в цитоплазме, некоторые 26S протеасомы ассоциированы с эндоплазматическим ретикулумом и цитоскелетом.

Протеолитическое ядро (20S протеасома) найдено также у архей и некоторых эубактерпй. Все это свидетельствует об абсолютной необходимости данного комплекса для нормальной жизнедеятельности клетки.

8.1. Структура 26S протеасомы

26S протеасома – это мультисубъединичный комплекс, состоящий из каталитически активного ядра и двух регуляторных субкомплексов, обладающий молекулярной массой около 2500 кДа, с коэффициентом седиментации 26S; этот комплекс способен гидролизовать белки, конъюгированные с убиквитином в присутствии АТР. Термин «протеасома» предложен ведущими исследователями в этой области К. Танака и А. Голдбергом и отражает, по их мнению, как протеолитическую (протеаза) функцию, присущую этому комплексу, так и его природу как дискретной частицы – сомы. Впервые 26S протеасома была выделена из различных объектов в конце 80-х гг.

На основании данных кристаллографии протеолитического ядра (20S протеасомы архей и дрожжей) и исследования структуры 26S протеасомы методами электронной микроскопии была предложена модель строения 26S протеасомы, представленная на рис. 36.

26S протеасома представляет собой гантелеобразную симметричную структуру и состоит из центрального цилиндрического 20S ядра, или 20S протеасомы, осуществляющей собственно протеолиз, а также двух боковых регуляторных комплексов РА700 (Рrotein activator). Первоначально 20S протеасома получила несколько названий: мультикаталитический протеазный комплекс, 20S протеаза, просома, макропайн и другие. Однако наиболее употребительным в настоящее время является обозначение «20S протеасома». В последнее время распространение получили также следующие обозначения: СР (Соге Рartiс1е) для 20S протеасомы, RР (Regulatory Рагtic1е) для РА700 и, соответственно, RР-СР для всей 26S протеасомы целиком.

Рис. 36. Схема строения 26S протеасомы (объяснения в тексте).

Необходимо отметить, что ряд исследователей употребляет термин «протеасома» только по отношению к 20S протеолитическому ядру, неспособному самостоятельно осуществлять АТР– и убиквитин-зависимый протеолиз. При таком подходе 26S протеасома характеризуется как комплекс протеасомы с двумя регуляторными субкомплексами РА700 (РА700-20S-РА700 – рис. 36б, г). В некоторых случаях, которые будут описаны далее, 20S протеасома может объединяться с другим регуляторным субкомплексом – РА28, (РА28-20S-РА28 – рис. 36е). Также возможно существование гибридной формы протеасомы – РА700-20S-РА28 (рис. 36д).

По данным рентгеноструктурного анализа 20S протеасома представляет собой полый цилиндр длиной 15–17 нм и диаметром 11–12 нм, состоящий из четырех лежащих друг на друге колец, каждое из которых образовано семью белковыми субъединицами с молекулярной массой от 20 до 35 кДа (рис. 36а). Полная масса 20S частицы составляет 750 кДа.

Наружные кольца сформированы семью субъединицами α-типа, а центральные – субъединицами β-типа. Внутри цилиндра имеется канал с тремя камерами-расширениями: одной большой, центральной, и двумя малыми, по краям. В центральной камере и осуществляется протеолиз поступающих в протеасому белков. Наиболее просто устроенные организмы, в частности археи, имеют только по две различных субъединицы α– и β-типа, а у дрожжей известно 7 различных субъединиц α-типа и 7 – β-типа. У млекопитающих это число еще выше, так как существуют изоформы некоторых субъединиц. В зависимости от типа ткани и стадии дифференцировки органа соотношение изоформ варьирует, и эти модификации имеют важнейшее физиологическое значение. Показано, что в культуре клеток γ-интерферон стимулирует экспрессию трех дополнительных протеолитически активных β-субъединиц (называемых индуцибельными, или иммунными), каждая из которых замещает определенную конституционно-экспрессируемую β-субъединицу. Субъединицы α– и β-типов обладают сходной третичной структурой, но различаются по аминокислотной последовательности.

Формирование четвертичной структуры (семичленного кольца) из α-субъединиц происходит без участия других компонентов, тогда как β-частицы сами не могут образовать кольцо. После формирования α-кольца с ним вступают во взаимодействие три β-субъединицы, одна из которых несет лидерный пептид, функционирующий как шаперон и отщепляющийся в процессе сборки протеасомы. Именно эти три белка определяют последующую посадку остальных β-частиц; в результате образуется 13S комплекс (~300 кДа) из одного α– и одного β-кольца. Затем происходит димеризация 13S комплекса в 16S предшественник. На этой стадии сборки протеасомы осуществляется процессинг β-субъединиц, при котором путем автокатализа отщепляются лидерные пептиды. Это способствует формированию активных протеазных каталитических центров. На заключительном этапе образуется зрелая 20S протеасома.

Кроме инициации сборки 20S частиц α-субъединицы выполняют еще несколько функций. Они являются местами связывания регуляторных комплексов, а их N-концевые гидрофобные участки образуют физический барьер, ограничивающий доступ цитоплазматических белков во внутреннюю протеолитнческую камеру.

β-субъединицы формируют два центральных кольца, и именно на них локализованы каталитические центры, осуществляющие протеолиз.

Протеасома 26S образуется при связывании с 20S протеасомой в АТР-зависимой реакции активатора РА700. В результате этого взаимодействия 26S протеасома приобретает способность к протеолизу убиквитинированных белков, причем скорость гидролиза возрастает, т. е. наблюдается аллостерическая регуляция активности протеолитического ядра активатором РА700.

Активатор РА700 имеет молекулярную массу более 800 кДа и состоит, по крайней мере, из 17 различных полипептидов с молекулярной массой от 25 до 110 кДа. По-видимому, он функционирует как «рот» для 20S протеолитического ядра, его субъединицы формируют два структурно и функционально различных комплекса, называемые lid– и base-комплексами (рис. 36б). Lid-комплекс состоит из 8 субъединиц, не обладающих АТРазной активностью (Rpn 3,5,6,7, 8, 9, 11, 12 – regulatory particle non-ATPase). Эти субъединицы отвечают за распознавание и подготовку убиквитинированных субстратов к деградации и взаимодействие с некоторыми непротеасомными белками.

Вase-комплекс, прилегающий к 20S, включает три регуляторных субъединицы (Rpn 1, 2, 10) и шесть АТРаз (Rpt 1–6 – regulatory particle triple-A protein), которые играют важнейшую роль в работе 26S протеасомы. АТРазы РА700 относятся к АТРазам семейства ААА (АТРаse associated with different cellular activities). Они участвуют как в АТР-зависимом процессе объединения РА700 и 20S протеасомы во время сборки 26S протеасомы, так и в гидролизе АТР при деградации убиквитинированных белков на этапах прикрепления субстрата, удаления или разрушения полиубиквитиновых цепей, раскручивания субстрата и его проникновения в 20S частицу, высвобождения олигопептидных продуктов.

Номенклатура субъединиц РА700 «Rnp» и «Rpt» относится к S.sereviseae, в случае высших эукариот названия основаны на «S»: например, Rpn2 соответствует S1, Rpn10 – S5а и т. д.

Показано, что присоединение РА700 приводит к открытию канала в α-кольце, при этом преодоление барьера из N-концевых участков α-субъединиц происходит под действием субъединицы Rpt2, одной из шести АТРаз base-комплекса.

В процессе образования 26S протеасомы необходимым этапом является фосфорилирование некоторых субъединиц как 20S протеасомы, так и РА700. По некоторым данным фосфорилирование/дефосфорилирование субъединицы Rpt6, непосредственно примыкающей к СЗ-субъединице α-кольца 20S протеасомы, регулирует сборку и диссоциацию 26S протеасомы. Показано, что in vivo фосфорилируются две α-субъединицы (С8 и С9) 20S протеасомы и, по крайней мере, четыре субъединицы РА700, причем под действием γ-интерферона снижается как уровень их фосфорилирования, так и количество зрелых 26S протеасом в целом. Эти результаты свидетельствуют, что ассоциация 20S протеасомы с РА700 является регулируемым процессом, и что фосфорилирование различных субъединиц протеасомы может быть одним из способов такой регуляции.

Генетика протеасомных генов достаточно хорошо исследована на дрожжах. Показано, что делеции в 13 из 14 генов, кодирующих α– и β-субъединицы 20S протеасомы, и в генах, кодирующих большинство компонентов РА700 (например, всех АТРаз), летальны. Этот факт еще раз подтверждает важность и необходимость протеасомы для жизни эукариотической клетки. Недавно у дрожжей S.сегeviseae была обнаружена общая система централизованной регуляции транскрипции. В промоторных областях 27 из 33 протеасомных генов был описан неизвестный ранее класс регуляторных UAS-последовательностей, названных РАСЕ-последовательностями (Рroteasome-associated control element). Короткоживущий белок Rpn4, присоединяясь к РАСЕ, функционирует как общий транскрипционный активатор генов, кодирующих субъединицы протеасомы и ряд белков, связанных с убиквитин-протеасомным протеолитическим путем.

8.2. Система убиквитинирования

Основным субстратом 26S протеасомы являются белковые молекулы, несущие цепи полиубнквитина. Убиквитин – это небольшой полипептид, состоящий из 76 аминокислотных остатков. В его составе имеется семь остатков лизина, однако полимризация этого белка с образованием полиубиквитиновой цепи происходит в случае протеасомной деградации через остаток Lуs-48.

В эукариотических клетках существует специальная система ферментов: Е1 или Uba – убиквити-активирующий (Ubiquitin-activated enzyme), Е2 или Ubc – убиквитин-связывающий (Ubiquitin-conjugating enzyme) и ЕЗ или Ubr – убиквитин-лигаза (Ubiquitin-recognition factor или Ubiquitin-protein-ligase). Эта ферментная система узнает белки, несущие специальные деградационные сигналы, и осуществляет их конъюгацию с убиквитином через ε-NH_2:-группу остатка лизина белкового субстрата. Высокая специфичность и селективность системы достигается за счет ее иерархичности. Так, в клетке существует только один фермент Е1, активирующий молекулу убиквитина, образуя тиоэфирную связь с карбоксильной группой остатка Glу-76, и передающий ее на один из членов семейства убиквитин-конъюгирующих ферментов – Е2. Геном дрожжей S.cerevisае кодирует 13 Е2-подобных белков, у млекопитающих их количество гораздо больше. Показано, что каждый Е2-белок участвует в определенном клеточном процессе. Например, Ubс2/RAD6 вовлечен в репарацию ДНК, а UbcЗ/СDС34 необходим в регуляции перехода от G1– к S-фазе клеточного цикла. Фермент из Е2-семейства взаимодействует с одним или несколькими представителями семейства ЕЗ, функция которых заключается в ковалентном присоединении полиубиквитина к молекуле белка через изопептидную связь между остатком Lys субстрата и Glу-76 убиквитина. Минимальным сигналом для эффективного присоединения к протеасоме является цепочка из четырех убиквитиновых звеньев.

Сейчас известно около ста различных убиквитин-протеин-лигаз, которые и определяют, в конечном счете, высокую специфичность системы. Убиквнтинирование субстрата, несущего определенный деградационный сигнал (часто таким сигналом является специфическое фосфорилирование), осуществляется различными группами ферментов ЕЗ, причем они могут соединяться с субстратом напрямую или через вспомогательный белок. Хотя о молекулярных механизмах катализа убиквитин-лигаз известно совсем мало, недавние исследования показали, что на основании структуры их каталитических доменов все известные пока ЕЗ-ферменты можно разделить на три класса.

Рис. 37. Убиквитин-зависимый протеасомный путь деградации белков

Первый класс – это ЕЗ, содержащие консервативную область в 350 аминокислотных остатков, которая получила название НЕСТ-домена (Homology to E6-AP carboxyl terminus) из-за своей гомологии с С-концом наиболее хорошо изученной убиквитин-лигазы Е6-АР; второйой класс – ЕЗ, содержащие мотив из восьми цистеиновых и гистидиновых остатков, которые удерживают два иона цинка, называемый RING-finger-доменом; третий класс – ЕЗ, содержащие U-box-домены, это новый класс убиквитин-протеин-лигаз с третичной структурой близкой к RING-finger-белкам, но без металл-хелатирующих аминокислотных остатков.

Цепи полиубиквитина служат для 26S протеасомы сигналом, что конъюгированные с ними белки должны быть деградированы. Предполагалось, что полиубиквитин узнаётся субъединицей Rpn10 комплекса РА700 и заякоривается на ней, удерживая белок на протеасоме. Однако, хотя Rpn10 и связывает некоторые полиубиквитинированные белки in vitro, но делеции гена RPN10 не являются летальными. Поэтому вопрос о том, какие из субъединиц РА700 отвечают за узнавание полиубиквитина, оставался открытым. По последним данным полиубиквитиновая цепь контактирует с с Rpt5(S6') – одной из АТРаз РА700, причем этот процесс, так же как и последующее разворачивание субстрата, АТР-зависим, В процессе деградации белка полиубиквитиновые цепи высвобождаются и расщепляются до мономеров изопептидазами. Схема взаимодействия протеасомы и системы убиквитинирования белков представлена на рис. 37, она была предложена для наиболее изученного класса убиквитин-протеин-лигаз. содержащих НЕСТ-домены.

Роль 26S протеасомы заключается в избирательной АТР-зависимой утилизации белков, несущих специальные деградационные сигналы. Такими сигналами, отвечающими за присоединение убиквитнна и последующую деградацию, могут быть как мотивы первичной структуры, так и вторичные посттрансляционные модификации. Первичными деградацнонными сигналами служат определенные N-концевые аминокислотные остатки (правило N-конца), а также некоторые небольшие аминокислотные последовательности внутри белковой молекулы – РЕSТ-последовательности (такие специализированные последовательности имеет, например, дрожжевой циклин CLN3 фазы G1) и «desriction box»-последовательности (они обнаружены у митотических циклинов). Посттрансляционной модификацией, определяющей деградацию ряда субстратов, является фосфорилирование. Этот процесс подробно описан для белка-ингибитора апоптозного фактора NF-κB – 1κВα. Ассоциация с некоторыми вспомогательными белками, такими как вирусные онкобелки (онкобелок Е6 вируса папилломы человека) и молекулярные шапероны, также служит сигналом для их убиквитинирования. Деградационные сигналы обычно имеются у короткоживущих, частично разрушенных белков, или у белков с нарушенной третичной структурой. Как было сказано ранее, большинство белков, подвергающихся осуществляемому в клетке 26S протеасомой запрограммированному протеолизу, деградирует по АТР– и убиквнтнн-зависимому механизму. Однако есть ряд примеров, когда система убиквитинирования не задействована, а узнавание протеасомой осуществляется за счет каких-либо других механизмов. Так, деградация орнитиндекарбоксилазы (ОDС), ключевого фермента биосинтеза полиаминов, происходит после нековалентного взаимодействия с белком антизимом, вызывающим диссоциацию каталитически активного димера и, вероятно, играющего роль убиквитинподобного шаперона.

Ранее считалось, что функции протеасомы заключаются только в избирательной деградации аномальных или неправильно сложенных белков, некоторых присутствующих в норме в клетке короткоживуших белков, а также в генерации антигенных полипептидов, представляемых на поверхность клетки молекулами класса 1 МНС (Маjor Histocompartability Сотрlex). В настоящее время доказано участие протеасомы в осуществлении целого ряда жизненно важных процессов в клетке. Установлено, что протеасома участвует и в медленной деградации части белков в клетках млекопитающих, например, при усилении деградационных процессов в мышцах при различных патологических состояниях, а также в превращении ряда мембранных белков. Необходимо отметить, что существенный прогресс в понимании роли убиквитин-протеасомной деградации в различных клеточных процессах стал возможен благодаря применению ингибиторов протеасомы, которые легко проникают в клетку и селективно подавляют данный путь деградации белков.

В таблице 6 приведены белки, протеолиз которых осуществляется 26S протеасомой. Эти белки относятся, в основном, к так называемым короткоживущим белкам, время полужизни которых исчисляется минутами (например, Rpn4, ОDС) или составляет менее трех часов (ЕNаС). Короткожпвущими являются практически все факторы регуляции транскрипции, онкобелки и супрессоры опухолей, белки, участвующие в регуляции клеточного цикла. В ряде случаев происходит только частичное расщепление белковой молекулы (например, р105) или протеолиз отдельной субъединицы в мультисубъединичных комплексах (например, 1кВα, Siс 1).

Рассмотрим некоторые основные метаболические события в клетке, в которых участие протеасомы общепризнано.

1. Онкобелки и белки-супрессоры опухолей. Деградация ряда онкобелков и супрессорных белков опухолей (с-jun, с-fos, с-Mos, р53) в клетках млекопитающих происходит по убиквитин-зависимому протеасомному пути. Уровень онкосупрессорного белка р53 очень низок при ряде злокачественных заболеваний, вызванных онкогенным штаммом папилломавируса человека НРV (Нuman Papilloma Virus), хотя в клетках синтезируется нормальное количество и мРНК р53 и самого белка. Снижение количества р53 является следствием его ассоциации с присутствующим в клетке в норме белком Е6-АР (Е6-associated protein) и НРV-кодируемым онкобелком Е6. Такое взаимодействие является сигалом для убиквитинирования и ускоренной деградации р53 протеасомой, что приводит к нарушению соотношения между процессами роста и апоптоза в зараженных клетках и к их злокачественному перерождению.

Концентрация онкобелка с-jun поддерживается в нормальных клетках на низком уровне также путем убиквитнн-зависимой протеасомной деградации. При возникновении в системе деградации «сбоя» происходит накопление белка с-jun, что, в свою очередь, влечет за собой активацию его онкогенного потенциала и трансформацию клеток.

2. Факторы транскрипции. Наиболее подробно описано участие протеасомы в регуляции двуступенчатой активации ядерного фактора транскрипции NF-κВ (Nuclear factor κВ). Этот фактор регулирует экспрессию разных генов, в частности, участвующих в иммунном ответе и воспалительной реакции, и представляет собой гетеродимер, состоящий из субъединиц р50 и р65. После убиквитин-зависимого протеолитического процессинга 105кДа белка– предшественника образуется субъединица р50, которая в цитозоле связывается с субъединицей р65 и белком-ингибитором 1 κВα в неактивный комплекс. Наличие этого комплекса не дает оуществляться NF-κВ-зависимой транскрипции. Для активации NF-кВ необходима 26S-протеасомная деградация ингибитора 1кВα после его фосфорилирования по двум сайтам и убиквитинирования убиквитин-протеин-лигазой ЕЗ. Есть данные, что активность таких факторов транскрипции, как Gcn4р, Н1F1, IСЕR и YAN, также регулируется убиквитин-зависимым протеолизом.

8.3. Роль протеасомы в регуляции клеточного цикла

Установлено, что убиквитин-зависимый протеолиз играет важнейшую роль в регуляции перехода от G1– к S-фазе, а также в процессе сегрегации хромосом при переходе от метафазы к анафазе и в последующем выходе из митоза. Переход от G1– к S-фазе детально изучен у дрожжей, он осуществляется по СDС34-зависимому механизму путем деградации G1-циклинов (циклинны дрожжей называются CLN2 и CLN3) и ингибитора циклин-зависимых киназ Sic1. СDС34 (Се11 division сус1е) является убиквитин-конъюгирующим ферментом Е2. Регуляция стабильности субстратов СDС34-опосредованого убиквитинирования достигается за счет их фосфорилирования. Ингибитор циклин-зависимых киназ Sic1 стабилен во время ранней G1-фазы и препятствует преждевременной активации циклин-зависимых киназ S-фазы, но в поздней фазе G1 он быстро деградирует, и циклин-зависимые киназы S-фазы инициируют репликацию ДНК. Сходная ситуация наблюдается и у позвоночных, в клетках которых экспрессируются структурные и функциональные гомологи компонентов СDС34 пути.

АРС (Anaphase promoting Сотр1ех), или циклосома, представляет собой белковый комплекс, содержащий убиквитин-протеин-лигазу ЕЗ, и осуществляющий при переходе от метафазы к анафазе убиквитин-зависимую протеасомную деградацию ингибиторов анафазы, а при выходе из митоза – митотических циклинов. Циклины А и В имеют состоящий из 9 аминокислот консервативный фрагмент, названный «destruction box». После изменений именно в этом фрагменте они становятся объектами для убиквитинирования. У мутантов, утративших «destruction box», циклины не убиквитинируются и не деградируют, поэтому у них клеточный цикл останавливается в поздней анафазе.