Текст книги "Репликация ДНК: учебное пособие"

ДНК-полимераза δ представляет собой гетеродимер, состоящий из каталитической субъединицы с мол массой 125–130 кДа и субъединицы 48–55 кДа, необходимой для связывания с фактором процессивности РСNА (proliferating cell nuclear antigene). Малая субъединица нужна для преодоления ферментом структурных барьеров в природных однонитевых матрицах. В действительности нативный фермент может представлять собой тетрамер, содержащий по две субъединицы с мол массами 125 и 55 кДа, а субъединица 55 кДа является фактором димеризации репликативных холоферментов, подобно субъединице τ в ДНК-полимеразе III Е. соli. В отсутствие РСNА ДНК-полимераза δ имеет низкую процессивность на длинных однонитевых матрицах, а в присутствии РСNA процессивность возрастает в 10-100 раз. С помощью делеционных мутантов установлено, что в ДНК-полимеразе δ мыши за связывание РСNА ответствен участок 129–149 аминокислотных остатков N-концевой области каталитического полипептида, С-концевой домен менее консервативен и содержит два участка связывания ДНК.

Холофермент ДНК-полимеразы δ включает в себя фактор процессивности РСNА и факторы RFС (replication factor C) и RРА, он собирается на праймер-матричном комплексе в следующем порядке: сначала RFС связывается с 3'-ОН-концом праймера на однонитевой ДНК-матрице, "покрытой" белком RРА. Затем RFС в присутствии АТР формирует на ДНК-дуплексе, прилежащем к 3'-концу праймера, кольцевую структуру из трех молекул РСNА с мол массой 36 кДа каждая, а РCNA обеспечивает присоединение ДНК-полимеразы δ к 3'-концу праймера, завершая таким образом формирование высокопроцессивного холофермента.

B самом РСNА идентифицированы участки, отвечающие за связывание с субъединицами RFС и ДНК-полимеразами. В присоединении к ДНК у полимеразы δ участвуют аминокислотные остатки 121–135, образующие петлю между доменами РСNА.

3'→5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы δ также регулируется факторами, входящими в состав холофермента. В отсутствие вспомогательных факторов 3'→5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы δ низка, но в присутствии белка RРА, как и ДНК-полимеразы α, она возрастает в 8-10 раз. Активирующий эффект RРА на 3'→5'-экзонуклеазную активность обусловлен, очевидно, дестабилизацией комплекса затравки с матрицей в присутствии этого белкового комплекса.

Синтез ДНК-полимеразы δ в клеточном цикле регулируется на уровне транскрипции. Количество мРНК фермента и белка достигает максимума на границе G1/S-фаз. Динамика синтеза ДНК-полимеразы δ в цикле соответствует динамике ДНК-полимеразы α. Интересно, что синтез РСNА в ходе клеточного цикла коррелирует с синтезом ДНК-полимеразы δ, однако содержание РСNА стабильно увеличивается и остается высоким до границы фаз G2/М. ДНК-полимераза δ представляет собой фосфобелок, наибольшая степень фосфорилирования которого относится к фазе S. Фосфорилирование каталитической субъединицы 125 кДа ДНК-полимеразы δ осуществляется, очевидно, специфичной для фазы G1 циклин-зависимой протеинкиназой сdk2. Интересно, что фосфорилирование каталитической субъединицы не сказывается на ее ферментативной активности.

ДНК-полимераза ε человека содержит два полипептида – каталитический 261 кДа и 55 кДа. ДНК-полимераза ε дрожжей состоит из пяти субъединиц: каталитической 256 кДа и субъединиц 80, 34, 31 и 29 кДа. Субъединица 80 кДа ДНК-полимеразы ε дрожжей является гомологом субъединицы 55 кДа фермента из клеток млекопитающих. Ферментативные активности – ДНК-полимеразная и 3'→5'-экзонуклеазная – связаны с высокомолекулярным полипептидом, N-концевой домен которого обеспечивает обе активности, а С-концевой домен необходим для контроля вступления клетки в S-фазу цикла.

Особенностью холофермента ДНК-полимеразы ε является его меньшая зависимость от вспомогательных факторов РСNА, RFС и RРА по сравнению с холоферментом ДНК-полимеразы δ. ДНК-полимераза ε способна процессивно удлинять затравку на однонитевых матрицах в отсутствие РСNА. В присутствии полного набора репликативных факторов увеличивается процессивность синтеза и эффективность связывания ДНК-полимеразы ε с праймерами. Существует представление, что на ДНК-матрицах, покрытых белком RРА, факторы РСNА, RFС и АТР образуют «комплекс узнавания 3'-ОН-конца праймера». Участок связывания ДНК-полимеразы ε в молекуле РСNА не совпадает с участком связывания ДНК-полимеразы δ. Об этом свидетельствует тот факт, что разные мутантные формы белка PCNA, синтезируемые штаммами рспа-79 и рспа-90, не способны взаимодействовать с ДНК-полимеразами δ и ε соответственно. В результате у мутанта рспа-79 нарушен синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой δ, а у мутанта рспа-90 – ДНК-полимеразой ε.

Другое различие между холоферментами ДНК-полимераз δ и ε заключается в разной скорости синтеза ДНК. В оптимальных условиях скорость синтеза ДНК холоферментом ДНК-полимеразы ε примерно на порядок ниже скорости синтеза холоферментом ДНК-полимеразы δ. Это различие связано с разной функцией ДНК-полимераз в репликативной вилке. Один холофермент ДНК-полимеразы δ осуществляет быстрый и процессивный синтез лидирующей нити, используя для элонгации единственный праймеру, синтезируемый в районе ori, и диссоциирует только по достижении конца репликона, а несколько холоферментов ДНК-полимеразы ε могут одновременно синтезировать фрагменты Оказаки в «зоне Оказаки», удлиняя праймеры, синтезируемые ДНК-полимеразой α-праймазой в начале каждого фрагмента. При этом должен происходить быстрый оборот ДНК-полимеразы ε, сопровождающийся диссоциацией после завершения синтеза фрагмента и ассоциацией с праймером очередного фрагмента. При синтезе фрагментов запаздывающей цепи, когда концентрация праймеров высока и могут синтезироваться одновременно несколько фрагментов, скорость полимеризации менеее важна, чем спосбность к быстрому переключению с одного фрагмента Оказаки к другому.

Содержание мРНК ДНК-полимеразы ε в клеточном цикле изменяется, достигая своего максимума непосредственно перед клеточным делением. Уровень этой мРНК в пролиферирующих клетках в 5-16 раз выше, чем в покоящихся.

ДНК-полимеразы, δ и ε, обладают 3'→5'-экзонуклеазной активностью, выполняющей корректорскую функцию в ходе синтеза ДНК, но частоты ошибок при синтезе лидирующей и запаздывающей нитей отличаются. Это связано с тем, что часть ДНК отстающей нити синтезируется ДНК-полимеразой α, которая способна синтезировать ДНК с большим количеством ошибок.

Эта полимераза локализована в митохондриях, ее функция связана с репликацией и репарацией мтДНК. ДНК-полимеразы γпредставляют собой гетеродимеры, состоящие из большой каталитической субъединицы 125–140 кДа, обладающей ДНК-полимеразной и 3’→5'-экзо-нуклеазной активностью, и вспомогательной субъединицы 35–50 кДа, функция которой неизвестна. Как и другие ферменты репликации мтДНК, ДНК-полимераза γ кодируется ядерным геномом. Первичная структура ДНК-полимеразы γ сходна со структурой ДНК-полимеразы I Е. соli, особенно в области каталитических центров, в N-концевом 3'→5'-экзонуклеазном домене и С-концевом полимеразном домене.

ДНК-полимераза β является наименьшей по размеру и самой простой по строению ДНК-полимеразой в клетках эукариот. В силу этого она наиболее изучена. Выделенный из клеток позвоночных фермент представляет собой один каталитически активный полипептид из 334 или 335 аминокислотных остатков с молекулярной массой 39–40 кДа. По своему строению ДНК-полимераза β ближе к семейству нуклеотидилтрансфераз, чем к α-семейству ДНК-полимераз.

ДНК-полимераза β обладает двумя ферментативными активностями – ДНК-полимеразной (5¹→З'-дезоксинуклеотидилтрансферазной) и дезоксирибофосфатлиазной (dRp– или АР-лиазной), удаляющей по механизму β —элиминации 5'-концевые апуриновые/апиримидиновые остатки (АР-сайты), ограничивающие бреши в ДНК.

Мягкий протеолиз ДНК-полимеразы β приводит к образованию N-концевого домена 8 кДа и С-концевого домена 31 кДа. Дальнейший протеолиз домена 31 кДа расщепляет его на домены с мол массами 6, 10 и 12 кДа, расположенные последовательно от N– к С-концу. В домене 8 кДа находятся участки связывания фермента с однонитевой и двунитевой ДНК, дезоксирибофосфатлиазный каталитический центр и участок связывания 5'-фосфата, ограничивающего однонитевую брешь. Для дезоксирибофосфатлиазного центра характерна Lys-богатая область, аминокислотные остатки которой His-34, Lys-35, Lys-68 и Lys-72 непосредственно участвуют в высвобождении dRр. Lys-35 участвует в узнавании 5'-фосфата. а Lys-72 выступает нуклеофилом при β – элиминации в ходе dRp-лиазной реакции. Замена Lys-72 на Arg не влияет на ДНК-связывающую и полимеразную активности фермента, но нарушает способность к репарации АР-сайтов. ДНК-полимеразная активность фермента локализована в двух С-концевых доменах. Каталитический нуклеотидилтрансферазный центр расположен в домене 10 кДа и включает Asp-190 и Asp-192. В связывании атомов двухвалентных металлов участвуют Asp-256 и Агд-254, а в связывании dNТР – аминокислотные остатки 4-40 домена 8 кДа и аминокислотные остатки 263–283 домена 12 кДа. Замена одного аминокислотного остатка в этом районе (Туг-265) приводит к появлению мутаторной формы фермента. В ходе каталитической реакции фермент способен менять конформацию и изгибать матричную ДНК под углом 90° в месте бреши.

Уровень активности ДНК-полимеразы β не меняется на протяжении клеточного цикла. Однако в присутствии агентов, повреждающих геномную ДНК, может наблюдаться индукция этого фермента, что согласуется с репаративной функцией ДНК-полимеразы β.

Скорость синтеза ДНК резко возрастает при объединении белков в прочный комплекс. Кроме ДНК-полимераз в этих репликативных машинах присутствуют различные белки, необходимые для репликации.

Геномная ДНК синтезируется ДНК-полимеразами при участии белковых факторов, обеспечивающих взаимодействие ДНК-полимераз с ДНК и процессивность синтеза ДНК. На отстающей цепи продукты синтеза ДНК дискретны, а РНК-затравки удаляются до завершения реакции. В этот каскад превращений кроме Ро1δ и ε вовлечены также РНКаза Н, ДНК-лигаза I и флэп-эндонуклеаза-1 (FЕN-1). Недавние исследования показали, что FЕN-1 физически взаимодействует с РСNА, который стимулирует ее нуклеазную активность в сотни раз. Предполагается, что созревание фрагментов Оказаки осуществляется при согласованном действии Ро1δ, РСNА, FЕN-1 и RPА. ДНК-лигаза I – один из компонентов, необходимых для соединения фрагментов Оказаки. Показано, что этот фермент также взаимодействует с РСNА и влияет на РСNА– зависимый синтез ДНК Ро1δ и Ро1ε. Согласно одной из гипотез, РСNА может быть задействован в репликативной вилке как связующее звено между ДНК-полимеразами и другими факторами для координации процессов элонгации и процессинга отстающей цепи. Согласно другой гипотезе, важнейшим фактором, координирующим действие всех других белков при переключении синтеза от одной ДНК-полимеразы к другой, равно как и завершение синтеза, является репликативный белок А.

Когда цепи ДНК разъединены, молекула ДНК становиться достаточно уязвимой и нестабильной. Все возможные нарушения в структуре одиночных цепей исключаются благодаря действию белков SSВ (Single strand DNA-binding proteins или helix-destabilizing proteins). Они связываются с одиночными цепями, стабилизируют их, при этом не закрывая оснований и оставляя их доступными для ДНК-полимеразы. SSB белок сам не способен разделять нити ДНК, но помогает геликазе выравнивать их, подготавливая основу для синтеза. Двухдоменный белок покрывает восемь нуклеотидных пар, при этом не закрывая их. Так как один белок пристраивается сразу же за другим, то они способны быстро покрывать однонитевую ДНК, по мере ее появления и препятствовать образованию РНК-подобных шпилечных структур. Обычно работает в тетрамерной форме, сразу покрывая 32 нуклеотида. Как происходит присоединение SSB к ДНК показано на рис. 13.

Одним из ключевых факторов эукариотической репликации является гомолог SSB репликативный белок А. Этот белок состоит из полипептидов с молекулярной массой 70 (р70), 32 (р32) и 14 (р14) кДа, т. е. является гетеротримером. RРА известен как фактор, связывающий однонитевую ДНК. Сродство RРА к двунитевой ДНК на три порядка ниже. На определенных этапах репликации, рекомбинации или репарации ДНК комплементарные цепи разделяются, и последующие превращения происходят уже с однонитевой ДНК. RРА стабилизирует однонитевую ДНК, нарушая ее вторичную структуру.

Рис. 13. Строение белка SSB E.coli

Основные ДНК-связывающие домены RPA (А, В и С) входят в состав р70 субъединицы. При связывании однонитевой ДНК RРА претерпевает значительные конформационные перестройки, модулируемые длиной выступающего участка матричной цепи. Недавно была выяснена роль р32 субъединицы RPA в связывании RРА с ДНК. В случае ДНК-дуплексов с выступающим участком матрицы размером 30 и 18 н наблюдали преимущественное ковалентное присоединение р32-субъединицы к 3'-концу праймера, в то время как укорочение матричной цепи до 13–12 н. и далее обеспечивало в основном ковалентное присоединение субъединицы р70. р32 субъединица RРА размещается вблизи 3'-конца праймера при протяженном матричном участке и удаляется из области контакта с З'-концом праймера при укорочении матрицы. С помощью электронной микроскопии показано, что RРА в комплексе с однонитевой ДНК принимает в зависимости от длины участка ДНК элонгированную, сжатую или глобулярную конформации. Это показано на рис. 14.

Рис. 14.Конформационные изменения RPA

Предполагалось, что в этих конформациях изменяется расположение субъединиц RРА относительно 3'-конца растущей цепи. В вытянутой конформации RРА субъединица р32 расположена вблизи З'-конца растущей цепи ДНК, в то время как изменение конформации RРА к сжатой и далее к глобулярной форме удаляет р32 от ее 3'-конца. Изменение конформаиии RРА зависит исключительно от длины выступающего участка матрицы.

В районах однонитевых брешей однонитевая ДНК связывается с А и В ДНК-связывающими доменами субъединицы р70, при этом 5'-конец ДНК взаимодействует с доменом А, в то время как домен В расположен ближе к 3'-концу, что говорит о преимущественном взаимодействии р70 с 3'-концом бреши (рис. 14).

Предложена модель, позволяющая рассмотреть возможное расположение RРА в брешах. В случае небольшой бреши размером 9-10 н RРА связывается с ее однонитевым участком, используя свои основные ДНК-связывающие домены А и В субъединицы р70. При этом RРА находится в глобулярной конформации, в которой субъединица р32 практически не контактирует с 3'-концом праймера. В протяженной бреши RРА принимает вытянутую конформацию, в которой контакты р32 с 3'-концом праймера облегчены, но в то же время всегда доминирует взаимодействие субъединицы р70 с однонитевой платформой бреши, в особенности на ее 5'-конце.

Связь р14 субъединицы с ДНК в составе полной молекулы. RPA не была обнаружена. Возможно, что эта субъединица закрыта от контактов с ДНК двумя другими субъединицами RРА. По-видимому, субъединица р14 выполняет структурно (как шарнир между субъединицами р70 и р32) организует гетеротример RРА, однако ее точная роль в структуре RРА остается неясной.

Таким образом, взаимодействие RРА с ДНК может быть рассмотрено как многостадийный процесс, в ходе которого RPA взаимодействует с участком 8-10 н, и это связывание осуществляется с помощью ДНК-связывающих доменов А и В субъединицы р70. Такое взаимодействие RРА осуществляет, по-видимому, находясь в глобулярной форме. При наличии более протяженного участка однонитевой структуры ДНК RРА изменяет свою конформацию, что делает возможным взаимодействие с ДНК другого домена субъединицы р70 – домена С, а затем и ДНК-связывающего домена D субъединицы р32. Такой тип связывания RРА может быть осуществлен в его «вытянутой» конформации в том случае, когда участок однонитевой ДНК достигает размера около 30 н. RРА в таком комплексе проявляет свое максимальное сродство к однонитевой ДНК. Возможно, что такое расположение ДНК-связывающих доменов обеспечивает возможность более легкого «вытеснения» RРА при заполнении однонитевых брешей в ходе синтеза ДНК ДНК-полимеразами.

Белок RРА (в нефосфорилированной форме) стимулирует полимеразную активность и увеличивает процессивность ДНК-полимеразы α. Фосфорилирование RРА, а также мутации в N-концевой области субъединицы р32 предотвращают взаимодействие белков и активацию ДНК-полимеразы α.

В ходе клеточного цикла уровень фосфорилирования RРА меняется и носит регуляторный характер. Участки фосфорилирования RРА находятся в N-концевом фрагменте субъединицы 32 кДа. При повреждающих воздействиях на клетку, типа УФ-облучения, происходит гиперфосфорилирование RРА, коррелирующее с подавлением репликации ДНК.

В процессе репликации крайне важно взаимодействие с ДНК и другого фактора репликации – репликативного фактора С. RFС представляет собой гетеропентамер, состоящий из субъединиц 140–145, 40, 38, 37 и 36 кДа, он обладает АТРазной активностью, стимулируемой ДНК и РСNА. Все пять субъединиц этого фактора содержат в С-концевой области консервативные РСNА-связывающие участки. Этот фактор способствует посадке на ДНК PCNA, и таким образом образуется тройной комплекс RFСРСNА•Ро1δ– холоэнзим, обеспечивающий процессивный синтез ДНК.

RFC взаимодействует преимущественно с 5'-концом праймера, но не с его 3'-концом. ДНК-связывающий участок RFС локализован на субъединице р140, поскольку именно эта субъединица обнаруживается в качестве продукта ковалентного присоединения к 5'-концу праймера. Существует модель переключения синтеза ДНК от Ро1α к синтезу, катализируемому РСNА-зависимыми ДНК-полимеразами. Согласно этой модели, Ро1α начинает синтез праймера на однонитевой ДНК, покрытой молекулами RРА. RFС связывается с 5'-концом только что синтезированного праймера и блокирует синтез ДНК, выполняемый Ро1α, в тот момент, когда она синтезировала РНК-ДНК-праймер длиной 30 н. На этой стадии репликативный белок С, возможно, способствует посадке РСNА на ДНК. Это приводит к вытеснению Ро1α с 3'-конца растущей цепи и синтез продолжается с помощью Роl δ или ε. Схема этого процесса показана на рис. 15.

Рис. 15. Роль RFC в репликации ДНК

Три молекулы РСNА (36 кД каждая) образуют кольцевой тример с отверстием для двунитевой ДНК в центральной части, который представляет собой перемещающуюся по ДНК подвижную платформу или «скользящий зажим» («sliding clamp») в форме тора (бублика), удерживающую ДНК-полимеразу δ в ходе полимеризации на матрице и обеспечивающую высокопроцессивный синтез ДНК. Структура этого тора показана на рис. 16. Хотя РСNА и прокариотический фактор процессивности – субъединица β ДНК-полимеразы III Е. соli – имеют низкую гомологию на уровне первичной структуры, оба белка формируют близкие по пространственной геометрии структуры «скользящей скрепки».

Рис. 16. Строение PCNA

Строение «скользящего зажима у про– и эукариот (PCNA)

РСNА стабилизирует комплекс ДНК-полимеразы δ с праймер-матрицей, предотвращает преждевременную диссоциацию фермента и тем самым обеспечивает высокую процессивность синтеза. Однако при этом РСNА способствует фиксации в новообразованной ДНК ошибочно включенных природных и модифицированных нуклеотидов. Фосфорилирование РСNА-связывающего домена RFС, вероятно, является способом регуляции РСNА-зависимого синтеза ДНК, осуществляемого ДНК-полимеразой δ или ε. Фосфорилирование РСNА-связывающего домена RFС Са²⁺-кальмодулин-зависимой протеинкиназой II (СаМКII) ингибирует связывание РСNА с RFС и, как следствие, подавляет РСNА-зависимый синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразами δ и ε. С другой стороны, RFС в комплексе с РСNА и ДНК недоступен для фосфорилирования СаМКП. По другим данным, фосфорилирование РСNА-связывающего домена в большой субъединице (145 кДа) RFС, блокирующее связывание РСNА, может осуществляться при участии циклин-зависимых киназ, регулирующих клеточный цикл. Многие белки, учавствующие в ДНК-метаболизме, имеют сайты связывания с PCNA. Среди них лигаза I, метилтрансфераза для поддерживающего метилирования вновь синтезированной ДНК, некоторые гликозилазы, ингибитор циклин-зависимых киназ р21, флэп-эдонуклеаза I (FENI). Т. е. PCNA служит для сборки комплекса репликации и может привлекать к нему специфические белки в зависимости от конкретных условий.