Текст книги "Репликация ДНК: учебное пособие"

9.6. Генетическая характеристика вовлеченных в гомологическую рекомбинацию белков-гомологов RecA

Наши знания о белках, вовлеченных в процесс гомологической рекомбинации, базируются в первую очередь на изучении бактерий и бактериофагов, главным белком рекомбинации которых является RecA.

У эукариот есть несколько эволюционно консервативных гомологов RecA, способных катализировать обмен нитями ДНК. Один из гомологов – Rad51, экспрессируется во всех клетках, другой Dmc1 – только в мейотических. Оба эти белка способны к переносу нити и переключению спаривания, их свойства подобны, но не идентичны свойствам белка RecA. Эукариоты без Dmc1 имеют тяжелые дефекты мейотической рекомбинации. В соматических клетках позвоночных Rad51 необходим не только для митотической рекомбинации, но и для нормального клеточного роста. Многочисленные исследования показывают, что большинство хромосомных аберраций являются результатом DSBs, появившихся при репликации ДНК. Вопреки собственной универсальности, Rad51 не является необходимым для всех форм DSBs-индуцированной рекомбинации у дрожжей. Он необходим, как и Rad52, для процессов генной конверсии, происходящей с вовлечением двух гомологичных хромосом. Для других DSBs-индуцированных процессов он не столь необходим, например BIR может спокойно протекать в его отсутствии, но не в отсутствии Rad52. Как внедрение нити и старт ДНК-репликации протекают в отсутствии Rad51, остается загадкой. Мутантный фенотип Rad51 сходен с мутантными фенотипами Rad54, Rad57 и Rad55.

Таким образом, самым важным для рекомбинации у дрожжей S.cerevisea является белок Rad52, эволюционно крайне консервативный у эукариот. При его отсутствии у S.cerevisea не идет никаких рекомбинационных процессов. Но, может быть, существуют какие-то его пока неизвестные гомологи. Например, у S.pombe есть два его гомолога, и только нокаут по обоим является летальным – клетки остаются заблокированными в S-фазе. Гомолог Rad52 – Rad59 у дрожжей может вести несколько типов Rad51-независимой рекомбинации. Белки Rad57 и Rad55 у дрожжей имеют большую гомологию с Rad51. Их мутации выявляют рекомбинационные дефекты при низкой температуре, но этот дефект может быть скорректирован оверэкспрессией Rad51. Вероятно, эти белки могут служить факторами поддержки для Rad51 при загрузке на ДНК, как RecFOR у прокариот. В тоже время, у C.elegans вообще нет гомолога Rad52.

У высших позвоночных напротив, Rad52 не столь важен, как Rad51. В клетках позвоночных есть также большое количество белков с некоторой гомологией с Rad51 – Rad51B, Rad51C, XRCC2, XRCC3. Эти белки играют свою роль в репарации, вероятно, подобную таковой Rad57 и Rad55 у дрожжей. Rad54 является членом обширного Swi/Snf2 семейства хроматин-ремоделирующих белков. Он имеет некоторую геликазную активность, но его точная роль в рекомбинации недостаточно ясна. Как и у дрожжей, у позвоночных его отсутствие приводит к повышенной радиочувствительности, вероятно в результате нарушения сродства к матрице. У дрожжей есть его гомолог Tid1 (Rdh54), влияющий на рекомбинацию между гомологичными хромосомами и не влияющий на таковую сестринских хроматид, что вызывает некоторые ассоциации с ролью Dmc1 в мейозе. Для рекомбинации двойной мутант по этим гомологам столь же тяжел, как мутант по Rad52.

9.7. Биохимические свойства белков гомологической рекомбинации

Наиболее важный белок Rad52 образует мультимерные (гексамерные) кольца, которые одновременно связывают концы и ведут отжиг. У человеческого Rad52 те же свойства. Rad52 связывается с Rad51, способствуя обмену нитей. Rad52 также связывается с RPA, необходимого для репликации ДНК. Интересно, что есть специальные мутации большой субъединицы этого комплекса, которые подавляет и генную конверсию и отжиг нитей, но не влияют на репликацию.

Rad51 и Rad52 белки взаимодействуют с множеством других белков Rad54, гетеродимером Rad55Rad57. Ни один из этих белков не участвует в негомологическом воссоединении концов.

Любые стандартные опыты по изучению RecA/Rad51 опосредованного обмена нитей ДНК связаны с введением двунитевого фрагмента ДНК к однонитевому ДНК кольцу, покрытому белком Rad51. В различных комбинациях с другими белками Rad51 проводит обмен нитей in vitro. Разумеется, у двунитевой и однонитевой ДНК есть некоторая достаточная гомология. Схема подобного опыта представлена на рис. 41.

Рис. 41. Схема реконструкции процесса рекомбинации in vitro

In vitro, и человеческий и дрожжевой Rad51 образуют на однонитевой ДНК филамент, который может взаимодействовать с гомологической двунитевой ДНК. Этот филамент растягивает двунитевую ДНК на 50 % – то есть как бы удлиняет ее, причем может быть организовано два различных вытянутых состояния в зависимости от связывания с дезоксирибозой. Смена этих двух вытянутых состояний может, вероятно, быть двигателем обмена нитей, связанного с перемещениями Rad51 внутри филамента.

9.8. Наблюдение рекомбинации in vivo

Образование фокусов Rad51 во время мейоза. Это, вероятно, места рекомбинации. Делеции Rad52, Rad55, Rad57 предотвращают их образование как при нормальном мейозе, так и после γ-облучения.

Анализ температур-чувствительных мутантов ДНК-полимераз и факторов PCNA и RFC показывает, что они тоже необходимы для рекомбинации. Также оказалось, что для репарации DSBs совершенно необходима ДНК-полимераза-α-праймаза, то есть нормальный синтез ДНК на обеих нитях.

Изучение рекомбинации безусловно будет продолжаться и принесет свои плоды (например, как останавливать опухолевые клетки, делящиеся без активации теломеразы).

Заключение

В течение всего курса изучения репликации ДНК главной задачей представлялось создание общей картины взаимодействия большого числа генов и кодируемых ими белков в процессах поддержания стабильности передающейся по наследству информации и предотвращения нарушения процесса ее копирования. Новая парадигма – представление о динамических изменениях молекулы ДНК в процессе ее функционирования позволяет глубже понять происхождение и эволюцию живых организмов, их способность приспосабливаться к изменениям окружающей среды.

Детальное знание процессов репликации и рекомбинации ДНК, а также кинетики и молекулярных основ клеточного цикла могут быть продуктивно применены как в различных областях теоретической биологии, так и в прикладных исследованиях, например, при выработке стратегии сочетанной терапии опухолей. Одновременно нужно понимать, что даже в такой активно изучаемой последние 55 лет области, как ДНК-метаболизм до сих пор достаточно белых пятен. Может быть, именно вам посчастливиться сделать новое большое открытие.

Список литературы

Жимулев В.Ф. Общая и молекулярная генетика. Сибирское университетское издательство. Новосибирскк. 2003. 527 с.

Коничев А.С. Молекулярная биология: Учеб. Для студ. Пед. Вузов / М.: Издательский центр «Академия», 2005. 400 с.

Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот. Учеб. Для биол. Спец. Вузов/ В.И.Агол, А.А.Богданов, В.А.Гволздев, А.И.Грагеров, А.М.Колчинский, А.Д.Мирзабеков, В.Г.Никифоров.; под ред. А.С.Спирина. М., Вычш. шк., 1990. 352 с.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. В 3-х т. Т. 1. Генная и белковая инженерия. М.: Наука. 2004. 526 с.

Сингер М., Берг П. Гены и геномы. В 2-х т. Т. 1. Пер. с англ. М.: «Мир». 1998. 373 с.

Абрамова Е. Б., Шарова Н. П., Карпов В. Л. Протеасома: разрушать, чтобы жить. Мол. биол., 2002. 36:761–776.

.Бурьянов Я. И., Шевчук Т.В. ДНК-метилтрансферазы и структурно-функциональная специфичность модификации эукариотических ДНК. Биохимия. 2004. 69: 1474 – 1482

Завильгельский Г.Б. “Translesion synthesis”, или молекулярный «стипль-чез». Мол. биол., 2000. 34:201–209.

Крутяков В.М. Ферментативные механизмы антимутагенеза: роль автономных 3’→5– экзонуклеаз. Бреслеровские чтения. 2002. 85–94.

Куимов А.Н. Белковые компоненты теломерного нуклеопротеидного комплекса. Биохимия. 2004. 69:117–129.

Лаврик О. И., Хлиманков Д. Ю., Ходырева С. Н. Репликативный комплекс эукариот и его исследование с помощью аффинной модификации. Биохимия. 2003 Мол. биол., 2003. 37:563–572.

Ланцов В.А. Рекомбинация, репарация и репликация: взаимосвязь и взаимозависимость. Бреслеровские чтения. 2002. 27–42.

Михайлов В. С. ДНК-полимеразы эукариот. Молекулярная биология.1999. Мол. биол., 1999. 33:567–580.

Шарова Н.П., Абрамова К.Б. Инициация репликации ДНК эукариот – интригующий каскад межбелковых взаимодействий. Молекулярная биология. 2002. 67:1217–1223.