Текст книги "Методы консервации донорских тканей в офтальмологии"

Методы консервации донорских тканей в офтальмологии

Введение

Пересадка тканей – это способ замещения дефектов, образующихся вследствие иссечения тканей.

Первоначальный этап развития клинической трансплантации пришелся на середину и вторую половину 20-го века. В это время в стране был высокий уровень развития как фундаментальной, так и прикладной медицинской науки, и, в частности, хирургии как в ее теоретическом, так и практическом аспектах.

Неоценимый вклад внесли в клиническую трансплантологию такие выдающиеся теоретики и практики трансплантологии, как профессора В.П. Демихов, В.П. Филатов, В.И. Шумаков.

Клиническая трансплантология наряду с такими дисциплинами, как кардиология, онкология, является неотъемлемой частью системы здравоохранения любого развитого государства.

Правовое регулирование клинической трансплантологии в настоящее время переживает этап своего развития и совершенствования.

В офтальмохирургии при восстановительных операциях на глазном яблоке и придаточном аппарате глаза широко используются донорские ткани (трансплантаты) – роговая оболочка глаза, склера, аорта, твердая оболочка головного мозга, перикард, реберные хрящи, сухожилия, фасции, кожа и т.д.

Потребность в донорском материале ежегодно возрастает, что связано как с экологической и криминальной обстановкой, так и с локальными военными действиями.

В Российской Федерации почти в каждом регионе имеются Глазные банки, целью которых является создание запаса разнообразных донорских тканей. Для осуществления этой цели применяются различные методы консервации тканей.

Описание способов консервации изложено в пособии в исторической последовательности с тем, чтобы отдать должное многим поколениям ученых и практиков, внесших свой вклад в развитие трансплантологии.

1. Консервация тканей, как пролонгация сроков их умирания

Трансплантология состоит из двух основных частей: общей и частной (клинической). Общая трансплантология решает проблемы источников трансплантатов, консервирования, трансформации пересаженного биологического материала, трансплантационного иммунитета. В частной трансплантологии разрабатываются проблемы клинических пересадок органов и тканей (Коваленко П.П., 1975).

В последние годы клиническая трансплантология активно занимается созданием искусственных органов и тканей (искусственное сердце, печень, роговая оболочка и т.д.).

Трансплантационная хирургия в мире развивается настолько быстро, что число различных пересадок органов и тканей достигло 40 тысяч в год, и в ближайшие десятилетия будет составлять 50 % всех операций.

Развитие трансплантационной хирургии шло по трем этапам.

Первый этап – это заместительная хирургия, когда оперативное вмешательство выполнялось исключительно с целью замещения дефекта тканей. Трансплантат подбирался соответственно формируемому тканевому ложу (Нигматуллин Р.Т., 2003). Трансплантат должен был обладатьадекватнымипластическим биомеханическими свойствами.

Второй этап – это регенеративная хирургия, когда на месте трансплантата формируется регенерат с характерными свойствами. Качество регенерата зависит от свойств заготавливаемого трансплантата, на что влияет возраст донора, причина смерти, что выявляется при детальной экспертизе трупа-донора. Трансплантат должен соответствовать адекватности функциональной нагрузки при замещении дефектов различных анатомических структур.

Третий этап трансплантационной хирургии – это ответная реакция организма. Трансплантат оказывает системное влияние на организм, в котором участвует нервная, эндокринная и иммунная система.

В результате неблагоприятных условий переживания при консервации в тканях накапливаются биологически активные вещества – биогенные стимуляторы, которые усиливают рост и размножение клеток. Эта концепция о биогенных стимуляторах и репаративной регенерации (тканевая терапия), выдвинутая В.П.Филатовым в 1933г. -актуальна по сей день.

Теория тканевой терапии построена на изменениях биохимического состава донорских тканей в процессе криоконсервации, их пластических свойствах и особенностях структуры (Нигматуллин Р.Т., 2003).

С появлением теории В.П.Филатова возросли требования к качеству заготавливаемых тканей. В этот период – конец 20-х, начало 30-х годов XX века по инициативе академика В.П. Филатова возникла служба заготовки и консервации тканей при Одесском научно-исследовательском институте глазных болезней. За рубежом создание банков тканей происходило несколько позднее. В последующем, тканевые банки объединялись в научные Ассоциации. К наиболее известным из них относится Европейская Ассоциация Глазных банков, в которую входит Лаборатория трансплантологии с Глазным тканевым банком ФГУ МНТК «Микрохирургия глаза» им.акад. С.Н. Федорова (Москва).

А первый закон о трансплантации тканей был принят, благодаря академику В.П. Филатову. Это первый в истории законодательный акт, регламентирующий их использование юридически. В.П. Филатов перенес трансплантологию из экспериментального этапа в клиническую практику (Нигматуллин Р.Т., 2003). Позже профессор Коваленко П.П. организовал службу трансплантации тканей в нашей стране, создал сеть тканевых банков, которые решали проблему заготовки донорских тканей, селекции трупа-донора, тестирования донорских тканей и подготовки их для пересадки, что взято на вооружение современными исследователями.

Исследования, выполненные в нашей стране и за рубежом, позволили определить требования к заготавливаемым донорским тканям, как на этапе заготовки, так и в ходе консервации.

Развитие службы заготовки донорских тканей напрямую зависит от уровня развития базовых теорий тканевых пересадок.

Для трансплантации имеет значение правильный подбор трупа-донора. Ответственность за решение этого вопроса возлагается на медицинские учреждения, где находится труп и производится операция заготовки трансплантатов.

Существуют судебно-медицинские и клинические противопоказания к изъятию донорского материала. К судебномедицинским относятся случаи:

– экспертиз трупов по делам об убийствах;

– с неустановленной причиной, видом и родом смерти;

– смерти неопознанных лиц;

– когда хирургические операции по изъятию трансплантатов затрудняют последующую судебномедицинскую диагностику;

– если хирургические манипуляции приводят к обезображиванию тела, прежде всего лица покойного.

Клинические противопоказания к изъятию донорского материала:

– давность смерти свыше 1 суток, наличие признаков гниения;

– возраст трупа свыше 70 лет; системные инфекционные заболевания, туберкулез, венерические заболевания, сепсис, перитонит, пиелонефрит, новообразования, лейкозы, гепатит, подозрение на СПИД и ВИЧ-инфицирование и др.

В настоящее время отбор донорского материала затрудняется в связи с резко возросшей частотой заболеваний гепатитом «В», «С», СПИДом. Это приводит к браковке до 25 % материала.

Для трансплантации донорских тканей имеет значение:

– адекватные методы их консервации;

– правильное хранение консервированных тканей;

– морфологическое тестирование трансплантатов.

Проблема консервации донорских тканей представляет большой интерес, как с медицинской, так и с биологической точки зрения. Поиск средств защиты тканей от кислородного голодания проводился еще в прошлом столетии и был ничем иным, как попыткой пролонгировать их переживание в неблагоприятных условиях. Консервация гомостатических тканей (кожа, кости, хрящи, сухожилия, аорта, твердая оболочка головного мозга, перикард), выполняющих в организме механическую функцию, сводится лишь к защите их от разложения (Клен, 1962).

Это не может относиться к консервированной роговой оболочке, используемой при сквозной пересадке роговицы. Для этих целей роговица должна сохранять жизнеспособность, так как от этого зависит результат ее приживления, что напрямую влияет на функциональную способность органа зрения.

Таким образом, сохранение и продление сроков жизнеспособности консервированных донорских тканей остается одной из основных проблем современной трансплантологии.

Для использования консервированных тканей в клинической практике возникла необходимость в разработке и внедрении принципиально новых, более надежных критериев оценки жизнеспособности тканей. Все это стало возможным благодаря тесным контактам со специалистами смежных наук – инженерами, математиками, биологами, морфологами, гистологами.

Многочисленные исследования посвящены сохранению жизнеспособности пересаживаемых тканей и преодолению барьера тканевой несовместимости. Отсюда и большое разнообразие методов консервации тканей, целью которых является длительное сохранение нативной структуры трансплантатов и снижение их антигенных свойств. Для полноценного структурного и функционального замещения дефектов при пластических операциях трансплантация тканей рассматривается как биологический метод стимуляции репаративной регенерации.

Современные исследования в области биохимии, биофизики, молекулярной биологии, генетики и др., основанные на методах кибернетики, теории информации, теории регулирования, дают возможность глубже понять диалектический характер физико-химических закономерностей в живых и трупных тканях. Реакции в донорских тканях рассматриваются в неразрывной связи с их структурой, а скорость и направление этих реакций – как комплекс обратных связей, которые обеспечивают устранение или максимальное ограничение действия факторов внешней среды. Тенденция донорских тканей к сохранению постоянства своей структуры составляет их главную особенность наравне с живыми тканями.

Оценить степень жизнеспособности донорских тканей необходимо на уровне их отдельных клеток и клеточных систем.

2. Механизмы интеграции и дезинтеграция клеточного обмена в тканях

Интеграция клеточного обмена в живых тканях осуществляется на уровне ее мембранных образований. То же самое происходит в донорских тканях, взятых от трупов в сроки от 2-х часов до 72 часов.

Электронная микроскопия позволила выявить существование не только наружной мембраны, но и большого количества внутриклеточных мембранных образований, которые разделяют клетку на относительно изолированные друг от друга пространства.

Известно, что клеточные органеллы (митохондрии, микросомы, лизосомы и т.д.) представляют собой сложные мембранные образования.

Мембраны, разделяя клетку и ее органеллы на относительно изолированные пространства, создают предпосылки для регулирования скорости ферментативных реакций, проходящих в тканях, путем перемещения веществ из одних пространств клетки в другие (Дж. Робертсон, 1964). Быстрота химических реакций в клетке обусловлена тем, что большинство из них протекает на мембранах, на высокоспециализированные ферментные системы в определенной последовательности.

Транспорт веществ через клеточные мембраны связан с изменением их механических свойств. Так, накопление К⁺ митохондриями сопряжено с ускорением реакций окислительного фосфорилирования и ведет к сжиманию митохондрий, выход же К⁺ сопряжен с набуханием митохондрий и разобщением фосфорилирования и дыхания в них. Иа поверхности мембран белковые молекулы за счет энергии АТФ катализируют процессы активного трансмембранного транспорта. Ферментативная природа процессов активного транспорта зависит от pH среды, от температуры (Johnstone, 1964). Это обстоятельство учитывается при консервации тканей.

С другой стороны, следует учитывать, что внутренний слой мембран составляют липиды. Липиды мембран связываются с ее белком электростатическими и поляризационными связями типа гидрофобных, которые участвуют в изменении конфигурации мембраны и степени ее плотности.

Таким образом, клеточный обмен в тканях осуществляется мембранными структурами на основе взаимосвязи между отдельными клеточными органеллами. Механизм передачи информации от одной органеллы к другой осуществляется как химическим (за счет изменений концентрации метаболитов, коферментов и т.д.), так и конформационным способом. В реализации последнего способа передачи информации важная роль принадлежит внутриклеточной воде, которая имеет преимущественно кристаллическое строение и обладает анизотропией физических свойств. Интегрируя обмен посредством мембран, клетка за счет кристаллических свойств внутриклеточной воды, способна поддерживать свою структуру. При разрыве внутримолекулярных связей по типу гомолиза образуются свободные радикалы и без дополнительной энергии организованных структур в тканях не происходит.

Гипоксия – причина нарушения метаболизма в тканях. Независимо от вида гипоксии, в основе характерных для нее нарушений лежат энергодефицит и активация свободнорадикальных процессов.

Расстройства гипоксического и свободнорадикального генеза по мере их нарастания ведут к деструкции клеток.

Прекращение доставки кислорода к клеткам вызывает сдвиг окислительно-восстановительного равновесия в них.

Прекращение выработки энергии аэробным путем побуждает клеточную метаболическую машину активировать анаэробный путь обмена. Единственным источником энергии в анаэробных условиях является гликолиз. По мере углубления гипоксии активность ферментов гликолиза подавляется и накапливаются недоокисленные продукты обмена в виде молочной, ацетоуксусной и других кислот.

Процессы дезинтеграции клеточного обмена начинаются с повреждения мембран. Из клеточных элементов митохондрии и микросомы наиболее чувствительны к гипоксии. Пусковым механизмом нарушения мембранных структур является действие гидролитических ферментов лизосом, активизирующихся в условиях внутриклеточного ацидоза, а также свободно радикальное окисление липидов фосфолипидных мембран.

По мере нарастания гипоксии в тканях отмечаются деструктивные изменения, выражающиеся в их отеке, набухании, в конечном итоге приводящие к гибели клеток.

Таблица 1

Пути дезинтеграции обмена при умирании клеток

В здоровых клетках всегда присутствует достаточное количество антиоксидантов-ингибиторов радикальных реакций, которые блокируют активные радикалы, тормозя развитие цепных реакций. К таким веществам относятся: серотонин, каталаза, витамин Е, витамин С, а-токоферол и др. По данным Т.Б. Сусловой с соавт. (1968) ионы Fe⁺² в больших концентрациях также действуют как антиоксиданты перекисного окисления липидов.

При консервации тканей важным является сохранность их жизнеспособности. В качестве критериев гибели тканей использовалась энзиматическая активность клеток. Однако даже при наличии гистологических признаков некроза в тканях активность отдельных ферментов (лактатдегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа и т.д.) может сохраняться. Тканевое дыхание, гликолиз, используемые для оценки жизнеспособности тканей, также являются недостаточно информативными показателями, поскольку обломки гомогенизированных клеток могут при многих обстоятельствах дышать и продолжать накапливать молочную кислоту (Ю.М. Лопухин и др., 1969).

К настоящему времени разработаны и внедрены в практику новые методы оценки жизнеспособности консервированных тканей, в частности, роговой оболочки (С.Н. Федоров, С.А. Борзенок, З.И. Мороз, Ю.А. Комах, 1993).

Предложенный авторами скрининговый неинвазивный тест (адреналиновая проба) является наиболее чувствительным и информативным методом, контролирующим и прогнозирующим функциональную жизнеспособность роговицы как пластического материала.

3. Энергетический обмен в изолированных тканях в норме и при гипоксии

Основным источником энергии в клетке является глюкоза или гликоген, окисление которых происходит либо по пути цикла Кребса, либо по пути пептозного цикла. При повышении энергозатрат в клетке активируется цикл Кребса.

Активация пептозного цикла создает клетке покой, что обеспечивает сохранение ее структуры.

Между обоими метаболическими путями должно поддерживаться состояние динамического равновесия. На окислительно-восстановительные процессы в тканях влияет уровень катехоламинов. В анаэробных условиях процесс регуляции энергетического баланса в клетках затруднен.

Таблица 2

Последовательность нарушений энергетического обмена в тканях при гипоксии

Дефицит энергии в клетках ведет к нарушению свойств ее белков (ферментов), что вызывает накопление свободных радикалов, усугубляющих повреждение клеток.

При консервации тканей мероприятия по пролонгированию их жизнеспособности должны быть направлены на снижение расхода энергии и, прежде всего, потребности клеток в энергосубстратах и кислороде.

4. Пролонгирование энергетического обмена в изолированных тканях при гипоксии

В условиях нарастающего дефицита энергии в тканях при гипоксии с целью регулирования путей метаболизма необходимо обеспечить клеткам функциональный покой и, таким образом, замедлить скорость накопления энергетического долга.

При консервации донорских тканей, как известно, применяются различные фармакологические препараты. Оценка их влияния на жизнеспособность тканей проводится по мембранной проницаемости препаратов. Известны вещества, способные либо стабилизировать, либо лабилизировать клеточные мембраны, повышая их проницаемость. Лабилизация мембран наступает под влиянием средств, способствующих образованию свободных радикалов, таких, как цистеин, глютатион, витамин А. Все эти соединения вызывают необратимое набухание и лизис митохондрий, лизосом, микросом и других мембранных структур клетки. Аналогичное действие оказывают пирогенные стероиды, стрептолизин, изолейцин. В то же время противовоспалительные стероиды: гидрокортизон, кортизон, преднизолон, дексаметазон и др. оказывают на мембраны стабилизирующее влияние. В связи с этим, приемлемым считается обработка донорских тканей противовоспалительными гормонами перед основным процессом консервации. Защитным действием на клеточные мембраны тканей обладает метиленовый синий, бриллиантовый зеленый, некоторые хиноны (витамины Е и К), серотонин, ГОМК (гамма-оксимасляная кислота) и др. Механизм защитного действия ГОМК на ткани заключается в способности этой жирной кислоты образовывать соли с железом – катализатором образования перекисей липидов.

Таким образом, переориентация путей метаболизма с помощью препаратов, стабилизирующих мембранные структуры клеток, ведет к пролонгированию жизнеспособности консервированных изолированных тканей.

5. Трансплантационная терминология

По существующей Международной трансплантологической терминологии различают 5 разновидностей трансплантатов: аутологичные, изогенные, аллогенные, ксеногенные и эксплантаты.

_{Таблица 3}

Международная трансплантологическая терминология (Вена, 1967 г.)

Всеобщее признание получило применение в клинических условиях аллогенных тканей для трансплантации. Аллогенные ткани являются ценным пластическим материалом, применение их приносит в большинстве случаев положительный клинический результат. В офтальмологии из аллогенных тканей используются: роговая оболочка, аорта, твердая мозговая оболочка, перикард.

Ткани считаются полноценными, если в них сохранились первоначальные свойства (пластические, структурные, биологические). Перед трансплантацией донорские ткани нуждаются в создании определенных условий, именуемых консервированием.

При консервации тканей должны выполняться следующие условия:

1) соблюдение стерильности;

2) снижение или приостановление аутолиза;

3) сохранение пластических, структурных, биологических и функциональных свойств.

Соблюдение стерильности достигается путем применения физических или химических методов, а также соблюдением асептики и антисептики. Все это позволяет защитить донорские ткани от микробного разложения. Перед пересадкой стерильность тканей контролируется бактериологическими методами.

Замедление или приостановление аутолиза (ферментативного процесса) в тканях может быть достигнуто применением или антисептических растворов, или физических методов – низкие температуры (Коваленко П.П., 1975).

С целью сохранности структуры и биологических свойств консервированных тканей при их трансплантации для получения оптимальных функциональных результатов должны быть приемлемы лишь те методы консервирования, при которых в тканях сохраняются или восстанавливаются их первоначальные качества.

В настоящее время в РФ с учетом современных достижений офтальмологии и трансплантологии, биофизики и биохимии, молекулярной биологии и патофизиологии сотрудниками ФГУ МНТК «Микрохирургия глаза»им.акад.С.Н разработана оригинальная медико-технологическая система донорской службы (С.Н. Федоров с соавт., 1993). Обоснована правовая база деятельности Глазных тканевых банков РФ. Реализована проблема легитимности забора и заготовки трупных тканей и органов человека для трансплантации в РФ, в том числе, путем издания Приказа Минздравсоцразвития России и РАМН № 357/40 от 25.05.2007г. «Об утверждении Перечня органов и/или тканей человека – объектов трансплантации, Перечня учреждений здравоохранения, осуществляющих трансплантацию органов и/или тканей человека и Перечня учреждений здравоохранения, осуществляющих забор и заготовку органов и/или тканей человека».

Основой медико-технологической системы Глазного банка является система фармакологической защиты сквозного трансплантата роговицы, начиная от отбора и консервации донорского материала до метаболитной коррекции пациентов в послеоперационном периоде. Данное обстоятельство позволило снизить процент возникновения осложнений после проведения кератопластик с 36 % до 17 % и заметно повысить реабилитационный эффект от различных видов кератопластик (З.И. Мороз с соавт., 2007).

Пересадка донорских тканей – это многоуровневый процесс, который подчинен медико-биологической системе «донор-реципиент» (В.Н. Канюков с соавт., 2001), З.И. Мороз с соавт., 2007).

Таблица 4

Медико-биологическая система «Донор-реципиент»

В Оренбургском филиале ФГУ «МНТК «МГ» им.акад. С.Н. Федорова разработана многофакторная система информации о состоянии Глазного банка донорской ткани для обеспечения подбора, обеспечивающего оптимальные условия «донор– реципиент» (В.Н. Канюков с соавт., 2005).

Возникающая при трансплантации реакция биологической тканевой несовместимости донорских тканей диктует необходимость их консервации.