Текст книги "Генетический детектив. От исследования рибосомы к Нобелевской премии"

Глава 5
Мекка кристаллографии

Тем временем в середине 1980-х меня начала выматывать работа в Брукхейвене, где я пытался из имевшегося материала хоть что-то извлечь известными мне методами. К счастью, через несколько лет мне составил компанию Стив Уайт, прибывший из Виттманновского отдела в Берлине. Он вырос в рабочем квартале Ист-Лондона, и шансов куда-то выбиться у него было мало. Однако ум и везение помогли ему поступить в среднюю школу, куда принимали с одиннадцати лет по результатам вступительного экзамена.

Потом он получил высшее образование в Бристоле и защитил кандидатскую в Оксфорде. Общительный и дружелюбный Стив понимал мои неприличные шутки и, как типичный англичанин, любил выпить пива с друзьями и увлекался всевозможным спортом. Его девушка-индианка прилетела к нему, в Америку, но вскоре пара рассталась. Количество женщин в Брукхейвене стремилось к нулю, но каким-то образом Стиву с его английским акцентом, очарованием и душой нараспашку удалось пережить там целую серию романов.

Будучи в Берлине, Стив вместе с Китом Уилсоном, Кристофом Аппельтом и другими работал над решением более осуществимых задач, чем исследование субъединицы: выясняли строение отдельных рибосомных белков. Расшифровали один, затем, после долгого перерыва, – второй, оставалось еще сорок восемь. Но даже если разгадать их все, получится разве что каталог деталей, но не схема сборки. Полагаю, они надеялись, что эти структуры сами подскажут, как из них получается рибосома. Прибыв в Брукхейвен, Стив был полон решимости продолжать начатый проект.

Он оказался подкованным кристаллографом. Я же, в свою очередь, много знал о том, как разбирать рибосому и очищать ее белки. Стив предложил поработать вместе, и наш тандем просуществовал более пятнадцати лет.

Я отправился в Йель, чтобы воспользоваться гигантским биореактором и вырастить в нем достаточное количество тех самых бактерий Bacillus stearothermophilus, на материале которых берлинская группа получила свои первые 50S-кристаллы. Но обнаружив, насколько это кропотливая работа и как мало очищенного белка получается в результате, я стал искать другой способ. Так сложились звезды, что я оказался в нужном месте в нужное время. Мои коллеги Билл Стадиер и Джон Данн пытались заставить обычную бактерию E. coli в больших количествах производить разные белки. Они использовали методы генной инженерии, сшивая промотор («стартовую площадку» для начала транскрипции) от вируса Т7 и ген, кодирующий нужный им белок. Так бактерия E. coli фактически превращалась в фабрику по производству необходимых исследователям белков. Я взял небольшой творческий отпуск, чтобы прямо у нас в отделе изучить инструментарий молекулярной биологии, и попросил Стива немного подождать.

На тот момент в моей команде работали всего двое лаборантов – Сью Эллен Герчман и Вито Грациано, которым пару лет спустя составила компанию Хелен Киця. Под руководством Билла и Джона мы со Сью Эллен быстро клонировали гены всех белков, которые уже успели кристаллизовать Стив и его берлинские коллеги. Вскоре после этого мы сделали еще множество белков и просто просияли, когда генетически измененные или рекомбинантные белки, сделанные в E. coli, кристаллизовались так же, как белки, извлеченные из термофильных бактерий.

В тот период я также работал над гистоном H5 – белком, помогающим сплетать хроматин в волокно и укладывать его в клеточном ядре. В этом белке, который называют линкерным гистоном, есть «сердцевина», именуемая GH5 (глобулярный домен гистона H5). Я хотел ее кристаллизовать, но опыта кристаллизации не имел. Стив сказал: «Это очень просто. Давай покажу».

Любой школьник знает, что, если выпарить сахарный или соляной раствор, то получатся кристаллы. Дело в том, что по мере испарения воды соль или сахар достигают такой концентрации, что становятся нерастворимы. Но если просушить белок, то получится просто бесформенный комок, так как белковые молекулы очень крупные и гибкие, и существует очень много вариантов их соединения. Если налить лимонный сок в молоко, появятся хлопья. Поэтому нужно повышать концентрацию вещества очень медленно, чтобы белковые молекулы успели расположиться стройными рядами и кристаллизоваться. Для этого капельку белкового раствора смешивают с осадителем (например спиртом или солью), который делает белок нерастворимым. Затем эта капля переносится на тонкое покровное стекло, которое переворачивается таким образом, что капля висит над ячейкой с раствором. В те времена эту работу нам приходилось делать вручную, но сегодня роботы аккуратно ставят тысячи опытов с разными вариантами состава белкового раствора.

Вскоре мы со Стивом получили кристаллы не только GH5, но и белка S5 (префикс и число означают, что это примерно пятый по величине белок из малой субъединицы).

Получив кристаллы, я не хотел просто сидеть и наблюдать, как Стив разгадывает структуры этих белков. Хотел сам этому научиться, но боялся. Стив меня приободрил: «Ты подкован в физике, а по сравнению с физикой эта штука – ерунда!» Так я вдохновился на еще одну авантюру; оставалось понять, как к ней подступиться.

Для начала я отправился в Колд-Спринг-Харбор – лабораторию, расположенную примерно в пятидесяти километрах к западу от Брукхейвена, которую возглавлял Джеймс Уотсон собственной персоной. Помимо исследований и симпозиумов там проводились краткие специализированные курсы для ученых, где преподавали эксперты с мировым именем. В 1988 году я прошел двухнедельный курс кристаллографии, и пригласил одного из моих преподавателей, Ганса Дайзенгофера, на пешую прогулку к усадьбе Тедди Рузвельта. Ганс обулся в шикарные туфли и на обратном пути натер мозоли. Думаю, через два дня он забыл о боли, поскольку получил свою долю Нобелевской премии за определение структуры белкового комплекса, преобразующего энергию солнечного света в химическую.

Год спустя в отделе начали задумываться, не предложить ли мне бессрочный контракт. Если бы не предложили – я бы остался без работы. Несколько моих публикаций, посвященных в основном рассеиванию нейтронов, только убеждали меня, что этот метод не дает нужной информации о работе молекул. Все самое интересное разворачивалось в кристаллографии. Едва ли не каждую неделю выходила новая статья с описанием структуры какой-нибудь важной молекулы, навсегда менявшая представления о всей дисциплине. Более того, помощь Стива и прослушанный недавно курс разжигали мой интерес.

Экспертный комитет университета спросил, каковы мои долгосрочные планы. Я собрался с духом и заявил, что если они предложат мне бессрочный контракт, то я брошу то, чем занимаюсь сейчас, возьму годичный творческий отпуск и освою кристаллографию. У меня просто гора с плеч свалилась, когда комитет поддержал эту идею. Через несколько дней Джон Данн вручил мне длинный жезл в алюминиевой фольге и произнес: «Добро пожаловать в постоянный штат!»

Я быстро выбрал место для отпуска: LMB. Именно там зародилась белковая кристаллография. Более того, в Кембридже кристаллография стала наукой, и многие американцы проводили там творческий отпуск с большим удовольствием. Мы с Верой были англофилами, обожали английскую литературу и культуру, смотрели телецикл «Театр шедевров» и понимали своеобразный юмор «Монти Пайтон».

Директором LMB в те годы был Аарон Клуг, выдающийся деятель структурной биологии. Он руководил одной из двух групп, выяснивших строение тРНК (другая группа была коллаборацией, во главе которой стояли Алекс Рич из Массачусетского технологического института (MIT) и Сун-Хо Ким из Университета Дьюка). Как часто случается в борьбе с высокими ставками, гонка за приоритет в получении структуры тРНК завершилась ядовито. Клуг не только мог похвастаться поддержкой Розалинд Франклин и сходством с Вуди Алленом, но и считался ведущим исследователем хроматина. Я набрался смелости и написал ему, что кристаллизовал линкерный гистон, поэтому хотел бы прибыть в LMB, чтобы узнать его структуру с помощью кристаллографии. Через несколько недель он ответил, что с радостью выдвинет меня на стипендию Гуггенхайма. Имея такую стипендию и половину жалованья из Брукхейвена, я всерьез собрался отправиться в Англию на год. Чтобы не разочаровать Аарона, я решил подготовить фактические данные, изучением которых мог бы заняться в творческом отпуске.

Пройденный в Колд-Спринг-Харбор экспресс-курс мне пригодился, но я не знал в подробностях, как собирать и обрабатывать данные. Мне на выручку пришел Боб Свит. Он вырос в сельской части штата Иллинойс, а студенческие годы провел в Калтехе. Защитив кандидатскую в Висконсине, он поступил в LMB в качестве постдока, а до того успел немного поработать преподавателем в Калифорнийском университете Лос-Анджелеса. Как и многие выходцы со Среднего Запада, Боб был англофилом, и, пребывая в Кембридже, использовал англизированную лексику, грамматику и фонетику. Несколькими годами ранее мы с ним почти одновременно прибыли в Брукхейвен и какое-то время были соседями. Впервые увидев его, я сразу поразился его роскошным усам, как у Пуаро; со временем Боб облысел, и усы его становились еще роскошнее. Он умел быть язвительным в своем педантичном и фамильярном стиле, что отбивало у некоторых желание с ним общаться, но мне он казался вдумчивым, теплым и великодушным человеком. Мы крепко сдружились.

В Брукхейвене Боб запускал кристаллографический аппарат, используя пучок синхротронного излучения, и объяснил мне, как собирать и обрабатывать информацию о кристаллах методом внедрения различных комбинаций тяжелых атомов (например, золота или ртути). Отличия в данных, собранных до и после внедрения, позволяли определить позиции тяжелых атомов и фазы рентгеновских отражений от них. Зная о фазах и измерив значения интенсивности, можно вычислить структуру молекулы. Но при внедрении тяжелых атомов качество кристалла портится, если атомы вообще связываются с белками, и данный процесс получил название «внедри и молись». К счастью, в конце 1980-х показал результаты новый метод, названный многоволновой аномальной дифракцией, или MAD.

Голландский кристаллограф Йоханнес Бейфут сформулировал принципы MAD в 1949 году. В их основе лежит способность некоторых атомов поглощать рентгеновские лучи и повторно испускать их, а не рассеивать, образуя отличия в интенсивности пар дифракционных пятен, которые в симметричном кристалле должны быть идентичными. Пары асимметричных пятен называются парами Фриделя. Отличия (аномальные показатели) их интенсивности дают информацию о фазах не хуже тяжелых атомов. Но аномалии рассеивания от атомов биомолекул, скажем углерода, азота и кислорода, недостаточны для исследований. Эту проблему в 1980 году решил Уэйн Хендриксон из Исследовательской лаборатории ВМФ. Воспользовавшись аномальным рассеянием от атомов серы, содержащихся в белке, он получил структуру (атомы серы входят в состав цистеина, одной из аминокислот).

В то время для рентгеновской кристаллографии стали применять синхротроны – ускорители частиц, разгоняющие электроны почти до скорости света. При вращении электроны испускают крайне интенсивные рентгеновские пучки, которые можно использовать в дифракционных исследованиях. Кейт Ходжсон и его коллеги из Стэнфорда догадались, что синхротрон, среди прочего, позволяет с точностью подбирать длину волны рентгеновских лучей, что дает возможность собрать данные на двух длинах волн, где рассеяние от некоторых специальных атомов будет значительно меняться. На основании разницы между двумя полученными множествами данных можно определить положения конкретных атомов и рассчитать фазы их отражений. Более того, можно сделать на одной из длин волн аномальное рассеяние от определенного атома особенно выраженным.

Уэйн Хендриксон тщательно разработал формальную модель для таких операций, отличную от модели Ходжсона, и определил структуры нескольких белков. Затем Уэйн предложил блестящую идею: выращивать бактерии, у которых в аминокислоте метионине вместо атома серы присутствует атом селена – заменить метионин на селенометионин. Аномальное рассеяние у селена более выраженно, чем у серы при типичных длинах волн рентгеновских лучей, причем пиковое значение селена приходится на длину, очень удобную для измерений в синхротроне, – около 1 ангстрема (или 0,1 нм). Поэтому метод получился невероятно мощным. Он позволил расшифровать структуру любого белка, где в значительном количестве присутствует метионин, и сегодня остается основным способом изучения новых белков.

Бобу было интересно попробовать этот метод на своих приборах в брукхейвенском синхротроне. Вито Грациано синтезировал кристаллы GH5, начиненные селенометионином, и вместе с Бобом мы тщательно собрали данные с волн, отраженных от атома селена. Стив также помог мне собрать данные по S5, но традиционным методом с использованием тяжелых атомов, где внедряли в кристаллы соединение золота. Теперь я располагал подробными данными по двум белкам, но понятия не имел, что с ними делать. Пришло время отправиться в творческий отпуск.

Мы с семьей полетели в Англию в конце августа 1991 года. После посадки я взял напрокат вместительный минивэн, куда мы погрузились вчетвером вместе со всем багажом и тремя велосипедами. Несмотря на то что требовалось привыкать к левостороннему движению после ночного перелета, я ухитрился доставить нас в Кембридж без происшествий. Когда мы добрались до района Эддинбрукской больницы, я просто потерялся в извилистом лабиринте улочек и спрашивал у прохожих, как проехать в молекулярно-биологическую лабораторию MRC. К моему великому удивлению, первые несколько человек, к которым я обратился, понятия не имели, где находится эта всемирно известная лаборатория! Мне сразу же вспомнилась история из автобиографии Крика «Безумный поиск»[12]12
  Крик Ф. Безумный поиск: личный взгляд на научное открытие / Пер. с англ. Л. Газизуллиной. – М.; Ижевск: Институт компьютерных исследований, 2004.


[Закрыть], где он рассказывает о таксисте, никогда не слышавшем о Кавендишской лаборатории, которая известна ученым со всего мира уже более сотни лет. Так я понял, что известность в научных кругах – штука довольно узкая.

Рис. 5.1. Автор и Стив Уайт смотрят на брукхейвенский синхротрон (публикуется с разрешения Роберта Свита)

Аарон назначил моим официальным «принимающим» своего давнего коллегу Джона Финча. Финч, как и Аарон, трудился в лаборатории Розалинд Франклин и вместе с Аароном перебрался в Кембридж, когда открылся новый корпус LMB. Когда я прибыл, Джон сказал мне, что, к сожалению, прямо сейчас он не может предложить мне рабочее место. Я достаточно наивно заявил, что мне сойдет и маленький столик где-нибудь в углу у него в лаборатории. В ответ Джон вежливо улыбнулся, и на следующий день я убедился, что у него, ученого с мировым именем, есть только небольшой письменный стол и часть лабораторного стола!

В те времена в LMB так было принято: многие заслуженные ученые не имели своей лаборатории, а зачастую довольствовались лишь рабочим местом в общем помещении, где оборудование стояло в проходах и свободного места почти не оставалось. Вполне возможно, именно такая теснота была залогом успеха LMB, так как сотрудникам было проще общаться друг с другом, делиться идеями и обсуждать методы.

В первый полный рабочий день я явился к девяти утра, а часа через полтора подошел Джон и спросил меня, не хотел бы я сходить в столовую за кофе. Я подумал, что еще почти ничего не успел сделать, и отказал, сказав, что не пью кофе. Джон вновь одарил меня одной из своих загадочных улыбок, а коллега, наблюдавший за этим, сказал: «Он еще наших порядков не выучил». Шли дни, и я понял, что регулярные перерывы на перекус или кофе позволяли ученым неофициально пообщаться в столовой на верхнем этаже: впоследствии такие столовые были устроены и во многих других научных зданиях. Человек способен сохранять максимальную сосредоточенность на работе не более двух часов за раз. Эти краткие перерывы помогли мне познакомиться со множеством ученых и даже завести близких друзей.

За год, проведенный в LMB, я осознал, насколько особенное это место: лаборатория полностью изменила мои взгляды на науку. Неудивительно, что многие ученые со всего мира считают ее образцом правильного подхода к науке, даже если им не всегда удается убедить собственную организацию перенять ее пример; замечательным исключением из этого правила является исследовательский кампус Джанелия при Медицинском институте Говарда Хьюза, который целенаправленно смоделирован по примеру LMB, а также Лаборатории Белла. Я обнаружил, что, в отличие от абсолютного большинства ученых, почти никто в LMB не занимался рутинными задачами с той лишь мотивацией, что такая работа даст материал для публикации. Напротив, они пытались формулировать самые интересные вопросы в своей исследовательской области, а затем разрабатывать пути к ответу на них. Простой, но характерный вопрос, который там было принято задавать: «Почему вы этим занимаетесь?» Другой урок заключался в том, что даже самые знаменитые ученые, такие, как Перуц или Клуг, без колебаний были готовы задавать на лекциях такие вопросы, которые казались тривиальными профессионалам в данной теме. Так я осознал, что не должен стыдиться своего невежества, и не бывает столь тупых вопросов, которые не стоит задавать, если тебя по-настоящему интересует ответ.

Третий урок заключался в следующем: своим успехом LMB была в значительной степени обязана тому, что ее сотрудники работали небольшими командами всего по несколько человек. Таким образом, лидеры групп были сосредоточены на самых интересных вопросах, причем участвовали в деле всей команды или тщательно следили за ходом актуальных работ. Сегодня существует тенденция у знаменитых профессоров собирать вокруг себя гигантские группы по двадцать-тридцать человек просто потому, что могут себе позволить. Для профессора это, возможно, великолепно, но такая среда не слишком располагает для обучения подопечных, поскольку многим из них в проработку отдаются малоинтересные проблемы. Исследования подтверждают: чем больше группа, тем меньше ее продуктивность.

При нашей первой встрече Аарон сказал мне, что, на его взгляд, структура GH5 не столь интересна сама по себе, и порекомендовал мне поставить несколько опытов, чтобы попытаться привязать ее к фрагменту ДНК. Не решаясь перечить Клугу, я принялся за проработку его предложения, обосновавшись за одним лабораторным столом с его постдоком Уэсом Сундквистом. Примерно через месяц я осознал, что на решение этой задачи не хватит творческого отпуска, и сказал Аарону, что не считаю этот подход полезным, поэтому хочу поработать с данными, которые привез с собой. Он на удивление быстро согласился и как будто стал меня больше уважать. Уэсу казалось забавным наблюдать, как брошенный мной эксперимент постепенно выдыхается и зарастает пылью.

Даже если бы Аарон располагал достаточным временем, он бы не мог рассказать мне всю подноготную о разгадке структуры кристаллов, поскольку с тех пор, как он начал заниматься такими работами, компьютерные программы сильно изменились. К счастью, LMB была и остается одним из самых дружных коллективов, какие мне доводилось видеть. И молодые ученые, например Пол Маклафлин, и именитые кристаллографы, такие как Эндрю Лесли и Фил Эванс, с готовностью мне помогали. Очень скоро я уже рассматривал подробную карту рибосомного белка S5 и выстраивал его атомную модель.

Невозможно преувеличить упоение, с которым собираешь такую структуру. До тех пор, пока к этому не приступишь, молекула – словно черный ящик. Но словно раздвигается занавес, и молекула предстает во всей красе, с перегибами и петлями цепочки, свертывающейся в уникальную архитектуру. Наверное, такие чувства могли испытывать первопроходцы, перед которыми открывается незнакомый ландшафт.

Но разгадка структуры GH5 приобрела интересный поворот. До того самого времени практически любую молекулу, расшифрованную MAD-методом, формализовали на языке научного аппарата, разработанного Уэйном Хендриксоном. Сложная система учета, описывавшая схожие измерения, отдельно выполняемые для разных длин волн, была неудобна и не предусматривала тонких механизмов обработки ошибок, какие применялись в кристаллографии. Без такой обработки сигнал получался слишком слабым. В типичном тяжелом атоме около 80 электронов, но обычная изменчивость свойств селена на разных длинах волн при MAD-эксперименте соответствовала разбежке всего в несколько электронов. Чудо, что этот метод вообще работал, так как разница при рассеянии в пересчете на несколько электронов была едва заметна.

Пользуясь выверенными программами Уэйна, я получил, как мне казалось, годную карту GH5 и принялся выстраивать его структуру. В тот период Фил Эванс вернулся из поездки в Йорк, где работала его приятельница Элеанор Додсон, полагавшая, что новая программа по разгадке структур с тяжелыми атомами также может пригодиться и при MAD-эксперименте. Я отнесся к этому скептически, но решил попробовать. Каково же было мое удивление, когда всего через несколько часов у меня получилась гораздо более точная карта, при помощи которой мы и расшифровали структуру GH5, а затем опубликовали результаты. После выхода нашей статьи уже практически никто не пользовался программами Уэйна.

MAD-метод работал, несмотря на столь слабый сигнал, потому, что ошибки при эксперименте были еще незначительнее. Важна была не сила сигнала, а погрешность (то, насколько он перекрывает «помехи»). В данном случае ученые говорят о соотношении «сигнал – шум». При стандартном методе с использованием тяжелых атомов два кристалла никогда не будут идентичны по форме. Чтобы получить между ними достаточную разницу, нужно убедиться, что все факторы скомпенсированы и довольно сложно рассматривать два множества данных в одинаковом масштабе. Другая проблема заключается в том, что при добавлении тяжелого атома меняется структура всей остальной молекулы, это свойство называется неизоморфностью. Таким образом, точно сравнить два множества данных невозможно. В MAD-эксперименте эти проблемы отсутствуют. Данные по двум длинам волн собираются с одного и того же кристалла, а аномальные отличия между двумя пятнами, связанными по признаку симметрии, измеряются не только на одном и том же кристалле, но и на одинаковой длине волны, зачастую одновременно. Поэтому соотношение «сигнал – шум» при MAD очень выгодное.

Истинный потенциал аномального рассеяния я осознал не сразу. На тот момент я просто не хотел выглядеть дураком на фоне Аарона. С другой стороны, в Кембридже я достиг именно того, к чему стремился, а статьи о двух расшифрованных мною структурах вскоре были опубликованы в Nature. Вернувшись из отпуска, я понял, что хочу браться за самые серьезные вопросы в моей специализации.