Текст книги "Структурная биохимия"

Нуклеиновые кислоты
Первичная структура ДНК и РНК

Молекула НК (нуклеиновой кислоты) высокомолекулярное соединение, мономером которого является нуклеотид. Рибоза и дезоксирибоза входят в состав НК в виде циклической формы. Нуклеотиды присоединяются через остатки фосфорной кислоты, в результате образуя сахаро-фосфатный остов, где остаток сахара чередуется с остатком фосфорной кислоты. Остаток фосфорной кислоты присоединяется к 3́-гидроксильной группы предыдущего сахара и 5́ -гидроксилом следующего. Молекула асимметрична, есть 5́ и 3́ концы, началом молекулы является 5́-конец, концом 3́, так как синтез молекул нуклеиновых кислот происходит от 5́ к 3́ концу. ДНК и РНК различаются прежде всего по молекулам пентозы, входящим их состав. В РНК входит рибоза, в ДНК – дезоксирибоза. Различие между этими пентозами заключается в наличии ОН группы в 2́ положении у рибозы. Эта группа обуславливает нестабильность и большую реакционную способность РНК (способность осуществлять катализ и реакции внутри молекулы). У – образуется в результате дезаминирования Ц, если бы это основание входило в состав ДНК точность репарации уменьшилась бы. Также существуют другие различия РНК и ДНК, которые представлены в таблице 1.

Рисунок 39. Первичная структура нуклеиновых кислот

Таблица 1. Различия между РНК и ДНК.

Первичная структура ДНК предполагает формирование следующего уровня организации, в данном случае – вторичной структуры ДНК.

Вторичная структура ДНК

Рисунок 40. В-форма ДНК. А-общий план структуры В-формы ДНК, Б-структура водородных связей между основаниями в ДНК

Вторичная структура ДНК представляет собой двухспиральную молекулу. Две спиральные полинуклеотидные цепи закручены вокруг общей оси. Цепи направлены в противоположные стороны, то есть антипараллельны. То есть 3́-конец одной цепи взаимодействует с 5́-концом другой цепи. Цепи правозакрученные.

Две цепи удерживаются вместе водородными связями между парами оснований. Аденин всегда спаривается с тимином, гуанин – с цитозином. Это обеспечивается принципом комплементарности – структурного и химического соответствия молекул друг другу. Аденозин в ДНК комплементарен тимину и между основаниями образуется две водородные связи. Гуанин комплементарен цитозину, образуя три водородные связи. Это возможно из-за жесткой структуры азотистых оснований.

Пуриновые и пиримидиновые основания расположены внутри спирали, а остатки фосфата и дезоксирибозы – снаружи. Плоскости оснований перпендикулярны оси спирали. Плоскости двух спаренных оснований образуют стопку. Между плоскостями образуются дополнительные связи между собой. Плоскости остатков сахара расположены почти под прямым углом к основаниям.

Диаметр спирали 20А. Расстояние между соседними основаниями вдоль оси спирали 3,4А, они повернуты относительно друг друга на 36°. Таким образом, на один виток спирали каждой из цепей приходится 10 нуклеотидов, что соответствует 34А.

На последовательность оснований в полинуклеотидной цепи не накладывается никаких ограничений. Определенная последовательность оснований несет конкретную генетическую информацию.

Описанная вторичная структура ДНК была расшифрована Уотсоном и Криком, это самая распространенная форма ДНК и она получила название В-формы. Существует несколько форм ДНК (Таблица 2).

Таблица 2. Формы вторичной структуры ДНК

Рисунок 41. Структура различных форм ДНК. А – структура основных форм ДНК; Б – структура Н-формы ДНК; В – структура неканонических худстиновских взаимодействий

вторичная Структура РНК

РНК образована рибонуклеотидами, также состоящими из азотистого основания, пентозы и остатка фосфорной кислоты. Различия заключаются в том, что в РНК рибоза и составе азотистых оснований. Эти различия связаны с функциями РНК и ДНК. Наличие же рибозы в сахарофосфатном остове делает его менее стабильным (разрывы, накопление ошибок при передаче информации дочерним клеткам) но позволяет осуществлять каталитическую функцию. РНК в отличие от ДНК одноцепочечная и образует сложную вторичную и третичную структуры, что также позволяет осуществлять каталитическую функцию. Вторичные структуры РНК петля и спираль обеспечивают образование простых и сложных шпилек. Спирали РНК образованы комплементарными основаниями и по строению сходны с В-спиралью ДНК, то есть сходны по структуре с В-формой ДНК, различие в том что двойную спираль образуют не две отдельные цепи, а комплементарные и антипараллельные участки одной цепи РНК. Также следует отметить, что в образовании вторичной структуры РНК участвуют не только основные, но и минорные нуклеотиды, следовательно образуются как канонические, так и неканонические связи. Следует отметить, что образованные спирали короче, и составляют всего несколько десятков оснований и длина их зависит от длины комплементарных последовательностей нуклеотидов. Петли РНК представляют собой неспаренные основания. В спиралях РНК возможно наличие неспаренных оснований, которые образуют выпетливания.

Рисунок 42. Вторичная структура РНК. А-структура тРНК, Б-структура рРНК

Наиболее хорошо изучена вторичная структура тРНК, в виде структуры клеверного листа. В ней наблюдается три шпильки: антикодоновая, псевдоуридиновая и дигидроуриновая, также аминоакцепторный стебель и вариабельная петля. Вариабельная петля обеспечивает различия в длине молекул тРНК (Рисунок 42). РНК, принимая вторичную структуру, обеспечивает третичную, это более высокий уровень организации. В третичной структуре спирали или стебли взаимодействуют между собой или/и с одноцепочечными фрагментами или петлями, образуя более высоко организованные структуры. Также одной из форм третичной структуры является узел – в нем может участвовать несколько цепей РНК и взаимодействие обуславливается как комплементарными (Уотсон-Криковскими) так и худстиновскими взаимодействиями (аналогичные взаимодействия в Н-форме ДНК). Вторичная структура РНК обуславливает формирование третичной структуры, когда петли и шпильки образуют более сложную структуру взаимодействуя между собой. В ходе формирования третичной структуры тРНК образует L-образную структуру. Аминоакцепторный стебель и псевдоуридиновая шпилька взаимодействуют между собой образуя, образуя одну часть L-образной структуры, антикодоновая и дигидроуридиновая шпильки связываются вместе, образуя вторую часть. Вариабельная петля взаимодействует с ними в участке соединения, образуя узел и стабилизируя новые структуры.

Качественное определение ДНК и РНК

Для определения типа нуклеиновой кислоты необходимо идентифицировать сахар. Наиболее часто применяемыми методами являются колориметрические; их можно использовать для количественного определения углеводов как таковых или, соответственно модифицировав методику, для определения нуклеиновых кислот, нуклеотидов и других производных.

Некоторые из методов определения пентозы основаны на высвобождении фурфурола после нагревания с НСl. Фурфурол дает красное окрашивание с ацетатом анилина или желтое окрашивание с π-бромфенилгидразином. Рибоза дает характерную окраску после реакции с орцином в соответствующих условиях.

Если ДНК нагревать с дифениламином в кислом растворе, то наблюдается синее окрашивание. При реакции Фойльгена дезоксирибоза или ДНК после частичного кислотного гитдролиза дают сине-фиолетовую окраску.

Гель-электрофорез

Молекулы нуклеиновых кислот заряжены отрицательно, следовательно в электрическом поле будут двигаться к положительному электроду. Если обеспечить перемещение через среду с ячейками, то есть гель с определенным размером ячеек, то линейные молекулы нуклеиновых кислот будут проходить через ячейки. Чем больше молекула, тем больше времени ей необходимо для прохождения через ячейки геля, следовательно чем короче молекула нуклеиновой кислоты тем дальше она сможет уйти в геле по сравнению с более длинной. Это метод позволяет разделить смесь нуклеиновых кислот по длине, а также при наличии смеси фрагментов с известными размерами и определить длину исследуемых фрагментов (Рисунок 43).

Рисунок 43. Гель-электрофорез ДНК в агарозном геле. М – маркер (Смесь молекул ДНК с известной длиной)

Плотность ДНК

Если концентрированные растворы хлорида цезия центрифугировать в аналитической ультрацентрифуге при высоких скоростях до установления равновесия между седиментацией и диффузией, создается стабильный градиент концентрации CsCl. Это соответствует увеличению плотности раствора в направлении центробежной силы. Формируемый градиент плотности пропорционален центробежной силе в соответствии с уравнением

dp/dr=aω²r,

где ρ – плотность, являющаяся функцией от радиуса r (расстояние от центра вращения), ω – угловая скорость и α – константа, зависящая от природы соли. Если раствор CsCl содержит небольшое количество ДНК, то в условиях равновесия молекулы ДНК собираются в полосы в тех зонах ячейки для центрифугирования, где их плотность и плотность среды равны (изопикничны). Положение ДНК в ячейке может быть установлено по поглощению в ультрафиолетовой области, регистрируемому с помощью фотографии. Точно вычислив градиент плотности раствора вдоль ячейки, можно найти плотность образца ДНК. Эта техника называется изопикническим центрифугированием в градиенте плотности. Плавучая плотность ДНК находится в эмпирической зависимости от содержания G+C в молекуле:

ρ (г/см³) = 1,660 +0.100 (содержание G + С)

Это свойство позволяет фракционировать молекулы ДНК по содержанию в них G+C, а также по размеру молекулы.

Денатурация ДНК

Денатурация – разрушение вторичной структуры за счет распада водородных связей. В результате двойные спирали ДНК и РНК разрушаются, и образуются статистические клубки одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот.

Чаще всего используют температурную, но может быть и химическая (денатурирующие агенты мочевина, формамид и формальдегид). Температурная денатурация происходит под действием тепловой энергии сообщаемой при нагревании, в результате увеличивается частота и энергия колебаний и слабые водородные связи разрушаются. При химической денатурации молекулы денатурирующего агента конкурируют за водородные связи и азотистые основания взаимодействуют не друг с другом, образуя вторичную структуру, а с денатурирующими агентами.

Температура при которой денатурирована половина молекул – температура плавления

Температура плавления зависит от длины молекулы и ее G/C состава, так как чем больше водородных связей нужно разорвать, тем больше энергии необходимо сообщить системе, а, следовательно, больше нагреть. Чем больше длина молекулы, тем больше нуклеотидов, образует вторичную структуру, а также больше водородных связей во вторичной структуре. При взаимодействии аденина с тимином две связи, гуанина с цитидином три, каждая пара G/C дает на одну связь больше, и увеличивается количество поглощенной энергии. Определение температуры плавления следует проводить при фиксированной ионной силе и рН, так как эти факторы существенно влияют на стабильность ДНК. Значение Т_пл можно снизить, добавляя мочевину – реагент, разрушающий водородные связи и препятствующий гидрофобным взаимодействиям. Например, в 8М мочевине Т_пл снижается до 20°С. В 95%-ном формамиде ДНК полностью разделяется на две нити при комнатной температуре. Аналогично в кислых растворах вблизи рН 2—3, при которых протонируются аминогруппы, спираль разрушается. Степень денатурированности ДНК определяется несколькими способами.

Поглощение в УФ-области

Все нуклеиновые кислоты сильно поглощают свет в УФ-области с максимумом 260 нм. Когда нативность ДНК нарушается, наблюдается заметный гиперхромный эффект – увеличение поглощения. Это изменение отражает уменьшение числа водородных связей и отмечается не только для ДНК, но и для РНК и синтетических полинуклеотидов, которые имеют стабилизируемую водородными связями структуру.

Оптическое вращение

Нативная ДНК обладает сильным положительным вращением плоскости поляризации света, которая заметно уменьшается при денатурации.

Вязкость

Растворы нативной ДНК имеют высокую вязкость, что является следствием наличия относительно жесткой двуспиральной и вытянутой стержнеподобной структуры ДНК. Разрушение водородных связей приводит к заметному уменьшению вязкости.

Ренатурация ДНК

Денатурация ДНК – процесс обратимый. Если ДНК только частично денатурирована, например, при нагревании, то при снижении температуры происходит быстрая ренатурация каждой молекулы ДНК, скорость которой соответствует реакции первого порядка. Если ДНК полностью денатурирована, две комплементарные нити будут реассоциировать медленно («отжиг» ДНК). Этот процесс включает две стадии: сначала по реакции второго порядка происходит сборка комплементарных последовательностей двух нитей, а затем по реакции первого порядка – быстрое их «защелкивание». Если начальная концентрация денатурированной ДНК – C₀ (молярная концентрация фосфата ДНК), то изменение концентрации С одноцепочечной ДНК во времени подчиняется уравнению реакции второго порядка

dc/dt – K₂C²

интегральная форма которого

С/C₀ = 1/ (1 +K2C₀t)

Скорость ренатурации обычно оценивается по графику зависимости С/С₀ от lgC_ot. Построив график, можно найти C₀ t_1/2, где t _1/2 – время, при котором С/С₀ = 0,5, а также константу скорости реакции второго порядка K₂, равную 1/C₀t_1/2. Константа K₂– характеристический параметр для данной ДНК; она обратно пропорциональна N – числу пар оснований ДНК (если ДНК не имеет повторяющихся последовательностей). C₀ t_1/2 прямо пропорционально N (N называется сложностью ДНК). Этот метод позволяет определить для бактериальных и вирусных ДНК значения N, согласующиеся со значениями, полученными другими методами.

Липиды и мембраны

Если животную или растительную ткань последовательно обрабатывать одним или несколькими органическими растворителями, например этанолом, эфиром, хлороформом, бензолом или петролейным эфиром, то некоторая часть материала перейдет в раствор. Компоненты такой растворимой фракции (вытяжки) называются липидами.

Липиды – это все гидрофобные молекулы клетки, растворимые в органических растворителях.

Классификация липидов

Липидная фракция содержит вещества различных типов, которые могут быть классифицированы следующим образом:

I. Жирные кислоты

II. Глицеринсодержащие липиды

а) нейтральные жиры

1) моно-, ди– и триацилглицерины

2) простые эфиры глицерина

3) гликозилглицериды

б) фосфоглицериды

1) фосфатиды

2) дифосфатидилглицериды и фосфоинозитиды

III. Липиды, не содержащие глицерин

а) сфинголипиды

1) церамиды

2) сфингомиелины

3) гликосфинголипиды

б) алифатические спирты и воска

в) терпены

г) стероиды

IV. Липиды, связанные с веществами других классов

а) липопротеины

б) протеолипиды

Из-за гетерогенности входящих в липидную фракцию компонентов термин «липидная фракция» нельзя рассматривать как структурную характеристику; он является лишь рабочим лабораторным названием фракции, получаемой при экстракции биологического материала малополярными растворителями. Однако большинство липидов имеет некоторые общие структурные особенности, обусловливающие их важные биологические свойства так же, как и сходную растворимость. В большинстве случаев они являются ионными или полярными производными углеводородов и принадлежат к классу веществ, называемых амфифилами или бифилами. Амфифилы [amphi (греч.) – оба; phyle (греч.) – сродство] содержат полярные или ионные гидрофильные группировки, а также гидрофобные неполярные углеводородные группировки. Свойства амфифилов в значительной степени определяются природой этих группировок. Так, некоторые липиды, такие, как нейтральные жиры, очень слабополярны и, как следствие, имеют очень низкое сродство к воде. Они хранятся в клетках, как правило, в безводном состоянии и служат энергетическими «резервуарами». Другие липиды, такие, как фосфоглицериды и сфинголипиды, более полярны; вследствие выраженных амфифильных свойств они являются основными структурными компонентами различных биологических мембран, служащих своеобразными «перегородками» в живой материи. Таким образом, рассмотрение структуры и свойств различных липидов очень важно для понимания их разнообразных биологических функций.

Жирные кислоты

Жирные кислоты входят в состав практически всех липидов, поэтому они хотя и практически не встречаются в свободном виде являются отдельным классом липидов.

Биологически важные жирные кислоты характеризуются следующими особенностями:

являются, как правило, монокарбоновыми кислотами, содержащими одну ионизируемую карбоксильную группу и неполярную углеводородную цепь;

обычно содержат четное число атомов углерода, хотя в природе встречаются также и жирные кислоты с нечетным числом углеродных атомов;

в состав жирных кислот входит от 12 до 26 атомов углерода;

представляют собой либо насыщенные соединения, либо соединения с одной или несколькими двойными связями.

Общая формула жирных кислот: R‒COOH.

Где R – углеводородный радикал имеющий разнообразную структуру, по которой жирные кислоты можно классифицировать на:

А. Насыщенные жирные кислоты

Насыщенные жирные кислоты являются членами гомологического ряда, начинающегося с уксусной кислоты. Углеводородный радикал полностью насыщен, то есть не содержит ни двойных, ни тройных связей, ни других группировок. Существуют и другие члены ряда, с большим числом углеродных атомов, они встречаются в первую очередь в восках. Было выделено – как из растительных, так и из животных организмов несколько жирных кислот с разветвленной цепью. При нумерации углеродных атомов первым считается углерод карбоксильной группы (С-1). В типичных липидах животного происхождения преобладающей насыщенной жирной кислотой является пальмитиновая (C16), второе место занимает стеариновая кислота (C18). Более короткие жирные кислоты (C14 и C12), так же как и более длинные (до C28), встречаются лишь в небольших количествах. Жирные кислоты, содержащие 10 или меньше углеродных атомов, вообще редко встречаются в животных липидах.

Б. Ненасыщенные жирные кислоты.

В названиях этих соединений по женевской номенклатуре число углеродных атомов в молекуле указывается таким же способом, что и для соответствующих насыщенных кислот (с помощью греческих числительных), а число двойных связей – с помощью суффиксов («ен» – одна, «диен» – две, «триен» – три связи и т. д.). Положение двойной связи обозначается номером ближайшего к карбоксильной группе атома углерода, участвующего в образовании этой связи. Так, например, двойная связь в цис-9-гексадеценовой кислоте находится между девятым и десятым углеродными атомами, а двойные связи в цис-9,12-октадекадиеновой кислоте расположены между 9—10 и 12—13 атомами углерода. Одиночная двойная связь в жирных кислотах животного происхождения обычно находится в 9,10-положении. Двумя преобладающими мононенасыщенными жирными кислотами животных липидов являются олеиновая (C18:1Δ9) и пальмитоолеиновая. Олеиновая кислота является более широко распространенной в природе и превалирует в количественном отношении. Так же известны и распространены линоленовая с тремя двойными связями и арахидоновая кислота (C20:4Δ Δ 5; 8; 11;14) с четырьмя двойными связями.

Ненасыщенные жирные кислоты подразделяют в соответствии со степенью ненасыщенности.

Мононенасыщенные (моноэтеноидные, моноеновые) кислоты.

Полиненасыщенные (полиэтеноидные, полиеновые) кислоты.

Эйкозаноиды. Эти соединения, образующиеся из эйкоза– (20С) -полиеновых жирных кислот, подразделяются на простаноиды и лейкотриены (ЛТ). Простаноиды включают простагландины (ПГ), простациклины (ПГ-1) и тромбоксаны (ТО). Иногда термин простагландины употребляется в менее строгом смысле и означает все простаноиды.

Простагландины были первоначально обнаружены в семенной жидкости, но затем найдены в составе практически всех тканей млекопитающих; они обладают целым рядом важных физиологических и фармакологических свойств. Они синтезируются in vivo путем циклизации участка в центре углеродной цепи 20 С (эйкозановых) полиненасыщенных жирных кислот (например, арахидоновой кислоты) с образованием циклопентанового кольца. Родственная серия соединений, тромбоксаны, обнаруженные в тромбоцитах, содержат циклопентановое кольцо, в которое включен атом кислорода (оксановое кольцо). Три различные эйкозановые жирные кислоты приводят к образованию трех групп эйкозаноидов, различающихся числом двойных связей в боковых цепях – ПГ1 ПГ2 и ПГ3. К кольцу могут быть присоединены различные группы, дающие на и тромбоксанов, которые обозначаются А, В и т. д. Например, простагландин Е-типа (ПГ-Е2) содержит кетогруппу в положении 9, тогда как в простагландине F-типа в этом же положении стоит гидроксильная группа. Лейкотриены являются третьей группой эикозаноидных производных, они образуются не путем циклизации жирных кислот, а в результате действия ферментов липоксигеназного пути. Они были впервые найдены в лейкоцитах и характеризуются наличием трех сопряженных двойных связей.

Другие ненасыщенные жирные кислоты. В материалах биологического происхождения были найдены и многие другие жирные кислоты, содержащие, в частности, гидроксильные группы (рицинолевая кислота) или циклические группы.

В. Другие жирные кислоты

В некоторых бактериях и растениях были найдены жирные кислоты, содержащие циклопропановое кольцо, в качестве примера можно привести лактобацилловую и стрекуловую кислоты. Биосинтез таких кислот происходит путем переноса метиленовой группы от S-аденозилметионина на двойную связь мононенасыщенных кислот. Наконец, в природных липидах встречаются и гидроксикислоты входящие, как правило, в состав липидов бактериальных клеток. Их представителями являются 2 (3) -гидроксипальмитиновая, 2 (3) -гидроксистеариновая и 2-гидроксилигноцериновая (цереброновая) кислоты. В некоторых бактериях и растениях были найдены жирные кислоты, содержащие циклопропановое кольцо, в качестве примера можно привести лактобацилловую и стрекуловую кислоты. Биосинтез таких кислот происходит путем переноса метиленовой группы от S-аденозилметионина на двойную связь моноеновых кислот.