Текст книги "Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии"

Глава 2.
ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ КРАСИТЕЛИ И ДРУГИЕ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

В современных морфологических исследованиях, в случае использования флуоресцентной микроскопии и конфокальной лазерной микроскопии, для окрашивания препаратов применяют различные флуоресцентные красители. При проведении иммуноцитохимических исследований связанные с клеточными и тканевыми антигенами антитела выявляются благодаря включению флуоресцентной метки. Флуоресцирующие вещества, используемые в качестве флуоресцентной метки, присоединенной к нефлуоресцирующим молекулам (нуклеотидам, пептидам, антителам), а также флуоресцентные красители принято называть флуорохромами. Флуоресцентные красители и другие флуорохромы способны расходовать часть энергии поглощенного излучения на флуоресценцию (излучение определенной длины волны) при возвращении из возбужденного состояния в стабильное. Каждый флуорохром обладает индивидуальным спектром излучения и поглощения, наиболее интенсивная флуоресценция наблюдается при облучении красителя светом с длиной волны, близкой к характерному для него максимуму поглощения.

Флуоресцентные красители применяются для выявления биологических макромолекул (белки, нуклеиновые кислоты) или определенных органелл клетки, таких как митохондрии, аппарат Гольджи, эндоплазматическая сеть, а также для выявления клеточного ядра. Для окраски живых объектов применяются такие красители, которые могут проникать в живые клетки, не вызывая их повреждения. Часть существующих красителей (не проникающих в живые клетки либо токсичных для них) используется только для окраски фиксированных биологических объектов. Другие флуоресцирующие вещества (флуоресцентные индикаторы) используются для мониторинга динамических процессов в живых клетках (определение концентрации неорганических ионов, рН, активных форм кислорода и мембранного потенциала). Флуоресцентные красители также широко применяются при определении целостности клеток, при изучении эндо– и экзоцитоза, текучести мембран, межклеточной коммуникации и ферментативной активности клеток. Флуорохромы, взаимодействующие с нуклеотидами, нашли широкое применение в области молекулярной генетики и при проведении цитогенетических исследований.

Использование лазерной конфокальной микроскопии для изучения объектов, подвергнутых окраске флуоресцентными красителями, дает возможность определять локализацию специфических молекул и органелл с высокой точностью. Сочетание нескольких красителей и флуоресцентных меток с различными параметрами излучения позволяет проводить двойную, тройную (и более) маркировку с целью обнаружения нескольких молекулярных компонентов в одном образце.

Некоторые низкомолекулярные органические красители проявляют сродство к определенным биомолекулам и клеточным органеллам. Это явление используется для селективной флуоресцентной окраски. Так, например, амилоидные структуры флуоресцируют при взаимодействии с тиофлавинами (Коржевский Д. Э. [и др.], 2013). Флуоресцентный краситель Нильский красный (Nile Red) используется для определения локализации нейтральных липидных включений в клетках. Nile Red имеет яркую флуоресценцию в неполярных средах (максимумы возбуждения/излучения 552/636 нм). Красители BODIPY также используются при окраске нейтральных липидов. Отложения солей кальция в костях, хрящах и минерализованных опухолях при взаимодействии с тетрациклином проявляют желтую флуоресценцию. Для окраски митохондрий клетки инкубируют с красителями Mitotracker, которые пассивно диффундируют через плазматическую мембрану и накапливаются в митохондриях живых клеток. Помимо митохондриальных маркеров синтезированы также красители Lysotracker, выявляющие лизосомы. Краситель DiOC6 применяется для селективного окрашивания эндоплазматической сети. С аналогичной целью используют соединения из группы ER-Tracker.

2.1. Ядерные флуоресцентные красители

Для облегчения идентификации клеток и тканей, а также для определения положения, формы клеток, их апоптозных изменений, фазы митотического цикла в исследованиях, проводимых с применением лазерной конфокальной микроскопии и обычной флуоресцентной микроскопии, используется окраска ядер клеток соответствующими флуоресцентными красителями. Окрашивание ядра клетки значительно облегчает ориентировку в изучаемых препаратах и позволяет регистрировать ряд морфологических параметров, связанных с функциональным состоянием клетки (размеры ядра и ядрышка, состояние хроматина).

При флуоресцентной микроскопии ядерную ДНК, как правило, окрашивают DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндолом). DAPI специфически связывается с ДНК и обладает синей флуоресценцией при возбуждении ультрафиолетовым светом ртутной лампы. При проведении конфокальной микроскопии флуоресценцию DAPI необходимо возбуждать ультрафиолетовым аргоновым лазером (360 нм) или мультифотонным (фемтосекундным пульсирующим) лазером. Диодный лазер (405 нм), которым обычно комплектуются бюджетные варианты конфокальных микроскопов, для этих целей непригоден. В этом случае вместо DAPI используют другие флуоресцентные красители. Их выбор в настоящее время достаточно широк (Приложение 1).

С точки зрения химической организации выделяют четыре основные группы флуоресцентных красителей, применяемых для окрашивания нуклеиновых кислот (НК):

1. Наиболее часто применяются цианиновые (полиметиновые) красители. Они имеют в качестве флуорофорной системы группы – СН=, образующие цепь сопряженных двойных связей с электронодонорной и электроноакцепторной группами на концах. Цианиновые красители образованы двумя ароматическими или азотсодержащими гетероциклическими кольцами, соединенными полиметиновой цепью двойных сопряженных углерод-углеродных связей. Выделяют симметричные (полиметиновые красители, содержащие одинаковые гетероциклы на концах полиметиновой цепи) и несимметричные. По количеству метиновых групп различают: цианиновые красители с одной метиновой группой – монометинцианины, красители с тремя метиновыми группами – триметинцианины (карбоцианины), симметричные цианиновые красители с более длинной цепочкой метиновых групп – полиметинцианины (поликарбоцианины). Также существуют мономерные и димерные цианиновые красители.

2. Фенантридины (этидия бромид, пропидия йодид ).

3. Акридины (акридиновый оранжевый, акридиновый красный, акридиновый желтый).

4. Производные индола и имидазола (Hoechst, DAPI).

В зависимости от механизма взаимодействия с молекулой НК различают три типа флуоресцентных красителей:

– интеркалирующие красители, внедряющиеся между парами азотистых оснований. При интеркаляции присутствуют нековалентные межмолекулярные взаимодействия – водородные, ван-дер-ваальсовые, электростатические, а также стекинг-взаимодействия между ДНК и интеркалятором (Вардеванян П. О. [и др.], 2010). Пример интеркалирующего красителя – пропидия йодид;

– неинтеркалирующие красители (типичный пример – DAPI), локализующиеся в малом желобке ДНК. При окраске происходит гидрофобный перенос лиганда из раствора в энергетически более выгодную малую борозду ДНК и образование нековалентных ван-дер-ваальсовых и водородных взаимодействий с ДНК (Вардеванян П. О. [и др.], 2010);

– красители со смешанным механизмом взаимодействия. К ним относится акридиновый оранжевый.

Выделяют четыре класса цианиновых красителей:

1) непроникающие через цитоплазматическую мембрану красители – группа красителей TOTO, TO-PRO и SYTOX;

2) проникающие через цитоплазматическую мембрану красители – группа красителей SYTO;

3) SYBR-красители, которые могут быть использованы для формирования биоконъюгатов;

4) красители для сверхчувствительного количественного определения нуклеиновых кислот (PicoGreen, OliGreen).

Цианиновые производные имеют ряд важных физико-химических особенностей. Красители этой группы обладают высоким сродством к НК и низкой собственной флуоресценцией. При связывании с НК их флуоресценция многократно возрастает (до 1000 раз) и характеризуется высоким квантовым выходом (до 0,9). Максимумы флуоресценции цианиновых красителей расположены на протяжении всей видимой части спектра (от синего до ближнего инфракрасного) и имеют дополнительные пики поглощения в УФ-области, что делает их совместимыми с различными типами приборов (флуоресцентные микроскопы, конфокальные микроскопы, проточные цитометры).

Непроникающие красители группы TOTO. Эта группа включает в себя цианиновые димерные красители, которые обладают высоким сродством к нуклеиновым кислотам. Установлено, что димерные красители обладают большим сродством к нуклеиновым кислотам, чем их родоначальники – мономеры (Gaugain B. [et al.], 1978). Кроме того, TOTO-красители не обладают флуоресценцией в отсутствие нуклеиновых кислот и увеличивают свою флуоресценцию при связывании с ДНК в 100 раз и более (до 1000 раз) (Rye H. S. [et al.], 1992). Красители имеют квантовый выход 0,2 – 0,6 (Deligeorgiev T. G. [et al.], 2009) (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика флуоресцентных красителей ТОТО-группы

Красители в ТОТО-группе отличаются количеством атомов углерода, связывающих цианиновые мономеры. Такая химическая модификация приводит к изменениям в спектрах поглощения и испускания, но не вызывает снижения их сродства к ДНК (Deligeorgiev T. G. [et al.], 2009). Основной механизм их взаимодействия с молекулой НК – бис-интеркаляция. Красители широко применяются для окрашивания нуклеиновых кислот в растворах, гелях и клетках. Ряд исследований подтверждает некоторую селективность ТOTO-1 к связыванию с сайтом 5’-ЦТАГ-3’, другие работы доказывают его способность к связыванию с любой последовательностью в двухцепочечной ДНК (Bunkenborg J. [et al.], 1999; Jacobsen J. P. [et al.], 1995; Kricka L. J. [et al.], 2009). Флуорохромы с дальней красной областью излучения наиболее часто применяются при тройной метке, когда необходимо выявить ДНК и два каких-либо клеточных компонента.

Непроникающие красители группы TO-PRO. Красители группы TO-PRO представляют собой мономерные соединения, спектрально аналогичные соответсвующим реагентам димерного цианинового ряда, однако обладают двумя положительными зарядами и имеют один интеркалирующий компонент в составе молекулы (табл. 2). Сродство ТО-PRO-красителей к НК несколько ниже по сравнению с ТОТО-группой. Как правило, эти вещества, так же как и димерные красители, являются непроникающими через цитоплазматическую мембрану. Спектры их излучения соответствуют видимой и ближней инфракрасной области спектра.

Таблица 2

Характеристика флуоресцентных красителей группы ТО-PRО

Из красителей группы TO-PRO наиболее часто в морфологических исследованиях применяется TO-PRO-3 – карбоцианиновый мономер с дальней красной флуоресценцией. Он является ультрачувствительным реагентом для обнаружения двухцепочечных нуклеиновых кислот. Все мономерные красители цианинового ряда имеют важные достоинства, способствующие их применению в различных областях биологии – низкий уровень фоновой флуоресценции (в несвязанном с НК состоянии) и высокий квантовый выход (обеспечивает яркость флуоресценции). Красители могут использоваться при выявлении нуклеиновых кислот на твердых подложках, при окрашивании образцов в геле и при проведении капиллярного электрофореза. TO-PRO-3 дает яркое и селективное окрашивание ядер как в фиксированных культурах клеток, так и в парафиновых срезах. Комбинированная окраска с применением проникающего прижизненного красителя SYTO-Green и непроникающего TO-PRO-3 используется для оценки жизнеспособности культивируемых клеток.

ТО-PRO-3 является высокоспецифичным красителем для ДНК, однако в незначительном количестве может проявляться его взаимодействие и с цитоплазматической РНК. При оценке возможности использования различных димерных и мономерных цианиновых красителей при окраске парафиновых срезов (Bink K. [et al.], 2001) было установлено, что TO-PRO-3 является наиболее избирательным, стабильным и специфичным красителем. Конфокальная микроскопия и 3D-реконструкция с применением TO-PRO-3 позволяют различать ядра злокачественных опухолевых клеток и отличать их от клеток доброкачественных опухолей. Анализ текстуры хроматина может способствовать совершенствованию диагностики и прогнозирования при морфологическом исследовании в онкологии (Huisman A. [et al.], 2007).

Непроникающие красители группы SYTOX. Для выявления НК в фиксированных образцах клеток и тканей, а также бактерийчасто применяется цианиновый краситель SYTOX Green, обладающий высоким сродством к нуклеиновым кислотам и легко проникающий в клетки с нарушенной цитоплазматической мембраной (табл. 3). SYTOX Green является малоселективным к какой-либо нуклеотидной последовательности. При связывании с НК он проявляет 1000-кратное усиление флуоресценции, обладает высоким квантовым выходом. Широко применяется как идентификатор фиксированных клеток в конфокальной лазерной микроскопии и проточной цитометрии. По данным нескольких исследований, является высокоизбирательным для молекул ДНК и достаточно стабильным для применения в конфокальной микроскопии (Matsuzaki T. [et al.], 1997; Suzuki T. [et al.], 1998; Кирик О. В. [и др.], 2014).

Таблица 3

Характеристика красителей группы SYTOX

Проникающие неселективные красители группы SYTO. Красители группы SYTO способны пассивно диффундировать через мембраны большинства клеток и обладают низким сродством к нуклеиновым кислотам. Эти возбудимые УФ или видимым светом красители могут быть использованы для окрашивания РНК и ДНК в живых и фиксированных эукариотических клетках, а также в грамположительных и грамотрицательных бактериях. Обладают высоким молярным коэффициентом поглощения, с экстинкцией более 50 000 см^– 1/М^– 1, чрезвычайно низкой собственной флуоресценцией (квантовый выход в несвязанном состоянии меньше 0,01). SYTO-красители могут быть использованы и для выявления нуклеиновых кислот в растворах, электрофоретических гелях и в других вариантах исследований.

Краситель SYBR Green I (максимумы возбуждения/излучения: 497/521 нм). Первоначально разработанный для идентификации НК в геле SYBR Green I в настоящее время используется во многих исследованиях, например при определении ДНК в растворе (Vitzthum F. [et al.], 1999), в капиллярном электрофорезе (Skeidsvoll J. [et al.], 1995), в проточной цитометрии, при проведении ПЦР в реальном времени (Konnai S. [et al.], 2003) и окрашивании вирусных частиц (Rinta-Kanto J. M. [et al.], 2004). SYBR Green I легко проникает через ЦПМ фиксированных и живых эукариотических клеток (Briggs C. [et al.], 2005). Связывание SYBR Green I с двухцепочечной ДНК может происходить по двум механизмам:

интеркаляции и внешнего связывания (Zipper H. [et al.], 2004).

Краситель SYBR Green I – исключительно чувствительный проникающий флуоресцентный индикатор двухцепочечной ДНК. По сравнению с этидий бромидом SYBR Green I имеет большую чувствительность и большую специфичность в отношении двухцепочечной ДНК, в то время как этидий бромид проявляет достаточно высокое сродство в отношении одноцепочечной ДНК. Максимум флуоресценции в комплексе с ДНК составляет 521 нм, максимум поглощения – 497 нм (второй максимум около 254 нм). Хорошо возбуждается стандартным 488-нм лазером. Квантовый выход флуоресценции – около 0,8, что превышает квантовый выход для комплекса этидий бромид-ДНК более чемв5раз.Кромеглавного, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения – при 290 нм и 380 нм. Такие спектральные характеристики позволяют детектировать краситель различными приборами – от ультафиолетовых трансиллюминаторов до лазеров с длиной волны около 500 нм (синий свет).

При использовании SYBR Green I для идентификации НК анализ препаратов с применением лазерного конфокального микроскопа необходимо проводить как можно быстрее, так как флуоресценция SYBR Green I исчезает достаточно быстро. Установлено, что нестабильность красителя возможно преодолеть добавлением стабилизирующих компонентов в среды для заключения препаратов – PPDA (парафенилендиамин) и DABCO (диазобициклооктан) (Suzuki T.

[et al.], 1997).

Красители для сверхчувствительного количественного определения нуклеиновых кислот. При необходимости определения сверхмалых концентраций ДНК применяют флуоресцентный краситель PicoGreen (табл. 4). PicoGreen – сверхчувствительный флуоресцентный краситель для количественного определения двухцепочечной ДНК. Наиболее часто при оценке количества нуклеиновых кислот в растворе без подкрашивания определяют УФ-поглощение при 260 нм. Однако при таком методе исследования следует учитывать вклад оцДНК, РНК, белков и фенолов в общую оптическую плотность исследуемого раствора. Также возможно применение красителя Hoechst 33258 для селективного количественного определения дцДНК в концентрации более 10 нг/мл. YO-PRO-1 и YO-YO-1 позволяют обнаруживать до 0,5 нг/мл ДНК в растворе. Применение PicoGreen, за счет высокой избирательности по отношению к двухцепочечным участкам ДНК, позволяет исключить влияние примесей и дает возможность выявлять до 25 пг/мл дцДНК. Кроме того, несвязанный PicoGreen обладает минимальной собственной флуоресценцией в растворе (Ahn S. J. [et al.], 1996; Blotta I. [et al.], 2005). OliGreen используется для количественного определения олигонуклеотидов и одноцепочечной ДНК в растворе (см. табл. 4).

Таблица 4

Характеристика красителей, используемых для определения малых концентраций нуклеиновых кислот

Фенантридиновые красители – пропидия йодид (PI) и этидия бромид (EB) – представляют собой классические непроникающие интеркаляторы НК (табл. 5). Несмотря на то что молярный коэффициент поглощения (экстинкции) PI является относительно низким, краситель имеет достаточно большой сдвиг Стокса, что дает возможность одновременного обнаружения ядерной ДНК и антител, связанных с флуоресцентной меткой. При связывании красителя с нуклеиновыми кислотами его флуоресценция возрастает в 20 – 30 раз. Поскольку область связывания PI с молекулой НК лежит в области нуклеотидной пары гуанин и цитозин (Suzuki T. [et al.], 1997), краситель также способен связываться с РНК. Применение РНК-азы требуется при исследовании образцов, фиксированных в параформальдегиде, формальдегиде или глутаральдегиде. При исследовании объектов, фиксированных в смеси метанол/уксусная кислота, применение РНК-азы, как правило, не требуется.

Пропидия йодид в сочетании с Hoechst 33342 применяется для дифференцировки живых, некротизированных клеток, раннего и позднего апоптоза (Darzynkiewicz Z. [et al.], 1992). PI применяется для флуоресцентной микроскопии, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, проточной цитометрии и флуорометрии.

Таблица 5

Характеристика красителей из группы фенантридинов

EB является НК, взаимодействует с молекулами РНК и ДНК. По данным V. S. Sibirtsev [et al.] (2005), EB имеет повышенное сродство к нуклеотидной паре ГЦ, в других работах описано сродство EB к регионам, богатым AT-парами оснований (Kricka L. J. [et al.], 2009). Некоторые авторы отмечают отсутствие нуклеотидной селективности в связывании красителя (Chen W. [et al.], 2000). Краситель считается специфичным к вторичной структуре ДНК и к более высоким порядкам организации молекулы (Сибирцев В. С., 2007). При интеркаляции образуются водородные связи между аминогруппами красителя и атомами кислорода фосфатных групп обеих полинуклеотидных цепей. Предполагается, что вследствие электростатического взаимодействия между отрицательно заряженными атомами кислорода в фосфатных группах ДНК и положительно заряженным атомом азота (катионная форма EB) лиганда происходит раздвигание оснований и встраивание (перпендикулярное оси спирали ДНК) молекулы бромистого этидия между парами оснований. Кроме того, часть молекул EB может связываться с ДНК с помощью внешнего связывания (с фосфатной группой), которое носит электростатический характер (Garbett N. C. [et al.], 2004).

Из этой группы наибольшее значение имеет акридиновый оранжевый (максимумы возбуждения/излучения: 500/526 для ДНК и 460/650 для РНК).

Этот достаточно давно синтезированный катионный краситель взаимодействует с двухцепочечной ДНК (дцДНК), одноцепочечной ДНК (оцДНК) и РНК путем внедрения и электростатических взаимодействий. Краситель проявляет зеленую флуоресценцию с максимумом излучения при 525 нм при связывании с дцДНК. При взаимодействии с оцДНК или РНК его излучение смещается в область 650 нм (красная флуоресценция). В гетерохроматине, однако, большая часть ДНК упакована таким образом, что интеркаляция акридинового оранжевого невозможна (Delic J. [et al.], 1991). Есть данные о наличии избирательной окраски прицентромерного гетерохроматина с помощью акридинового оранжевого на препаратах различных клеток (Трофимова И. Л. [и др.], 2010).

Акридиновый оранжевый применяется в исследованиях клеточного цикла, структуры НК, апоптоза (Сясина Т. В. [и др.], 2011), злокачественного роста клеток in vivo и in vitro (Беляева Т. Н. [и др.], 2009).