Текст книги "Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии"

1.3. Принципы конфокальной микроскопии

Конфокальная микроскопия является разновидностью флуоресцентной микроскопии с улучшенным разрешением вдоль оптической оси объектива, которое достигается за счет использования принципа конфокальной фильтрации флуоресценции. Концепция конфокальной микроскопии была предложена Marvin Minsky в 50-е гг. XX в. для исследования ткани головного мозга без предварительного окрашивания. В разработанном им микроскопе свет последовательно фокусировался на разных точках образца. С целью устранения шумового сигнала от участков, расположенных вне плоскости фокуса, использовалась диафрагма. Она находилась в плоскости, сопряженной с плоскостью фокуса объектива, таким образом, что при проецировании диафрагмы на объект ее изображение точно совпало с фокусом освещающего объект света. При таком устройстве системы свет из областей вне фокуса задерживался диафрагмой и на детектор попадал только сигнал из фокуса объектива. Изменяя диаметр диафрагмы, можно было варьировать толщину оптического слоя вблизи фокуса объектива, от которого измерялся сигнал. Сканирование плоскости образца по точкам позволяло получить полное изображение. Исходя из этого принципа, возникло и название метода – «конфокальный» – основанный на сопряжении фокусов. Однако при таком устройстве микроскопа на изображении было слишком много помех из-за использования слабых источников освещения. Вероятно поэтому изобретение Minsky осталось почти без внимания. Интерес к нему вернулся только после изобретения лазера. Более подробно исторические аспекты создания конфокального микроскопа приведены в обзоре Н. Н. Лукашевой [и др.] (2008).

В современном конфокальном микроскопе источником возбуждающего света является лазер. Преимуществом лазеров по сравнению с ламповыми источниками света заключается в монохроматичности генерируемого света и малой расходимости светового пучка. Монохроматичность возбуждающего флуоресценцию света дает возможность расширить спектральный диапазон регистрируемой флуоресценции и улучшить подавление светорассеяния на длине волны возбуждения. Малая расходимость пучка света способствует более эффективной работе оптической системы микроскопа, уменьшает число бликов, связанных с отклонением света от расчетного оптического пути, улучшает точность фокусировки пучка света и уменьшает объем, в который можно сфокусировать свет на образце. На рис. 2 показана принципиальная схема современного лазерного конфокального микроскопа.

Лазер излучает свет, формируя узкий световой пучок. Затем свет проходит через систему линз (расширитель пучка) и попадает на светоделитель, который отражает возбуждающий свет, направляя его на систему зеркал (на схеме не показана), позволяющих изменять направление луча во взаимно перпендикулярных плоскостях. Светоделитель обеспечивает высокоэффективное отражение света на длине волны генерации лазера и почти стопроцентное пропускание света в остальном спектральном диапазоне. Далее свет через объектив фокусируется в определенной точке образца, возбуждая флуоресценцию. При этом лазерный луч может возбуждать флуоресценцию во всех слоях образца, через которые он проходит, а интенсивность флуоресценции будет возрастать по мере приближения к точке фокусировки. Флуоресцентное излучение собирается объективом и возвращается на светоделитель, проходит сквозь него, попадая на эмиссионные фильтры. Отраженное излучение лазера через светоделитель не проходит. При необходимости многоканальной регистрации (например, при использовании нескольких флуорохромов) возможно дополнительное деление флуоресцентного сигнала на составляющие с помощью дополнительных светоделителей и фильтров эмиссии. Собранный из определенной точки образца свет фокусируется в плоскости конфокальной диафрагмы (pinhole), попадает на детектор (ФЭУ) и оцифровывается. При этом свет, исходящий из областей, находящихся выше или ниже плоскости фокуса, отсекается диафрагмой и на детектор не попадает. После регистрации флуоресцентного сигнала от первой точки фокусировки при помощи системы зеркал луч возбуждающего света перемещается на следующую точку в образце. Весь процесс повторяется. Так, точка за точкой, формируется изображение в горизонтальной (или вертикальной) плоскости.

Рис. 2. Принципиальная схема простейшего конфокального микроскопа

Диаметр конфокальной диафрагмы можно варьировать, тем самым изменяя толщину оптического слоя, от которого регистрируется сигнал. Однако следует понимать, что уменьшение диаметра конфокальной диафрагмы (а, следовательно, и уменьшение толщины оптического слоя) приводит к снижению интенсивности света, который диафрагма пропускает к детектору и, соответственно ухудшению детекции объектов с неяркой флуоресценцией. В связи с этим приходится искать компромисс между разрешением по оси z, зависящим от размера конфокальной диафрагмы, и возможностью регистрации четких флуоресцирующих объектов, что зависит как от размера диафрагмы, так и от степени усиления регистрируемого сигнала.

Помимо диаметра конфокальной диафрагмы толщина оптического слоя зависит от длины волны возбуждающего света, числовой апертуры объектива, показателя преломления иммерсионной среды. В частности, чем больше числовая апертура объектива, тем меньше толщина оптического слоя.

Не менее важным параметром является разрешающая способность микроскопа. Вследствие дифракции света увеличенное изображение объекта может оказаться размытым (две или более точек объекта воспринимаются глазом как одна). Еще в XIX в. Джон Рэлей сформулировал принцип, в соответствии с которым предельное разрешение микроскопа не может быть больше половины длины волны освещающего объект света. Предел разрешения объектива микроскопа (l_min) был уточнен немецким физиком Г. Гельмгольцем:

l _min = 0,61λ/n sin α,

где λ —длина волны света; n – показатель преломления иммерсионной среды; α —апертурный угол (максимальный угол, который образуют лучи, попадающие в объектив, с оптической осью системы).

Выражение NА = n sin α называют числовой апертурой.

Согласно формуле Гельмгольца, разрешение объектива микроскопа зависит от длины волны облучающего света и пропорционально числовой апертуре. Повысить разрешение также можно с помощью увеличения коэффициента преломления иммерсионной среды. Поскольку невозможно неограниченно уменьшать длину волны облучающего света и увеличивать числовую апертуру объектива, существует разрешающий предел – около 200 нм. Однако есть возможность улучшить качество изображения за счет увеличения контраста. Если установить диаметр конфокальной диафрагмы равным диаметру центрального пятна дифракционной картины точечного объекта (диску Эйри), то можно избежать попадания в объектив света от дифракционных колец. Применяя такую технологию, можно повысить контрастность примерно в 1,4 раза по сравнению с обычными микроскопами, а это приведет к заметному улучшению качества изображения. Аксиальное разрешение конфокального микроскопа также зависит от диаметра диафрагмы. Чем меньше диаметр диафрагмы, тем меньше толщина слоя, с которого снимается сигнал, следовательно, лучше аксиальное разрешение (свет из соседних точек, находящихся вне фокальной плоскости, задерживается диафрагмой). Величина конфокальной диафрагмы, равная размеру диска Эйри, рассчитывается программой, управляющей конфокальным микроскопом, для каждого сочетания объектива и используемых фильтров (1 Airyunit). Она легко может быть задана без дополнительных вычислений.

С более подробным описанием принципиальной схемы конфокального микроскопа и порядком работы его модулей можно ознакомиться в работах Э. И. Лежнева [и др.] (2001), Г. И. Штейна (2007); R. Y. Tsien [et al.] (2006); B. J. Nair [et al.] (2012).

Как указывалось выше, в конфокальной лазерной микроскопии изображение всего образца получают путем сканирования. Скорость поточечного сканирования ограничивает скорость работы микроскопа в целом и делает невозможным наблюдение за быстротекущими процессами. Чтобы избежать этого ограничения, на практике используют не одиночную диафрагму, а массив диафрагм и детекторов. Такие массивы размещают на диске Нипкова. Это устройство, изобретенное Паулем Нипковым в 1884 г., представляет собой вращающийся диск из непрозрачного материала с нанесенными на нем отверстиями одинакового диаметра, расположенными по спирали в один оборот, начиная от наружного края диска. Наблюдая объект через сектор быстро вращающегося диска Нипкова, можно заметить, что происходит его построчное сканирование. При более высокой скорости вращения объект можно увидеть целиком (Феофанов А. В., 2007).

Современный аналог диска Нипкова содержит 20 тыс. отверстий, на которых лазерный луч фокусируется при помощи дополнительного диска с микролинзами. При вращении такого двойного диска достигается считывание до 360 кадров в секунду. Однако стоит отметить, что диаметры отверстий и расстояния между ними на диске фиксированы и подбираются для конкретного объектива, следовательно, смена последнего требует замены диска.

Сегодня на смену вращающимся дискам Нипкова приходят их твердотельные неподвижные аналоги – цифровые микрозеркальные устройства (digital micromirror device, DMD). Эти устройства представляют собой массивы микрозеркал, которые соответствуют пикселям в проецируемом изображении и, отклоняясь в ту или другую сторону, управляют прохождением света. В конфокальной микроскопии они играют роль массива отверстий, фильтрующих возвращаемый образцом сигнал, с изменяемым диаметром и схемой расстановки.

Однако конфокальные микроскопы имеют и существенные недостатки. Так, возбуждение значительной части существующих флуорохромов осуществляется лазерным излучением ультрафиолетового или коротковолнового видимого диапазона, что разрушительно для живых клеток. Эта проблема была преодолена с введением в практику мультифотонных микроскопов, в которых в качестве подсветки используется излучение инфракрасного диапазона.

1.4. Мультифотонная микроскопия

Мультифотонная микроскопия – вариант лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, основанный на принципе Гёпперт-Майер, согласно которому с увеличением плотности мощности света возрастает вероятность поглощения атомом флуорохрома одновременно двух и более фотонов, после чего атом излучает фотон большей энергии, чем при однофотонном поглощении. Несмотря на то что это явление было описано еще в 1931 г., первый мультифотонный микроскоп был применен для исследования биологических объектов Winfried Denk лишь в 1990 г. Это было связано с невозможностью до появления лазерной техники достичь на практике излучения большой плотности. В современных мультифотонных микроскопах высокая плотность мощности светового пучка обеспечивается за счет фокусировки лазерного излучения, а также благодаря уменьшению длительности лазерного импульса. Для этой цели применяются фемтосекундные лазеры с длительностью импульса около 10^-13 с (100 фемтосекунд) и частотой порядка 100 МГц. Использование такой системы (при невысокой ее мощности) позволяет получить сигнал с малым уровнем фоновых шумов, достичь большей глубины проникновения в ткани при малой степени повреждения клеток. Кроме этого за счет отсутствия возбуждения и выцветания флуорохромов вне фокального объема отсутствует необходимость установки конфокальной диафрагмы, поэтому лазерный сканирующий микроскоп с мультифотонным возбуждением не является типичным конфокальным микроскопом. В качестве примера мультифотонного микроскопа можно привести комплекс лазерного сканирующего конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM-710 с фемтосекундным инфракрасным лазером с перестраиваемым диапазоном (800 – 1500 нм). Использование этой системы позволяет получить глубину проникновения в ткани порядка 500 мкм и осуществлять непрерывный мониторинг живых объектов в течение нескольких часов.

Одним из вариантов мультифотонной микроскопии является микроскопия с использованием регистрации второй гармоники (Second-harmonic imaging microscopy – SHIM). Метод генерации второй гармоники основан на нелинейном оптическом явлении, суть которого заключается в преобразовании средой двух фотонов с частотой w в один фотон с частотой 2w. Это означает, что помимо света на частоте лазера из среды выходит свет на удвоенной частоте – вторая гармоника. Генерация второй гармоники обусловлена рассеянием света в среде и возможна при действии поляризованного лазерного излучения ближнего инфракрасного диапазона. Подробное изложение физико-химических основ этого процесса приведено в учебнике под редакцией Б. И. Манцызова (2009). Отметим, что не все биологические образцы могут генерировать вторую гармонику. Классическим объектом для этого вида микроскопии является роговица глаза, которая преимущественно состоит из плотно упакованных коллагеновых волокон – источника генерации второй гармоники.

1.5. Конфокальная микроскопия в применении к исследованию динамических процессов и межмолекулярных взаимодействий

Данная техника применяется для исследования подвижности биоорганических молекул, например для измерения коэффициента латеральной диффузии некоторого белка или для изучения полимеризации белков. Основной принцип метода заключается в том, что белок интереса метят флуоресцентной меткой, с помощью ослабленного аттенюаторами возбуждающего излучения регистрируют фоновую флуоресценцию; после этого на короткий промежуток времени (несколько миллисекунд) увеличивают интенсивность облучения, что приводит к выжиганию флуорохрома; затем снижают интенсивность до исходной и регистрируют флуоресценцию с отбеленного участка (Соболев А. С., 2000). Если молекулы с флуорохромом из соседней необлученной зоны (например, посредством диффузии) перемещаются в облученную область, то по времени нарастания флуоресценции можно судить об их подвижности. Несколько лет назад была разработана модификация этого метода – обратный FRAP или iFRAP, который с успехом применяется для изучения подвижности молекул в малом объеме или кинетики диссоциации молекул. В этой модификации фотоотбеливанию подвергаются флуоресцентно меченые молекулы во всей клетке за исключением малого объема, затем регистрируется изменение уровня флуоресценции в этом объеме (Dailey M. E. [еt al.], 2006).

Техника FLIP используется для выявления взаимодействий между молекулами из разных компартментов клетки или для изучения подвижности молекулы внутри компартмента. Например, для наблюдения передвижения определенного белка из цитоплазмы в ядро. Эксперименты в технике FLIP отличаются от FRAP и iFRAP тем, что выжигание флуоресценции в одной и той же области образца производится несколько раз с целью предотвращения восстановления флуоресценции в ней. При повторном отбеливании определенной области возникает потеря флуоресценции в пограничной области. По потере флуоресценции в области пограничной с облучаемой можно судить о передвижении фракции меченных флуоресцентным красителем белков и, наоборот, по остаточной флуоресценции можно определить долю неподвижных молекул. FLIP часто используется в комбинации с FRAP, чтобы получить обобщенную информацию об активном и пассивном перемещении меченых белков.

С помощью метода FLAP можно в реальном времени следить за перемещением флуоресцентно меченой молекулы в пространстве. Техника FLAP была разработана Graham Dunn в 2002 г. и состояла в том, что к молекулам интереса пришивали две различные флуоресцентные метки, одну из которых отбеливали, а с помощью второй следили за перемещением молекулы. Для реализации этого метода оба красителя должны визуализироваться одновременно и независимо, тогда FLAP сигнал получают путем вычитания отбеленного сигнала из неотбеленного для каждого пикселя.

Фёрстеровская резонансная передача энергии, или иначе диполь-дипольный перенос энергии, – это механизм переноса энергии между двумя молекулами (от донора к акцептору), который происходит без промежуточного испускания фотонов и является результатом диполь-дипольного взаимодействия между донором, находящимся в возбужденном состоянии, и акцептором. Характерная черта данного процесса – тушение флуоресценции донора и возникновение более длинноволновой флуоресценции у акцептора, которая детектируется конфокальным микроскопом. При этом перенос возбуждения сопровождается уменьшением времени жизни и квантового выхода флуоресценции донора, для которого акцептор выступает в роли тушителя. Скорость переноса убывает как r ^–6, где r – расстояние между донором и акцептором, что используется для измерения расстояния между двумя молекулами или между двумя метками в одной молекуле. Для характеристики этого явления вводится понятие фестеровского радиуса (R_F) – это эффективное расстояние, на котором скорость перехода составляет 50 % от максимума (для большинства систем его величина составляет 20 – 50 Å). Если расстояние между донором и акцептором превышает 10 нм, то диполь-дипольный перенос энергии не возможен. Помимо расстояния скорость переноса зависит от степени перекрывания спектров испускания донора и поглощения акцептора, от взаимной ориентации диполей донора и акцептора и от времени жизни возбужденного состояния донора в отсутствие акцептора. Константа скорости переноса энергии k_et определяется выражением:

где τ_d – время жизни возбужденного состояния донора в отсутствие акцептора.

Для реализации технологии FRET необходимо, чтобы:

1) донорный зонд обладал достаточным временем жизни для осуществления переноса энергии;

2) молекулы донора и акцептора располагались на расстоянии 1 – 10 нм друг от друга;

3) спектр поглощения флуорохрома акцептора накладывался на спектр испускания флуоресценции флуорохрома донора (примерно на 30 %);

4) для переноса энергии ориентации диполя донора и акцептора были примерно параллельны друг другу;

5) пары флуорохромов соответствовали имеющимся в конструкции микроскопа лазерам.

Наиболее часто используемые пары донор – акцептор приведены в обзоре, расположенном на сайте http://www.mdpi.com/ 1420-3049/17/4/4047р. 4088.

Существуют несколько методов исследований FRET: фотоотбеливание акцептора/донора; метод спектральной конфокальной микроскопии в применении к FRET; микроскопия для исследования времени жизни флуоресценции (fluorescence lifetime imaging microscopy – FLIM) и метод поляризации флуоресценции (Ishikawa-Ankerhold Н. С. [et al.], 2012). В зависимости от задачи данные модификации метода FRET позволяют следить за конформационными изменениями в белках, изучать кинетику ферментативных реакций, исследовать белок-белковые и другие взаимодействия. Например, по изменению FRET-сигнала между Gá иGâã субъединицами G-белка, слитыми с флуоресцирующими белками CFP и YFP, можно охарактеризовать динамические характеристики диссоциации G-белка в живых клетках; две субъединицы никотиновых ацетилхолиновых рецепторов á4 и â2, слитые с YFP и CFP, послужили основой для разработки клеточных систем, на основе которых с применением спектральной конфокальной микроскопии показана возможность измерять уровень á4â2-рецепторов и изучать процессы их сборки-диссоциации под воздействием различных стимулов. С помощью методики FLIM смогли в системе реального времени отслеживать уровень фосфорилированной формы эпидермального фактора роста (ЭФР), для чего к ЭФР пришили GFP, а к антителам, реагирующим с фосфоЭФР, – Cy3 (Grigsby C. L. [et al.], 2012; Zeug A. [et al.], 2012).

Литература

Голышевская В. И., Егорова О. В., Севастьянова Э. В., Шульгина М. В. Люминесцентная микроскопия: учебное пособие для проведения курсов обучения: «Культуральные методы диагностики туберкулеза», «Выявление туберкулеза методом микроскопии». – М.; Тверь: Триада, 2008. – 36 с.

Лукашева Н. Н., Ткаченко С. Б., Потекаев Н. Н., Кузьмина Т. С., Василевская Е. А. Прижизненная отражательная конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: история создания, принцип работы, возможности применения в дерматологии // Клиническая дерматология и венерология. – 2008. – № 5. – С. 10 – 15.

Манцызов Б. И. Когерентная и нелинейная оптика. – М.: ФИЗМАТЛИТ, 2009. – 208 с.

Олейников В. А. Полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы (квантовые точки) в белковых биочипах // Биоорг. химия. – 2011. – 37 (2). – С. 171 – 189.

Сайфитдинова А. Ф. Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов: учебно-методическое пособие. – СПб.: СОЛО, 2008. – 72 с.

Соболев А. С. Как измеряют подвижность макромолекул в живых клетках // Соросовский образовательный журнал. – 2000. – Т. 6. – № 4. – С. 2 – 6.

Феофанов А. В. Спектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях // Успехи биологической химии. – 2007. – Т. 47. – С. 371 – 410.

Фейнман Р. Фейнмановские лекции по физике :в9 т. – 6-еизд. сущ. испр. – М.: УРСС: Издательский дом «ЛИБРОКОМ», 2011. – Т. 3: Излучение. Волны. Кванты. – 264 с.

Штейн Г. И. Руководство по конфокальной микроскопии. – СПб.: ИНЦ РАН, 2007. – 77 с.

Dailey M. E., Manders E., Soll D., Terasaki M. Chapter 19 Confocal Microscopy of Live Cells In «Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd Ed.». – New York: Springer, 2006. – Р. 381 – 404.

Grigsby C. L., Ho Y. P., LeongK. W. Understanding nonviral nucleic acid delivery with quantum dot-FRET nanosensors // Nanomedicine (Lond). – 2012. – Vol. 7 (4). – P. 565 – 577.

Ishikawa-Ankerhold H. C., Ankerhold R., Drummen G. P. C. Advanced Fluorescence Microscopy Techniques – FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM // Molecules. – 2012. – Vol. 17. – Р. 4047 – 4132.

Nair B. J., Sivakumar T. T., Joseph A. P., Varun B. R., Mony V. Confocal microscopy // Health Sciences. – 2012. – 1(3): JS004A. – Р. 1 – 6.

Tsien R. Y., Ernst L., Waggoner A. Fluorophores for Confocal Microscopy: Photophysics and Photochemistry In «Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd Ed.». – New York: Springer, 2006. – Р. 338 – 352.

Zeug A., Woehler A., Neher E., Ponimaskin E. G. Quantitative intensity-based FRET approaches – a comparative snapshot // Biophys. J. – 2012. – Vol. 103 (9). – Р. 1821 – 1827.