Текст книги "Вирулицидная эффективность дезинфицирующих средств. Сравнительный анализ"

Николай Николаевич Носик, Дмитрий Николаевич Носик, Алексей Иванович Чижов
Вирулицидная эффективность дезинфицирующих средств. Сравнительный анализ

© Носик Н. Н., Носик Д. Н., Чижов А. И., 2019

* * *

SUMMARY

Comparative study on the virucidal effectivity of the most used germisides

Nosik N. N., Nosik D. N., Chizhov A. I.

“The D. I. Ivanovsky Institute of Virology N. F. Gamaleya NRCEM”, Ministry of Health, Moscow. Russia

Virucidal effectivity of the most used chemical disinfectants (quaternary ammonium compounds, amines, guanidines, aldehydes, ethanol and propanol) was studied. Also their inhibitory activity on enveloped (HIV, HCV, HSV and Influenza Virus) and nonenveloped (poliovirus and adenovirus) were analysed. It was proved that quaternary ammonium compounds, as well as amines, itself are not very effective against nonenveloped viruses. However their combination with guanidines or aldehydes increase the inhibitory effect on viruses. In general the combined administration of two or better three germisides were effective against viruses.

The disinfectants with ethanol compound are more effective than disinfectants with propanol compound.

The sensitivity of viruses to chemical disinfectants and active concentrations of the studied germisides are given in tables.

Keywords: viruses, chemical germisides, virucidal activity, disinfection

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

• ВГВ – вирус гепатита В

• ВГС – вирус гепатита С

• ВИЧ – вирус иммунодефицита человека

• ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения (WHO, OMS)

• ВПГ – вирус простого герпеса

• ВПЧ – вирус папилломы человека

• ДВ – действующее вещество

• ДВУ – дезинфекция высокого уровня

• ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

• ДС – дезинфицирующее средство

• ИМН – изделия медицинского назначения

• ИППП – инфекция, передающаяся половым путем

• ИФА – иммуноферментный анализ

• КПАВ – катионные поверхностно-активные вещества

• НК – нуклеиновая кислота

• НМ – нанометр

• ПАВ – поверхностно-активные вещества

• ПДК – предельно допустимые концентрации

• ПГМГ – полигексаметиленгуанидин хлорид

• ПЦР – полимеразная цепная реакция

• РНК – рибонуклеиновая кислота

• СМИ – средства массовой информации

• СПИД – синдром приобретенного иммунодефицита

• ТЦИД₅₀ – 50 %-я тканевая цитопатическая инфекционная доза

• УФ – ультрафиолет

• ЧАС – четвертичные аммониевые соединения

• EPA (US Environmental Protection Agency) – Агентство по защите окружающей среды США

1. Введение

Особое значение для дезинфицирующих средств имеет их способность инактивировать вирусы. Это обусловлено тем, что более 80 % всех инфекционных болезней вызываются вирусами, а средств борьбы с ними явно недостаточно (к большинству из них нет вакцин, нет и этиотропных препаратов). Поэтому дезинфицирующее средство (ДС) должно обладать способностью инактивировать вирус вне клетки. Способность инактивировать вирус вне клетки определяется термином «вирулицидность».

На степень инактивации инфекционности вирусов влияют различные причины, среди которых основной является природная устойчивость к воздействию факторов внешней среды и химических веществ.

Устойчивость вирусов к ДС определяется их структурой и химическим составом. Вирусы, не имеющие белково-липидной оболочки, более устойчивы к ДС, чем имеющие её. Большое разнообразие вирусов, многочисленность форм их архитектоники обуславливают большие вариации в устойчивости вирусов к различным воздействиям [1].

В целях подтверждения вирулицидной активности средств дезинфекции используют тест-вирусы (вирус полиомиелита, аденовирус), обладающие высокой устойчивостью к химическим веществам. Необходимой степенью инактивации принято считать снижение титра инфекционности вируса не менее чем на 4,0 lg ТЦИД₅₀. В этом случае средство считается вирулицидным и может быть использовано для дезинфекции при любой вирусной инфекции, включая особо опасные, играющие роль в инфекционной патологии человека [2]. Средство, не обладающее достаточной эффективностью в отношении вируса полиомиелита и аденовируса, но активное в отношении других менее устойчивых вирусов (вируса гриппа, гепатита С, ВИЧ, герпеса) считается ограниченно вирулицидным и может применяться только в отношении инфекционных заболеваний, вызванных конкретным возбудителем.

Несмотря на то, что количество групп действующих веществ, применяемых для создания дезинфицирующего средства, относительно ограничено, зарегистрировано большое число готовых форм с заявленной вирулицидной активностью.

Однако в инструкциях по применению дезинфицирующих средств содержатся противоречивые сведения как об их вирулицидности, так и о диапазонах режимов применения.

В связи с этим было проведено настоящее исследование, целью которого явилось изучение сравнительной вирулицидной эффективности дезинфицирующих средств на основе катионных поверхностно-активных соединений (ЧАС, аминов, гуанидинов), комбинированных препаратов (включая альдегиды), веществ, содержащих фенольный компонент, а также спиртов в отношении безоболочечных (полиовирус, аденовирус) и оболочечных (вирус иммунодефицита человека, вирус гепатита С, вирус простого герпеса, вирусы гриппа А) вирусов.

2. Материалы и методы

Исследования проводили в соответствии с МУ 3.5.2431–08 «Методические указания по изучению и оценке вирулицидной активности дезинфицирующих средств» [3] и руководством Р 4.2.2643–10 «Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности» [4] в рамках испытаний дезинфекционных средств перед дезинфектологической экспертизой в целях государственной регистрации (Аттестат аккредитации № RA.RU.21ВИ01 от 23.10.2015 г.), а также с учетом европейских рекомендаций [5].

В настоящей работе представлены результаты испытания вирулицидной эффективности наиболее распространенных действующих веществ.

Тест-вирусы, использованные в испытаниях: вирус полиомиелита, аденовирус, ВИЧ, вирус гепатита С, вирус гриппа А (H1N1).

Вирус полиомиелита, тип 1, вакцинный штамм Сэбина получен из ГУ «НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН». Титр вируса 6,5 lg ТЦИД₅₀.

Аденовирус, тип 5, получен из Государственной коллекции вирусов «Института вирусологии им. Д. И. Ивановского» ФГБУ «НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» Минздрава России. Титр вируса 6,0 lg ТЦИД₅₀.

Вирус иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1). В качестве источника вируса иммунодефицита человека использовали штамм ВИЧ-1 899A, из коллекции штаммов вирусов иммунодефицита человека Государственной коллекции вирусов «Института вирусологии им. Д. И. Ивановского» ФГБУ «НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» Минздрава России. Титр вируса 6,5 lg ТЦИД₅₀.

Вирус гепатита С (ВГС). В качестве вируссодержащего материала использовали культуральную жидкость, собранную из инфицированных ВГС культур клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) на стадии развития цитопатических явлений. Титр вируса 7,5 lg ТЦИД₅₀.

Вирус гриппа А. В качестве источника вируса использовали штамм вируса гриппа человека А/H1N1 (Титр вируса 6,5 lg ТЦИД₅₀, культура клеток почек собаки [MDCK]), из Государственной коллекции вирусов «Института вирусологии им. Д. И. Ивановского» ФГБУ «НИЦЭМ им Н. Ф. Гамалеи» Минздрава России.

Вирус герпеса простого (ВПГ). В качестве источника вируса простого герпеса тип 1, штамм Л2 (ВПГ-1), из Государственной коллекции вирусов «Института вирусологии им. Д. И. Ивановского» ФГБУ «НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» Минздрава России. Титр вируса 4,5 lg ТЦИД₅₀.

Клетки. В работе с вирусами использовали следующие перевиваемые культуры клеток: для вируса полиомиелита – клетки почки зеленых мартышек Vero, аденовируса – линию клеток человека HeLa, для ВИЧ – лимфобластоидные клетки человека МТ-4, для вируса гепатита С – культуру клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), для вируса гриппа А человека – клетки почки собаки (MDCK). Для работы с вирусом простого герпеса использовали культуру клеток Vero и культуру диплоидных фибробластов человека М-19.

Структура исследования. Вирулицидный эффект испытуемых средств исследовали в суспензионном тесте (тест in vitro) и на различных тест-объектах, являющихся реальными объектами приложения средства или суррогатными аналогами. Основными способами обработки контаминированных вирусом тест-объектов были протирание, орошение и погружение. Суспензионный тест является исторически исходным тестом выявления вирулицидных свойств дезинфектанта и заключается в смешивании вируса с испытуемым средством в соотношении 1:9 (по отечественным нормативам) или 1:8 (в зарубежной практике) [3, 5].

Чувствительные культуры клеток инфицировали вирусом, подвергшимся воздействию ДС; инкубировали их при оптимальной температуре и определяли наличие или отсутствие инфекционного вируса. Контролями служили пробы вируса, собранные с контаминированных вирусом тест-объектов, не подвергшихся действию дезинфицирующих средств. Репродукцию вируса в клетках оценивали по вирусиндуцированному цитопатическому эффекту микроскопическим или МТТ-методом.

Критерии учета результатов испытаний: эффект вирулицидного действия ДС оценивали по степени ингибирования инфекционного вируса, измеряемого в lg ТЦИД₅₀ (50 %-я тканевая цитопатическая инфекционная доза). Критерием эффективности является степень ингибирования репродукции вируса, которая должна быть не менее 4,0 lg ТЦИД₅₀.

Расчет концентрации ДВ в растворе проводили по формуле:

Х = (С × М)/100,

где Х – искомая концентрация ДВ в растворе, %; С – концентрация рабочего раствора по препарату, рекомендованная в инструкции, %; М – количество ДВ в средстве, указанное в Инструкции по применению, % [6].

3. Результаты исследования

3.1. Катионные поверхностно-активные вещества

Катионные поверхностно-активные вещества (КПАВ) представляют большую группу веществ, для которых общим является наличие крупного положительно заряженного катионного компонента, обладающего гидрофобностью, и мелкого отрицательно заряженного анионного в виде хлорида, бромида или сульфата, обладающего гидрофильностью. Общим свойством для этой группы веществ является изменение поверхностного натяжения воды и образование мицелл при определенной концентрации.

Среди этой группы антимикробную активность проявляют соли четвертичных аммониевых соединений (ЧАС), производные гуанидина, третичные амины [7, 8].

Дезинфицирующие средства часто встречаются в практике в виде комбинации двух или трех представителей КПАВ.

Вирулицидные свойства дезинфицирующих средств на основе смесей ЧАС, третичного амина или гуанидина в суспензионном тесте представлены в табл. 1. При суммарной концентрации действующих веществ в широком диапазоне от 0,12 до 1,0 % в суспензионном тесте при времени воздействия 60 минут степень ингибирования вируса полиомиелита составляла от 2,0 до 3,0 lg ТЦИД₅₀. Это свидетельствует об их недостаточной эффективности в отношении безоболочечных вирусов даже при высоких концентрациях катионных поверхностно-активных веществ.

Таблица 1

Активность дезинфицирующих средств на основе смесей ЧАС с аминами или гуанидинами в отношении вируса полиомиелита в суспензионном тесте при экспозиции 60 минут

Активность дезинфицирующих средств на основе ЧАС в отношении вирусов

Дезинфицирующие средства на основе смесей четвертичных аммониевых соединений распространены в практике профилактической дезинфекции в лечебно-профилактических учреждениях, на объектах коммунального хозяйства и пищевой промышленности.

Четвертичные аммониевые вещества – соединения, у которых 4 валентности азота заняты алкильными или гетероциклическими радикалами определенного размера или длины цепи (R1–R4), а пятая валентность занята галогенидом, сульфатом или подобными радикалами [9, 10].

Наибольшее практическое значение имеют алкилбензилдиметиламмоний хлорид, смесь равных частей алкилбензилдиметиламмоний хлорида с алкилдиметилбензиламмоний хлоридом, диоктилдиметиламмоний хлорид, дидецилдиметиламмоний хлорид, смесь октилдецилдиметиламоний хлорида (50 %) с диоктилдиметиламмоний хлоридом (25 %) и дидецилдиметиламмоний хлоридом (25 %).

Антимикробное свойство ЧАС проявляется в отношении бактерий, некоторых грибов и обусловлено инактивирующим действием на ферменты, денатурацией основных клеточных белков и нарушением проницаемости мембраны клетки [11].

Для средств этой группы отмечают такие положительные качества, как хорошая растворимость, наличие моющего, антикоррозионного и антистатического действия, стабильность при хранении. Материалы из натурального хлопка способны поглощать четвертичные аммониевые соединения на своей поверхности, что приводит к снижению концентрации рабочего раствора более чем в 2 раза и соответствующему снижению микробиологической эффективности [12].

В литературе описаны случаи микробной контаминации, особенно грамотрицательной микрофлорой, растворов ЧАС [13, 14].

Вирулицидные свойства дезинфицирующих средств на основе одного или смесей нескольких ЧАС представлены в табл. 2.

Таблица 2

Вирулицидная активность дезинфицирующих средств на основе ЧАС

Примечание:

Б – вирусы без оболочки вириона;

О – вирусы с липидной оболочкой вириона;

н. э. – не эффективны (снижение титра вируса менее 4,0 lg ТЦИД₅₀);

эф. – снижение титра вируса 4,0 lg ТЦИД₅₀ или более;

н. п.* – исследование не проводились;

' – экспозиция < 5 мин.

Степень инактивации безоболочечных вирусов составила от 1,0 до 2,0 lg ТЦИД₅₀, не достигала критерия эффективности при экспозиции 60 минут в широком диапазоне концентрации действующих веществ от 0,047 до 0,66 % и не зависела от способа применения. Что касается инактивации оболочечных вирусов, таких как вирусы гриппа человека, иммунодефицита человека или гепатита С, то эффективные ингибирующие концентрации (≥ 4,0 lg ТЦИД₅₀) при экспозиции в 60 минут находились в диапазоне от 0,02 до 0,31 % (среднее – 0,148 ± 0,13 %) при обработке поверхностей способом протирания и от 0,2 до 0,5 % (среднее – 0,296 ± 0,14 %) при обработке ИМН способом погружения. Уровень рН-средств находился в диапазоне от слабо щелочного 7,5 до щелочного 12,5 и в среднем составил 10,5 ± 1,79. Достоверной зависимости эффективности концентраций от уровня рН не выявлено.

Активность средств на основе аминов в отношении вирусов

Триамины (третичные амины – производное аммиака, где NH2-группами замещены все три атома водорода) – относительно новый тип активно действующих веществ. Положительные свойства: относительно высокая биоцидная активность, хорошая совместимость с другими активно действующими веществами.

Результаты исследования эффективности аминов представлены в табл. 3. В отношении безоболочечных вирусов результаты были неоднозначны. Концентрации исследованных средств способом протирания находились в широком диапазоне от 0,05 до 0,4 % и составили среднем 0,166 ± 0,14 %. Только некоторые средства показали достаточную степень ингибирования вируса (≥ 4,0 lg ТЦИД₅₀) при концентрациях 0,05 % и 0,075 % способом протирания при экспозиции 60 минут и рН-средства от 7,5 до 9,5.

Таблица 3

Вирулицидная активность дезинфицирующих средств на основе аминов

Примечание:

Б – вирусы без оболочки вириона;

О – вирусы с липидной оболочкой вириона;

н. э. – не эффективны (снижение титра вируса менее 4,0 lg ТЦИД₅₀);

эф. – снижение титра вируса 4,0 lg ТЦИД₅₀ или более;

н. п.* – исследования не проводились.

Концентрации рабочих растворов при испытаниях способом погружения составили от 0,072 до 0,4 %. Из семи средств отсутствие эффективности (менее 4,0 lg ТЦИД₅₀) показали два при концентрациях в 0,25 и 0,4 %. Значения рН находились в диапазоне от 8,5 до 12,5. Достоверная связь эффективности с уровнем рН не выявлена. Отмечено, что увеличение концентрации аминов в рабочем растворе сопровождается уменьшением времени воздействия для достижения необходимой эффективности, что свидетельствует о положительной связи «доза-эффект».

Неоднозначность результатов исследования вирулидности аминов в отношении безоболочечных вирусов, возможно, связана с наличием в рецептурах инертных компонентов понижающих или повышающих активность средств. Следствием этого является невозможность интерполяции значений концентрации и времени воздействия на объект на эффективность средства в отношении безоболочечных вирусов.

Оболочечные вирусы показали достаточную чувствительность к аминам в диапазоне концентраций от 0,139 до 0,4 % при экспозиции 60 минут при способах применения «протирание» и «погружение» при широком диапазоне рН от 8 до 12,5.

Вирулицидная активность полигексаметиленгуанидина гидрохлорида

Степень инактивации безоболочечных вирусов полигексаметиленгуанидином (ПГМГ) вирусов составила от 1,0 до 2,0 lg ТЦИД₅₀ и не достигала критерия эффективности при экспозиции 60 минут в широком диапазоне концентраций. В виде монопрепарата средство эффективно в отношении гриппа человека, тип А/Н1N1 в концентрации 0,4 %, и при экспозиции 30 минут на кафеле. На линолеуме степень инактивации не достигала критерия эффективности. Исследована степень инактивации полимерной пленки ПГМГ, образующейся после высыхания на поверхности различных объектов. На пленку наносили культуру вируса гриппа человека тип А/Н1N1 (титр 6,5 lg ТЦИД₅₀) с интервалом через 1 час, через неделю, через 2 недели. Отмечено снижение степени инактивации вируса: в случае когда средство в виде пленки уже находилось на поверхности в течение одной недели – на 0,5–1,0 lg ТЦИД₅₀, а в случае 2 недель – на 1,5–2,0 lg ТЦИД₅₀ (табл. 4).

Таблица 4

Активность ПГМГ в виде высушенной пленки на объекте обеззараживания в отношении вируса гриппа А (титр вируса 6,5 lg ТЦИД₅₀) при экспозиции 30 минут

Активность комплексных средств на основе смесей ЧАС, аминов, гуанидинов в отношении вирусов

Вирулицидность в отношении безоболочеченых и оболочеченых вирусов комплексных средств на основе смесей трех действующих веществ ЧАС, аминов, гуанидинов представлена в табл. 5.

Комплексные средства показали эффективные суммарные концентрации для безоболочечных вирусов от 0,166 до 0,24 % при способе протирания и при способе погружения на ИМН – от 0,24 до 0,28 %. Для оболочечных вирусов от 0,08 до 0,09 % при способе «протирание» и при способе «погружение» на ИМН – от 0,166 до 0,185 %. Комплексные дезинфицирующие средства, содержащие в качестве ДВ гуанидины, амины и ЧАС, являются эффективными вирулицидными средствами. На основании представленных данных нет возможности определить зависимость вирулицидного эффекта от содержания компонентов средства.

Таблица 5

Примеры вирулицидной активности (≥ 4,0 lg ТЦИД₅₀) дезинфицирующих средств на основе комплекса трех ДВ (ЧАС, амины, гуанидины) в отношении оболочечных и безоболочечных вирусов при экспозиции 60 минут

3.2. Альдегиды и композиционные средства

В 1962 году Пипер (Peeper) и Либерман (Liberman) [15] предложили применять глутаровый альдегид (ГА) в виде 2 %-го водного раствора в слабо щелочной среде (рН 7,5–8,0) в качестве дезинфектанта со спороцидной активностью.

Существенным недостатком альдегидов является их способность фиксировать органические загрязнения на поверхности.

Преимуществом альдегидов является то, что они мало повреждают изделия из металла, пластика, стекла [16]. Учитывая высокую эффективность и полную совместимость с материалами большинства медицинских изделий, в том числе эндоскопов, он стал широко применяться для их стерилизации, а в последующем и для ДВУ.

Вирулицидное действие альдегидов является результатом реакции алкилирования сульфгидрильных, гидроксильных, карбоксильных групп и аминогрупп микроорганизмов, которые изменяют РНК, ДНК и денатурируют белок.

Таблица 6

Примеры вирулицидной активности (≥ 4,0 lg ТЦИД₅₀) комплексных средств на основе альдегидов и ЧАС при экспозиции 60 минут в отношении вируса полиомиелита

Примечание:

*ГА – глутаровый альдегид,

**ЧАС – четвертичные аммониевые соединения.

Имеются данные, что эффективное время инактивации безоболочечных вирусов концентрации глутарового альдегида ≥ 2,0 % в слабощелочной среде рН 7,5–8,5 составляет менее 10 минут [17,18].

В целях широкого применения для дезинфекции различных объектов больничной среды альдегиды комбинируют с четвертичными аммониевыми соединениями.

Эффективные концентрации глутарового альдегида в комбинации с ЧАС для поверхностей в отношении безоболочечных вирусов способом протирания составляли соответственно от 0,009 до 0,032 % и от 0,018 до 0,032 % при времени воздействия 60 мин. При способе обеззараживания методом погружения инактивирующие концентрации были в 1,5–2 раза выше и находились в диапазоне от 0,016 до 0,04 % для глутарового альдегида и ЧАС от 0,018 до 0,16 % (табл. 6).

Смеси глиоксаля с четвертичными аммониевыми соединениями были эффективными в более высоких концентрациях и составляли для способов протирания и погружения от 0,27 до 0,45 % и от 0,18 до 0,25 % соответственно.

Влияние концентрации четвертичных аммониевых соединений в рабочих растворах в смесях с глутаровым альдегидом или глиоксалем на эффективность инактивации безоболочечных вирусов не выявлено.