Текст книги "Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований"

Для пересева перевиваемых клеток питательную среду отсасывают пипеткой и выливают. Сформировавшийся тонкий слой разрушают раствором трипсина, и освобожденные таким образом клетки переносят в новый сосуд со свежим питательным раствором, где вновь образуется монослой клеток.

Индикатором наличия вируса в зараженных культурах клеток могут служить: а) развитие специфической дегенерации клеток; б) обнаружение внутриклеточных включений; в) обнаружение специфического антигена методом иммунофлюоресценции; г) положительная реакция гемадсорбции; д) положительная реакция гемагглютинации; е) образование бляшек.

Рис. 30. Внутриклеточные включения вируса в культуре клеток – тельца Гуарниери (по: Бургасов П. Н. и Николаевский Г. Р., 1972)

Для выявления специфической дегенерации в зараженных культурах клетки ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа. Многие вирусы при размножении в клетках вызывают их дегенерацию, т. е. оказывают цитопатическое действие (ЦПД).

Время развития и характер цитопатических изменений в инфицированных культурах клеток определяются свойствами и дозой инокулированного вируса, а также свойствами и условиями культивирования клеток. Одни вирусы (оспы, полиомиелита, Коксаки В и др.) вызывают ЦПД в пределах первой недели после заражения, другие (аденовирусы, парагриппозные вирусы, ЕСНО и др.) – спустя 1 – 2 нед. после заражения.

Вирусы вызывают цитопатические изменения трех основных типов: образование многоядерных гигантских клеток и симпластов, являющихся результатом слияния цитоплазмы многих клеток; круглоклеточную дегенерацию, возникающую вследствие утраты межклеточных связей и округления клеток; развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток.

При размножении некоторых вирусов в культурах клеток образуются внутриклеточные включения в цитоплазме или ядре пораженных клеток (рис. 30). Культуры клеток для выявления включений выращивают на стеклянных пластинках в пробирках, заражают вирусом и через определенные сроки инкубации готовят препараты, окрашивая их обычными красителями.

Для выявления специфического антигена в зараженных культурах клеток препараты готовят так же, как для выявления включений, используя МФА.

В основе метода бляшек лежит образование в монослое зараженных вирусом клеток под агаровым покрытием обесцвеченных участков, состоящих из дегенерированных (погибших) клеток. Эти участки, получившие название бляшек, представляют собой колонии вируса, образующиеся, как правило, из одной вирусной частицы.

При отсутствии цитопатических изменений, внутриклеточных включений, бляшкообразования, отрицательных реакций гемадсорбции и гемагглютинации в культурах клеток, зараженных исследуемым материалом, проводят два последующих пассажа. При отсутствии указанных изменений в конечном пассаже результат выделения вируса считают отрицательным.

Для обнаружения вирусов в инфекционном материале могут быть использованы микроскопические и иммунологические методы.

К микроскопическим относятся вирусоскопия и обнаружение внутриклеточных включений; к иммунологическим – иммунная электронная микроскопия, иммунофлюоресценция, гемагглютинация, гемадсорбция.

Идентификация вирусов осуществляется с помощью иммунологических методов, включающих следующие реакции: а) торможение гемагглютинации; б) задержку гемадсорбции; в) связывание комплемента; г) нейтрализацию; д) преципитацию в геле агара.

Микроскопические методы. С помощью светового микроскопа могут быть обнаружены только крупные вирусы, размеры которых превышают 150 нм. Распознавание вирусов, имеющих меньшие размеры, возможно лишь в электронном микроскопе. Для выявления крупных вирусов может применяться световая, фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия.

При вирусных инфекциях в зараженных клетках развиваются своеобразные включения. Одни инфекции (бешенство, оспенная вакцина) сопровождаются образованием включений в цитоплазме пораженных клеток, другие (корь, натуральная и ветряная оспа, аденовирусные заболевания) – в цитоплазме и ядре. Включения имеют различную природу, структуру, форму и размеры от 0,25 до 25 мкм. Согласно современным данным, при одних инфекциях включения являются местом размножения вируса и представляют собой его скопления, окруженные веществами клетки, при других – продукт дегенерации клетки.

Включения могут быть выявлены в окрашенных отпечатках органов и тканей, соскобах клеток, гистологических срезах из пораженной ткани и препаратах культур клеток, инфицированных вирусом. Окраску чаще производят по методу Романовского – Гимзы. Для окраски этим методом препараты фиксируют в смеси Дюбоска – Бразиля – Буэна, состоящей из пикриновой кислоты, формалина, спирта, уксусной кислоты. Внутриклеточные включения при большинстве вирусных инфекций являются оксифильными и красятся по методу Романовского – Гимзы в розовый или сиреневый цвет.

Иммунологические методы. В последние годы эти методы стали ведущими в лабораторной диагностике вирусных инфекций. Это во многом объясняется экономическими причинами, поскольку классические методы вирусологического анализа довольно дороги. Кроме того, длительность исследований с помощью вирусологических методов (недели), даже если они оказываются вполне эффективными, делают их ретроспективными.

Иммунологические методы используют как для обнаружения вирусных антигенов в различных биосубстратах и объектах внешней среды, так и для серодиагностики – выявления в сыворотках крови больных людей и лабораторных животных антител к вирусным антигенам. Помимо этого иммунологические методы исследования незаменимы при идентификации вирионов.

Взаимодействуя с организмом, вирусы вызывают образование антител, которые, адсорбируясь на вирионах, препятствуют проникновению вирионов в клетки и развитию цитопатического действия (ЦПД); нейтрализуют смертельное действие вирусов при репродукции их в куриных эмбрионах и организме животных; инактивируют вирионные гемагглютинины и нейраминидазы, предотвращая реакцию гемагглютинации (РГА) и реакцию гемадсорбции (РГадс) на пораженных вирусом клетках. Эти вируснейтрализующие антитела вызывают также агглютинацию и преципитацию вирусных частиц, а образующиеся при этом иммунные комплексы связывают комплемент. Поэтому для идентификации вирионов используются классическая реакция нейтрализации (РН) на культурах клеток, куриных эмбрионах и животных и ее модификации: реакция торможения гемагглютинации (РТГА); реакция торможения гемадсорбции (РТГадс). Те же реакции используются в серодиагностике вирусных инфекций для обнаружения в сыворотке больных вируснейтрализующих антител по известному вирусному антигену (диагностикуму).

Метод иммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ). Электронная микроскопия в настоящее время играет важную роль в изучении вирусов. Именно данные электронной микроскопии служат основой современной классификации вирусов.

Новый этап в развитии электронно-микроскопического изучения вирусов – применение техники иммуноэлектронной микроскопии. С помощью этого метода стали возможными не только прямое обнаружение вирусов, но и их идентификация, а также быстрое серотипирование вирусных штаммов и титрование антител к ним. Большое значение ИЭМ приобрела для определения локализации вирусных антигенов внутри клеток макроорганизма.

Несомненным преимуществом ИЭМ является ее высокая чувствительность по сравнению с другими электронно-микроскопическими методами.

При контакте антигена вируса или вирусного компонента с гомологичной антисывороткой формируется комплекс антитело – антиген. Данный феномен является основой методики, употребляемой для обнаружения и идентификации вирусных антигенов или антител к ним. Именно эти комплексы антигенов с антителами после негативного контрастирования можно наблюдать в электронном микроскопе. В клинической диагностике антигенный материал не требует тщательной очистки. Так, в случае выявления вируса гриппа можно исследовать неочищенную аллантоисную жидкость. В настоящее время считается, что практически любой вид клинического материала пригоден для ИЭМ. В диагностических целях можно применять обычную нефракционированную сыворотку, а также сыворотки реконвалесцентов. На конечные результаты большое влияние оказывает соотношение количеств антигена и антител. При избытке антигена наблюдают изобилие частиц; агломераты в данном случае будут немногочисленны. При избытке антител вирусные частицы окружены их толстым слоем, выявить мелкие структурные детали вириона практически невозможно; агрегаты также немногочисленны. При оптимальном соотношении количеств антигена и антител агрегаты укрупняются при хорошем изображении деталей вирионов. В связи с вышеизложенным желательно использовать иммунную сыворотку в нескольких разведениях.

На опорную сетку наносят пленку-подложку, приготовленную из палладия. При использовании низких концентраций палладия и для улучшения адсорбционных свойств подложки ее укрепляют с помощью угля. Для этого на готовую сухую пленку-подложку на электронно-микроскопической сетке напыляют уголь в вакууме. Толщина пленки-подложки и укрепляющего слоя углерода оказывает существенное влияние на изображение мелких деталей объекта. Конкретную толщину пленок-подложек и слоя угля каждый исследователь определяет индивидуально, исходя из того, что углерод более электронно прозрачен, чем палладий.

Вирусы и антитела к ним имеют малую электронную плотность, поэтому биологические объекты невозможно выявлять с помощью электронного микроскопа без предварительной обработки. Для визуализации вирусов используется техника негативного контрастирования (или негативной окраски). Для негативного контрастирования вирусов и комплексов «вирус – антитело» применяют различные соли тяжелых металлов. Контрастирующие вещества (атомы тяжелых металлов) проникают в гидрофильные участки объектов и замещают в них воду. В результате электронная плотность объекта возрастает, становится возможным его наблюдение в электронном микроскопе.

Прямой метод ИЭМ получил наибольшее применение в практике. Вирусную суспензию смешивают с неразведенной антисывороткой. После энергичного перемешивания смесь инкубируют в течение 1 ч при температуре 37 °C, затем в течение ночи – при 4 °C. На следующий день смесь центрифугируют для осаждения иммунных комплексов. Осадок ресуспендируют в капле дистиллированной воды и подвергают негативному контрастированию.

При оценке результатов ИЭМ продукты взаимодействия между антигеном и антителом в электронном микроскопе могут иметь различный вид (отдельной вирусной частицы, покрытой антителами полностью или частично; агломератов вирусных частиц). Агломераты могут занимать различную площадь, иметь различный внешний вид, содержать различное количество частиц. Поэтому, наряду с опытными, необходимо исследовать контрольные препараты (с буферным раствором или гетерологичной антисывороткой).

Критерий оценки результатов, полученных с помощью ИЭМ, – наличие или отсутствие в препаратах скоплений вирусных частиц, агрегированных иммунной сывороткой. Наличие агломератов антигена и антител специфической антисыворотки – признак положительной реакции. Тем не менее следует учитывать возможность неспецифической агрегации частиц антигена под влиянием высокоскоростного центрифугирования. По этой причине многие авторы рекомендуют учитывать результаты по условной шкале от 0 до 4 +. Она основана на оценке степени покрытия агрегированных частиц антителами сыворотки.

Методы гемагглютинации и гемадсорбции. Многие вирусы обладают способностью агглютинировать (склеивать) эритроциты строго определенных видов млекопитающих и птиц. Так, вирусы гриппа и эпидемического паротита агглютинируют эритроциты кур, морских свинок, человека; вирус клещевого энцефалита – эритроциты барана; вирусы японского энцефалита – эритроциты однодневных цыплят и гусей; аденовирусы – эритроциты крыс, мышей, обезьян. В качестве исследуемого материала в реакции гемагглютинации (РГА) используют аллантоисную, амниотическую жидкости, суспензию хорион-аллантоисных оболочек куриных эмбрионов, взвеси и экстракты из культур клеток или органов животных, зараженных вирусами. Реакцию гемагглютинации можно ставить капельным методом на стекле и в развернутом ряду в пробирках или лунках пластин из полистирола. Первый метод является ориентировочным.

Являясь группоспецифической, РГА не позволяет определить видовую принадлежность вирусов. Их идентифицируют с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Для ее постановки используют заведомо известные иммунные противовирусные сыворотки. К каждому их разведению добавляют равное количество вируссодержащей жидкости. Контролем является взвесь вируса. Смесь выдерживают в термостате, затем добавляют взвесь эритроцитов. Спустя несколько минут определяют титр вируснейтрализующей сыворотки, т. е. максимальное ее разведение, вызвавшее задержку агглютинации эритроцитов.

В серологической диагностике вирусных болезней РТГА рекомендуется ставить с парными сыворотками, одну из которых получают в начале заболевания, а другую – спустя 1 – 2 недели и более. Четырехкратное нарастание титра антител во второй сыворотке подтверждает предполагаемый диагноз.

Реакцию гемадсорбции (РГадс) применяют для индикации в зараженных культурах клеток вируса, обладающего гемагглютинирующей активностью. Сущность реакции заключается в том, что на поверхности клеток, зараженных вирусами, адсорбируются эритроциты, чувствительные к гемагглютинирующему действию вирусов. Так, например, на клетках, зараженных вирусом натуральной оспы, адсорбируются эритроциты кур; вирусом кори – эритроциты обезьян; аденовирусами – обезьян и крыс и др. (рис. 31).

Рис. 31. Феномен гемадсорбции (по: Лебедева М. Н., 1973)

Репродуцируясь в культурах клеток, вирусы вызывают разного рода ЦПД, выражающееся в округлении, сморщивании, уменьшении или, наоборот, увеличении размеров клеток, слиянии их и образовании симпластов, деструкции цитоплазмы и ядра. Наконец, в монослое клеток, зараженных вирусами, в результате разрушения ими отдельных участков клеточного пласта могут появляться «стерильные пятна», или бляшки, представляющие собой клон вирусной частицы, что дает возможность не только изолировать вирус, но и определить его титр.

Идентифицировать вирус по характеру бляшек очень трудно, и поэтому прибегают к постановке реакции нейтрализации (РН) выделенного вируса заведомо известными вируснейтрализующими сыворотками. С этой целью полученный от больного вирус накапливают в культуре клеток и различные его разведения смешивают с неразведенной противовирусной сывороткой.

Смесью вирусов и сывороток можно заражать куриные эмбрионы или чувствительных животных. В таких случаях нейтрализующую активность антител чаще всего определяют по нейтрализации вирусных гемагглютининов в жидкостях эмбриона и устранению смертельного действия вируса на эмбрионы и животных. Одновременно вычисляют индекс нейтрализации, выражающий максимальное количество смертельных доз вируса, которое нейтрализуется данной сывороткой, по сравнению с результатами контрольного опыта, принимаемыми за единицу.

Подобным образом с помощью РН идентифицируются вирусы, выделенные из материала больных, при заражении им куриных эмбрионов и животных. Для этого к вируснейтрализующим сывороткам прибавляют вируссодержащие жидкости эмбрионов и взвеси пораженных органов животных. После определенного времени инкубации смесями инфицируют культуры клеток, куриные эмбрионы и животных.

В серодиагностике вирусных инфекций определяют динамику нарастания титра вируснейтрализующих антител по известному вирусу. При этом ставят РН с парными сыворотками, взятыми от больных в начале и в конце болезни. Диагностическим явится 4-кратное возрастание титра иммуноглобулинов во второй из них.

Реакция нейтрализации основана на способности специфических антител достаточно прочно соединяться с вирусной частицей. В результате взаимодействия между вирусом и антителом происходит нейтрализация инфекционной активности вируса вследствие блокады антигенных детерминант, ответственных за соединение вирусной частицы с чувствительными клетками. В результате вирус утрачивает способность размножаться в чувствительной к нему биологической системе in vitro или in vivo.

Результаты РН становятся очевидными после того, как смесь вируса и гомологичных ему антител после определенной по времени экспозиции будет внесена в чувствительную биологическую систему (тканевая культура клеток, куриный эмбрион, организм восприимчивого животного), где вирус может размножаться и вызывать поддающиеся учету изменения, которые будут подавлены частично или полностью в присутствии антител.

В РН участвуют три компонента: а) вирус, б) сыворотка, содержащая антитела, в) биологический объект (лабораторные животные, развивающиеся куриные эмбрионы, тканевые культуры). Выбор компонента зависит от вида вируса, с которым предполагается проводить исследования.

Реакцию нейтрализации используют либо для идентификации выделенного возбудителя, либо для обнаружения и титрования антител в сыворотках.

В первом случае пользуются сыворотками специально иммунизированных лабораторных животных или переболевших людей. Во втором – применяют сыворотки, взятые в начальной стадии болезни и в период реконвалесценции.

Вируснейтрализующие антитела в сыворотках переболевших людей в отличие от антигемагглютининов или комплементсвязывающих антител сохраняются многие годы, а при некоторых вирусных инфекциях (например, при кори) даже пожизненно. Это позволяет в ряде случаев использовать пул сывороток многих реконвалесцентов в качестве референс-препарата, который после разлива в ампулы и лиофилизации пригоден для диагностической работы в течение длительного времени.

При идентификации выделенных возбудителей пользуются заранее приготовленными гипериммунными сыворотками различных животных: кроликов, белых крыс и мышей, морских свинок, обезьян, баранов, лошадей и т. д.

Активность гипериммунных сывороток для РН зависит от способа иммунизации животных.

Перед постановкой каждого нейтрализационного опыта вирус предварительно титруют, определяя конечное разведение, вызывающее повреждение культуры ткани либо инфицирование лабораторных животных (или куриных эмбрионов).

Титр вируса выражают в 50 % дозе (ТКИД₅₀ – 50 % инфекционная доза для тканевой культуры).

Глава 7
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МИКРООРГАНИЗМА С ОРГАНИЗМОМ ЧЕЛОВЕКА И МИКРОЭКОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА

Первоначально в историческом плане под инфекцией понимали заражение венерическими заболеваниями. В настоящее время термин инфекционный процесс, инфекция (от лат. inficio – загрязнять, вносить что-либо извне) обозначает эволюционно сложившиеся взаимоотношения восприимчивого человеческого организма (макроорганизма) и болезнетворного, или патогенного, микроорганизма в определенных условиях внешней и социальной среды. Крайней степенью этого взаимодействия является инфекционная болезнь – совокупность обусловленных биологическими агентами расстройств нормального функционирования организма. Клинические проявления инфекционного процесса изучает наука инфектология, а проявление инфекции в человеческих коллективах изучает эпидемиология.

Термин эпидемия происходит от греческих слов эпи — в, на и демос – народ. Целью эпидемиологии является изучение механизма возникновения и развития эпидемического процесса, а также разработка и применение методов предупреждения инфекционных болезней и борьбы с ними.

Патология инфекционной природы имеет характерные отличия от других заболеваний:

1. Инфекционные болезни вызываются живыми микроорганизмами, за исключением вирусов и прионов.

2. Инфекционным болезням свойственна контагиозность (заразность).

3. Для инфекционных болезней характерен скрытый (инкубационный) период.

4. После перенесенных инфекционных болезней, как правило, развивается невосприимчивость к повторному заражению тем же возбудителем (иммунитет).

В годы «золотого века» микробиологии (конец XIX – начало XX в.) господствовала так называемая триада Коха, которая подчеркивала ведущую роль микроорганизма в развитии инфекционнoго процесса. Основные постулаты этой триады:

• микроорганизм всегда должен встречаться при конкретной инфекции и не встречаться у здоровых индивидуумов или у больных другими инфекциями;

• микроорганизм должен быть выделен от больного в чистой культуре;

• чистая культура микроорганизма, введенная в организм другого человека (лабораторного животного), должна вызывать то же самое заболевание.

В дальнейшем эмпирические наблюдения привели к полному пересмотру всех положений этой доктрины. Было установлено, что развитие болезни зависит не только от свойств возбудителя, но и от состояния макроорганизма (организма человека), которое, в свою очередь, определяется условиями его существования. Наиболее полно сущность взаимоотношений патогенных микроорганизмов с организмом человека раскрыл В. Д. Беляков в 1986 г., описавший процесс взаимодействия гетерогенных (чужеродных) популяций паразита и хозяина, наступающий при наличии необходимых и достаточных социальных и природных факторов и проявляющийся у зараженных людей развитием манифестных (явных) и бессимптомных форм инфекций.

Инфекция – это сложное биологическое явление, возникающее в результате взаимодействия микроорганизмов с макроорганизмами животного или растительного происхождения. Она отображает общебиологический закон симбиоза, сформировавшегося в процессе эволюции. Все разновидности симбиотических взаимоотношений (комменсализм, мутуализм, паразитизм), наблюдаемые у высокоорганизованных живых существ, присущи также и микроорганизмам. При комменсализме совместное существование нормальной микрофлоры тела человека и самого человеческого организма никому из членов сообщества не наносит ущерба.

При мутуализме из совместного существования оба члена сообщества извлекают пользу. Так, многие представители микрофлоры толстого кишечника синтезируют биологически активные вещества, утилизируя, в свою очередь, питательные субстраты, поступившие в желудочно-кишечный тракт. И только при паразитизме микроорганизм наносит существенный вред своему хозяину – человеческому организму.

Под источником инфекции подразумевают любую естественную среду (резервуар) обитания патогенного микроорганизма. Как правило, это заболевший или инфицированный человек, от которого могут заразиться другие люди. Однако инфекцию нельзя отождествлять исключительно с микроорганизмом – возбудителем заболевания. Большую роль играет восприимчивость человеческого организма. И третьим компонентом в сложном взаимодействии микро– и макроорганизма является механизм передачи возбудителя.

Инфекционные болезни проявляются, как правило, формированием эпидемических очагов (место заражения и нахождения заболевшего человека, окружающие его люди и животные, а также сама территория, в пределах которой возможно заражение).

Под эпидемическим процессом следует понимать возникновение и распространение инфекционных заболеваний. Это непрерывная цепь последовательно возникающих однородных заболеваний. Данный процесс проявляется в форме эпидемической и экзотической заболеваемости.

Эпидемическая заболеваемость постоянно наблюдается в конкретной местности, а экзотическая отмечается при завозе инфекций в те районы, где ранее эта инфекция не отмечалась. Для характеристики интенсивности эпидемиологического процесса используются такие понятия как спорадическая заболеваемость, эпидемическая вспышка, эпидемия и пандемия.

Спорадическая заболеваемость – это обычная характерная для данной местности и времени года заболеваемость, характеризующаяся появлением отдельных разрозненных случаев инфекции. Под эпидемической вспышкой следует понимать ограниченный во времени и по территории резкий подъем заболеваемости, связанный с одномоментным заражением. Эпидемия — это более широкое распространение инфекции, значительно превышающее обычно регистрируемый в данной местности уровень заболеваемости. Пандемия – огромное как по уровню, так и по масштабам распространение инфекции, с охватом ряда стран, континентов и даже всего земного шара. Под терминами эпизоотия (панзоотия) следует подразумевать эпидемию (пандемию) у животных.

Выделяют следующие классы инфекций, исходя из их источника: антропонозы (передаются от человека); зоонозы (передаются от животных); сапронозы (возбудители локализованы во внешней среде). Под механизмом передачи следует подразумевать эволюционно сложившийся способ переноса патогенных микроорганизмов от источника инфекции в восприимчивый человеческий организм. Он состоит из трех фаз:

– выведения микроорганизма из зараженного макроорганизма;

– пребывания микроорганизма во внешней среде;

– внедрения в другой организм.

При этом механизм передачи возбудителя может быть реализован тремя путями: фекально-оральным (энтеральным); воздушнокапельным (аэрозольным); контактно-бытовым (трансмиссивным).

Входные ворота инфекции – это ткани, лишенные физиологической защиты против конкретного возбудителя той или иной инфекции. К ним относятся слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта при энтеральных инфекциях, слизистые оболочки трахеи и бронхов при аэрозольных инфекциях, кожа и слизистые оболочки при контактно-бытовых инфекциях.

Под восприимчивостью человека к инфекции следует понимать биологические свойства тканей организма человека являться как бы питательной средой для размножения микроорганизмов и отвечать на их внедрение развитием инфекции. Степень восприимчивости зависит от индивидуальной реактивности человека.

Активность эпидемического процесса меняется под влиянием природных и социальных условий. К природным условиям относят климат, ландшафт, окружающий человека, животный и растительный мир, наличие очагов инфекционных заболеваний, стихийные бедствия.

Более значимо влияние социальных условий. Это все многообразие условий жизни: плотность населения, жилищные условия, санитарно-коммунальное благоустройство населенных пунктов, материальное благосостояние, условия труда, культурный уровень человека, миграция населения и, наконец, состояние здравоохранения.