Текст книги "Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований"

Общая рекомбинация происходит между гомологичными ДНК. Сайт-специфическая рекомбинация обусловлена наличием специфических участков у рекомбинируемых молекул ДНК, например, хромосомы E. coli и умеренного бактериофага лямбда. Общая и сайт-специфическая рекомбинации контролируются геном rec A. Рекомбинации, осуществляемые транспонируемыми элементами, также сайт-специфичны и определяются особыми нуклеотидными последовательностями, однако не зависят от rec A гена. Ведущая роль в процессах рекомбинации у бактерий принадлежит гену rec A. Его продукт – белок Rec A (молекулярная масса 38 кД) обладает уникальными функциями: прочно связывается с одиночными нитями ДНК; способствует высвобождению разорванной нити из двойной спирали ДНК; удерживает вместе одиночную нить ДНК и двойную спираль ДНК; обладает свойством ДНК-зависимой АТФазы. Ген rec A участвует не только в процессе рекомбинации. Его продукт необходим для пострепликативной репарации, индукции профага, клеточного деления и других важных функций бактерий. Рецессивные мутации в таком гене отражаются на всех этих функциях, поэтому они получили название SOS-функций, а их совокупность представляет единую SOS-систему. Выражение любой SOS-функции зависит от активности продукта гена rec A. SOS-система срабатывает после любых повреждающих воздействий на ДНК, поэтому ген rec A играет основную роль в самозащите генетической системы бактерий.

Применение методов генетики для изучения генома бактерий позволило создать геносистематику бактерий. На ее основе существенно уточнена действующая классификация бактерий и созданы предпосылки для разработки естественной систематики и классификации. В интересах систематики используют ряд методов. Метод гибридизации ДНК-ДНК выявляет уровень гомологии ДНК. Считается, что показатель 60 – 100 % гомологии ДНК указывает на родство на уровне вида. Метод гибридизации ДНК с рРНК выявляет генетические связи между участком ДНК, контролирующим синтез рРНК, и нуклеотидами рРНК. Цистроны, ответственные за синтез рРНК, консервативны и позволяют выявить родственные связи на уровне рода, семейства.

Наиболее надежным является метод секвенирования ДНК, выявляющий последовательность нуклеотидов в отдельных фрагментах ДНК или всей ДНК хромосомы. Лучшим (наиболее консервативным) объектом исследования является участок ДНК, контролирующий синтез 16S рибосомальной РНК бактерий. ДНК этого фрагмента клонируют, затем секвенируют. Метод секвенирования ДНК является основным в геносистематике; он позволяет выявить родство бактерий на уровне царства, класса, семейства, рода, но недостаточно эффективен для установления вида. Этот метод также помогает установить эволюционные связи бактерий.

Раскрыт генетический механизм весьма важной для медицины проблемы приобретенной лекарственной устойчивости бактерий. Установлено, что основную роль в быстром формировании устойчивости бактерий к антибиотикам играют R-плазмиды, несущие гены устойчивости к 10 антибиотикам в любых сочетаниях. Они могут передавать гены антибиотикорезистентности чувствительным бактериям за несколько минут, превращая в устойчивую всю популяцию бактерий в организме. До сих пор не существует эффективных средств удаления R-плазмид или блокады их передачи. Пока реальным достижением является применение препаратов, блокирующих активность ферментов, разрушающих антибиотики, которые контролируются R-плазмидами. Например, для инактивации бета-лактамазы используют клавулановую кислоту, сульбактам, тазобактам в сочетании с антибиотиками бета-лактамной группы.

Установлен генетический контроль факторов патогенности бактерий. Показана возможность локализации этих генов в геномах бактерий, бактериофагов, плазмид. Выявлены механизмы формирования патогенных штаммов среди условно-патогенных бактерий. Это позволяет выявлять патогенные бактерии молекулярно-биологическими методами и целенаправленно получать авирулентные вакцинные штаммы микроорганизмов.

Крупным достижением в области генетики является разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), отмеченного Нобелевской премией (Мюллис К., 1993). На основе ПЦР создана принципиально новая универсальная система индикации микроорганизмов и диагностики инфекционных заболеваний – геноиндикация. Метод ПЦР позволяет клонировать in vitro определенные участки ДНК, за 2 – 4 ч получить миллионы копий этой ДНК. Сущность метода составляет многократный циклический процесс, попеременно включающий в каждом цикле три этапа: тепловую денатурацию ДНК (плавление), ее отжиг (присоединение синтетических олигонуклеотидных праймеров) и синтез (достраивание второй цепи ДНК термостабильной ДНК-полимеразой). Смена этих этапов происходит в результате изменения температуры реакционной смеси в специальном приборе амплификаторе (термоциклере). Денатурация исходной и последующих копий ДНК, ведущая к разделению ДНК на две одиночные цепи, происходит при температуре 90 – 95 °C в течение 40 – 50 с. Отжиг (присоединение праймеров) происходит при температуре 40 – 65 °C.

Праймеры – синтетические олигонуклеотиды (20 – 30 нуклеотидов) – присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Праймеры подбирают так, чтобы они ограничивали искомый фрагмент и были комплементарны противоположным цепям ДНК; при этом один праймер находится на одной цепи, другой – на противоположной. Синтез (элонгация) – достраивание второй цепи ДНК происходит при температуре 72 °C с участием Taq-ДНК-полимеразы. Достраивание второй нити ДНК идет с 5′-конца к 3′-концу каждой нити ДНК, т. е. в противоположных направлениях. В результате первого цикла образуются две копии участка ДНК, ограниченного праймером. Длительность цикла составляет 30 – 40 с. В результате каждого последующего цикла количество синтезируемых копий удваивается в геометрической прогрессии (рис. 21). Обычно ПЦР включает 20 – 30 циклов, что обеспечивает синтез 1 млн копий искомого фрагмента ДНК.

Рис. 21. Схема полимеразной цепной реакции. Сплошной линией показана исходная ДНК, пунктирной – вновь синтезированная

Для детекции продуктов ПЦР применяется электрофорез в 1,5 – 3 %-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. По окончании электрофореза гель просматривают в УФ-свете на трансиллюминаторе и оценивают результаты.

Метод ПЦР позволяет быстро обнаружить искомый микроорганизм непосредственно в исследуемом материале без выявления чистой культуры, имеет высокую чувствительность (1 × 10¹– 1 × 10³микроорганизмов в 1 г материала). Он широко применяется для обнаружения трудно культивируемых и медленно растущих микроорганизмов (вирусов, хламидий, риккетсий, микоплазм и микобактерий).

В лабораторной практике для индикации и идентификации микроорганизмов используют также метод ДНК-зондов, являющийся разновидностью метода молекулярной гибридизации ДНК-ДНК. Его отличие от последнего заключается в том, что гибридизация ведется не между двумя препаратами тотальной ДНК, а между фрагментами ДНК-зонда (обычно в пределах известного гена) и всей ДНК изучаемого микроорганизма. ДНК-зонды метят изотопами или нерадиоактивной меткой (биотином).

Важное значение в эпидемиологической практике имеют методы внутривидового генетического маркирования штаммов бактерий. К ним относится метод геномной дактилоскопии, или фингерпринтинг (англ. fingerprinting – снятие отпечатков пальцев). Сущность его состоит в рестрикционном анализе ДНК. Очищенную ДНК исследуемого микроорганизма обрабатывают соответствующей специфической эндонуклеазой (рестриктазой), полученные фрагменты ДНК разделяют путем электрофореза в геле. Для каждого исследуемого штамма на электрофореграммах (рестриктограммах) образуется паттерн с характерным набором полос. Число фрагментов, их размер и общая картина расположения специфичны для каждого микроорганизма, как отпечатки пальцев. Сравнивая рестриктограмму контрольного (известного) штамма с рестриктограммой исследуемого штамма, можно определить их тождество или различие. Вариантом метода является риботипирование, когда рестрикции подвергаются участки ДНК, кодирующие рРНК. Метод геномной дактилоскопии позволяет дифференцировать родственные бактерии на внутривидовом уровне.

Выдающимся достижением генетики и микробиологии является создание генной инженерии. Генной инженерией называют прикладную генетику, которая разрабатывает методы целенаправленной перестройки геномов и их генетической информации на молекулярном и клеточном уровнях. Она включает в себя совокупность приемов, позволяющих перенести генетический материал из одного организма в другой таким образом, чтобы обеспечить наследование и экспрессию перенесенных генов. Применительно к бактериям генная инженерия использует трансгеноз, то есть искусственный перенос генов (обычно генов эукариот) в клетку бактерий.

Трансгеноз состоит из трех этапов: 1) выделения гена, подлежащего переносу; 2) включения гена в вектор, т. е. в автономно реплицирующуюся генетическую структуру, с помощью которой гены могут быть размножены и введены в клетку-реципиент; 3) передачи вектора с чужеродными генами в клетку-реципиент, где чужеродные гены клонируются (размножаются) в составе хромосом или автономных репликонов и обеспечивают синтез необходимых веществ.

Первый этап. Его задачей является перенос генов эукариот (человека, животных), контролирующих синтез необходимых веществ (гормонов, ферментов) в геном бактерий. Для преодоления генетического барьера между эукариотами и прокариотами предварительно in vitro получают на матрице зрелой информационной РНК соответствующей локализации в ДНК нужного гена с помощью фермента обратной транскриптазы (ревертазы) копийную ДНК (к-ДНК), содержащую ген с нужной информацией. Необходимый ген выделяют из к-ДНК с помощью специфических ферментов рестриктаз (эндонуклеаз). Рестриктазы распознают и разрезают строго определенные участки ДНК так, чтобы срез каждой нити проходил «косо» – на вырезанном двунитевом фрагменте ДНК на концах остаются однонитевые участки («липкие концы»).

Второй этап. Этим же видом рестриктаз обрабатывают молекулы вектора, чтобы перевести их кольцевые структуры в линейные и в местах разреза получить «липкие концы», соответствующие «липким концам» ДНК переносимого гена. В качестве вектора обычно используют R-плазмиды, фаг лямбда. Затем смешивают фрагменты ДНК с нужным геном и ДНК разрезанного вектора. При этом ДНК с нужным геном «липкими концами» встраивается в геном вектора. Места прикрепления гена сшиваются ферментом лигазой. Таким образом получается гибридная молекула вектора с нужным чужеродным геном.

Третий этап. Вектор вводится в клетки бактерий-реципиентов, где он клонируется (реплицируется), передается из клетки в клетку при делении, а чужеродный ген экспрессируется, обеспечивая синтез необходимого продукта. В качестве бактерий-реципиентов чаще всего используют кишечную палочку (рис. 22).

Рис. 22. Схема получения трансгенных клеток E. coli – продуцентов интерферона человека (по: Шапиро Я. С., 2003):

мРНК – интерфероновая мРНК из клеток человека; кДНК1 – комплементарная однонитевая ДНК; кДНК2 – комплементарная двунитевая ДНК; рВR322 – плазмидный вектор; 1 – обратная транскриптаза; 2 – полимераза; 3 – лигаза; 4 – плазмида с геном интерферона; 5 – трансформация; 6 – клетка кишечной палочки с реконструированной плазмидой

Генная инженерия впервые дала возможность человеку управлять наследственностью. Так возникла биотехнология — промышленный способ производства на основе управляемого метаболизма живых организмов. В настоящее время происходит бурное развитие биотехнологии, основным объектом которой являются микроорганизмы. Именно микроорганизмы (бактерии, грибы) благодаря особенностям их метаболизма наиболее продуктивны и экономичны в биосинтезе веществ. Микроорганизмы поставляют также материал для генной инженерии (ревертазу, эндонуклеазы, векторы для генов). Из бактерий получают в большом количестве дешевые биологически активные вещества (гормоны, ферменты), которые ранее были дефицитными и очень дорогими. В нашей стране производятся генно-инженерный интерферон (реоферон), инсулин, интерлейкин-2, вакцина против гепатита В.

Генная инженерия и биотехнология открывают перед человечеством огромные перспективы. Однако даже обычные эксперименты в этой области могут быть опасными, так как при переносе генов могут возникнуть организмы с непредсказуемыми свойствами, поэтому работы по генной инженерии производятся в соответствии со строгими международными правилами.

Глава 6
МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

В связи с малыми размерами большинства патогенных микроорганизмов (не более 30 мкм) изучение их морфологии возможно только с помощью специальных оптических приборов, получивших название микроскопов (от греч. «микрос» – малый и «скойпен» – рассматривать, наблюдать).

Современные микроскопы позволяют получать раздельное увеличенное изображение микроорганизмов и других объектов и структур, не доступных невооруженному человеческому глазу.

В настоящее время в практике микробиологических исследований используется несколько типов микроскопов (биологический, люминесцентный, исследовательский, электронный) и специальных методов микроскопии (темнопольный, фазовоконтрастный).

Окрашенные тела микроорганизмов резко отличаются от общего фона препарата, что позволяет установить морфологические особенности микроорганизмов (форму, размеры, наличие спор, жгутиков, капсул) и степень чистоты выделяемой культуры.

Приготовление окрашенного препарата включает в себя несколько последовательных операций: подготовки мазка, высушивания, фиксации, окраски. Вначале обезжиривают предметное стекло и наносят на него каплю изучаемой взвеси микроорганизма. Если мазок получают из бактерий, выросших на плотной питательной среде, то предварительно на стекло наносят каплю физиологического раствора, в которой эмульгируют материал (рис. 23, см. цв. вклейку).

После высушивания мазка на воздухе необходима фиксация. Для этого стекло помещают в сосуд с этанолом или ацетоном (химический способ фиксации) или трижды проводят в пламени спиртовки (физический способ фиксации). Этим достигаются сразу две цели – микроорганизмы погибают и плотно фиксируются на поверхности стекла.

Существуют простые и сложные методы окраски. При простых методах можно использовать только одну краску – водный фуксин (1 – 2 мин) или метиленовый синий (3 – 5 мин). По окончании окрашивания препарат промывают струей воды до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной, и сушат его на воздухе при комнатной температуре, или осторожно промокая фильтровальной бумагой.

Сложные методы окраски предусматривают последовательное использование нескольких красителей различного химического состава, что позволяет выявить определенные структуры бактериальной клетки.

В живом состоянии микроорганизмы исследуют с целью выявления их формы, подвижности или определения прижизненной внутренней структуры. Изучают нативные и окрашенные препараты, используя методы «раздавленной» или «висячей» капли.

В центре влажного препарата быстро возникает недостаточность кислорода. В сущности именно это помогло Пастеру открыть анаэробный обмен: наблюдая за препаратом, он заметил, что анаэробы сохраняли подвижность только в центре, но не по краям. Подвижные микроорганизмы иногда могут адсорбироваться на стекле; в таких случаях подвижность легче наблюдать в «висячей» капле.

При изучении подвижности микроорганизмов необходимо отличать истинную подвижность от броуновского движения, которое является следствием ударов о бактерии движущихся в растворе молекул и выявляется в виде колебаний. Многие подвижные микроорганизмы движутся очень быстро, что затрудняет наблюдение. Добавляя к суспензии микроорганизмов метилцеллюлозу, можно уменьшить скорость их движения и создать условия, при которых движение жгутиков становится видимым.

В природе микроорганизмы существуют в смешанной популяции. Для изучения свойств микроорганизмов, определения их систематического положения необходимо прежде всего изолировать отдельные виды микробов и вырастить их в виде так называемых «чистых культур», а затем идентифицировать, т. е. установить их соответствие видам, описанным в специальных определителях (схема).

Культивировать микроорганизмы можно лишь при создании определенных условий для их жизнедеятельности. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть простерилизованы и после посева инокулята (микробного материала), защищены от загрязнения извне с помощью пробок или металлических колпачков и крышек.

Посев инокулята является первым этапом исследования. В практической работе для получения «чистых культур» микроорганизмов используют одну из модификаций метода высева на чашки со средой.

Схема

Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий

Рис. 25. Посев штрихами

Эти методы основаны на том, что отдельные микроорганизмы развиваются на поверхности либо в глубине питательной среды, в которую добавлен агар или какое-нибудь другое гелеобразующее вещество.

Петлю стерилизуют в пламени, остужают и вносят в пробирку с исследуемым материалом. Затем снимают или приоткрывают крышку чашки Петри с питательной средой (рис. 24, см. цв. вклейку) и вносят материал одним из нижеперечисленных способов.

1. Посев петлей: посевной материал втирают петлей в поверхность среды у края чашки, избыток снимают, проколов петлей агар, а оставшийся материал рассеивают параллельными штрихами по стерильной поверхности среды (рис. 25).

2. Посев шпателем: материал наносят на поверхность среды петлей или пипеткой, а затем стеклянным или металлическим шпателем тщательно втирают его по всей поверхности агара. После посева металлический шпатель прокаливают в пламени горелки, а стеклянный помещают в дезинфицирующий раствор.

3. Посев тампоном: тампон с исследуемым материалом вносят в чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды, одновременно вращая тампон и чашку.

4. Посев на секторы: дно чашки расчерчивают на секторы, посев производят зигзагообразными движениями от края чашки к центру так, чтобы штрихи с одного сектора не переходили на другой (рис. 26).

5. Посев газоном: 1 мл исследуемого материала (жидкой бульонной культуры или взвеси микробов в физиологическом растворе) наносят пипеткой и тщательно распределяют по всей поверхности среды. Избыток материала отсасывают пипеткой и вместе с ней помещают в дезинфицирующий раствор.

Рис. 26. Посев секторами

После посева чашки закрывают и переворачивают вверх дном. Надписи на чашках делают со стороны дна, а на пробирках – в верхней части. При выделении чистых культур аэробов можно использовать методы, основанные не только на механическом разобщении бактерий, но и на их различиях по биологическим свойствам. Так, например, некоторые подвижные бактерии могут быстро распространяться по слегка влажной поверхности питательной среды, благодаря этому можно очистить их от неподвижных видов микробов. Иногда при выделении микроорганизмов из природных популяций полезно включить в среду вещества, избирательно подавляющие рост тех или иных микробов. Например, добавляя полиеновые антибиотики (нистатин) в среду, очищают бактериальные культуры, сильно загрязненные грибами.

Посевы инкубируются в термостате 18 – 24 ч. В течение этого времени из отдельных микробных клеток формируются изолированные колонии.

Второй этап исследования – изучение изолированных колоний. Колония – это изолированное скопление микробных клеток одного вида на плотной питательной среде. Строение колоний является важным культуральным признаком при определении вида микроорганизмов, так как каждому виду микробов при росте на определенной плотной питательной среде присуща типичная форма колонии.

Колонии изучают невооруженным глазом в проходящем и отраженном свете и с помощью лупы или под микроскопом при малом увеличении. В проходящем свете их рассматривают со стороны дна чашки; отмечают величину колоний (крупные – от 4 – 5 мм в диаметре и более; средние – 2 – 4 мм; мелкие – 1 – 2 мм и карликовые – меньше 1 мм), их форму (правильная, круглая, неправильная, плоская, сферическая) и прозрачность (рис. 27).

В отраженном свете, рассматривая колонии со стороны крышки, определяют цвет (бесцветная, окрашенная), характер поверхности (гладкая, бугристая, блестящая, матовая), расположение колоний на поверхности среды (выпуклое, плоское, вдавленное).

Обращают внимание на характер краев колоний (ровные, фестончатые, зазубренные), структуру (гомогенная, зернистая, однородная или различная в центре и по периферии).

Важно определить тип колонии. Различают два основных типа колоний бактериальной культуры: а) гладкие – S-тип (от англ. smooth – гладкий), характеризующийся круглой и выпуклой формой, гладкой поверхностью, влажной консистенцией; б) шероховатые – R-тип (от англ. rough – шероховатый), характеризующийся шероховатой поверхностью, неправильными краями, сухой консистенцией. Образуются из гладких S-форм в результате мутации.

Рис. 27. Формы колоний микроорганизмов (по: Шильникова В. К., 2004): а – круглые; б – круглые с фестончатым краем; в – круглые с валиком по краю; г и д – ризоидные; е – с ризоидным краем; ж – амебовидные; з – нитевидные; и – складчатые; к – неправильные; л – концентрические; м – сложные

Помимо этих двух основных типов колоний существует так называемый слизистый М-тип (от лат. mucus – слизистый), характеризующийся тягучей слизистой консистенцией; образуется в процессе диссоциации бактериальных культур. Часть изученной колонии берут для приготовления мазка, который окрашивают и микроскопируют. При подтверждении однородности состава колонии микроскопированием оставшуюся ее часть отвивают на скошенный агар для накопления чистой культуры.

Питательные среды предназначены для накопления, выделения, изучения и сохранения микроорганизмов. При составлении искусственных питательных сред учитывают как потребности микроорганизмов в веществах, необходимых для жизни, так и физико-химические условия, в которых они могут осуществлять обмен между клеткой и средой.

Для обеспечения разнообразных типов метаболизма микроорганизмов питательные среды должны соответствовать следующим требованиям:

1. Они должны содержать все элементы, из которых строится клетка: макроэлементы (углерод, азот, кислород, сера, фосфор, калий, кальций, магний, железо) и микроэлементы (марганец, молибден, цинк, медь, кобальт, никель, ванадий, хлор, натрий, кремний и др.). Все элементы должны находиться в удобоусвояемых конкретным микроорганизмом соединениях. Источником углерода могут быть разнообразные органические соединения: углеводы, многоатомные спирты, органические кислоты, аминокислоты, белки и др. Источником азота служат аммонийные соединения, аминокислоты, пептиды, белки. Источником остальных макроэлементов являются неорганические соединения – соли фосфорной и других кислот. Микроэлементы поступают в питательную среду с органическими субстратами, солями и водой. Витамины (особенно группы В) и другие факторы роста вносят в среду в составе органических субстратов или в виде чистых веществ.

2. Питательная среда должна иметь достаточную влажность (не менее 20 % воды).

3. Концентрация солей в среде должна обеспечивать изотонию, т. е. соответствовать концентрации солей в микробной клетке (для большинства микроорганизмов – 0,5 %; галофильных – 3 %).

4. Концентрация водородных ионов (рН) среды должна быть оптимальной для выращиваемого микроорганизма (диапазон рН 4,5 – 8,5).

5. Окислительно-восстановительный потенциал (Еh) среды должен соответствовать потребностям микроорганизма: для анаэробов 0,120 – 0,060 В, для аэробов – более 0,080 В.

6. Питательная среда должна быть стерильной.

По составу питательные среды могут быть синтетическими и натуральными. Питательные среды являются синтетическими, если содержат только химически чистые соединения в установленных дозировках, т. е. состав их полностью известен. Достоинством таких сред являются стандартность и воспроизводимость. Однако только для немногих патогенных бактерий имеются синтетические среды. Их применяют главным образом для экспериментального изучения метаболизма микробов.

Для практических исследований широко используют натуральные среды. Натуральные (естественные) питательные среды состоят из продуктов животного и растительного происхождения и имеют неопределенный химический состав.

Различают питательные среды общего назначения (универсальные) и специальные. Питательные среды общего назначения пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов и служат основой для приготовления специальных питательных сред. К ним относятся, например, мясопептонный бульон, мясопептонный агар, бульон Хоттингера, агар Хоттингера и др. Специальные питательные среды предназначены для избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, изучения их свойств и условий хранения.

Различают следующие виды специальных сред: элективные (избирательные), дифференциально-диагностические, консервирующие. Избирательность питательной среды для определенных видов микробов достигается путем создания для них оптимальных условий (рН, Еh, концентрация солей, состава питательных веществ), т. е. положительной селекцией, или путем добавления в среду веществ (желчи, азида натрия, теллурита калия, антибиотиков и др. ), угнетающих другие микробы, т. е. отрицательной селекцией. Дифференцирующие свойства питательной среды создаются внесением субстрата, к которому определяется отношение микроба (например, сахаров, аминокислот и др.), соответствующих индикаторов (например, рН-индикаторов – бромтимолблау, фуксин; Еh-индикаторов).

По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими (0,2 – 0,7 % агара) и плотными (1,5 – 2 % агара). Сухие питательные среды, выпускаемые промышленностью, получают путем консервации сред.

Для обеспечения микрообъемной технологии биохимической идентификации микроорганизмов выпускаются коммерческие микротест-системы. Они представлены двумя группами, различающимися особенностями содержания субстрата реакции: 1) в питательной среде; 2) в шаблоне-носителе. Тест-системы первой группы содержат в микрообъемных лунках полистироловых пластин дегидрированные питательные среды, стабилизированные поливиниловым спиртом, например, API-20E, Enterotest 1 и 2, отечественные ПБДЕ и MMTE 1иЕ2.Тест-системы второй группы имеют субстрат и индикатор в бумажном или полимерном шаблоне-носителе, например, Micro-ID, Minitek.

Разработаны также тест-системы на основе жидких дифференциальных сред, которые можно изготавливать непосредственно в лабораториях. По результатам биохимических тестов устанавливается вид микроорганизма с помощью таблиц идентификации, аналитического каталога кодов или приборов автоматизированных микробиологических систем биохимической идентификации микроорганизмов. Ввиду ускорения исследования и высокой экономичности микрообъемные тест-системы находят широкое применение в работе лабораторий.

Для натуральных питательных сред используют животные, растительные и микробные продукты: мясо, рыбную муку, молоко, яйца, кровь, картофель, дрожжи и др. Из них готовят полуфабрикаты: настои и экстракты (мясная вода, дрожжевой экстракт), ферментативные и кислотные гидролизаты (пептон, перевар Хоттингера, перевар казеина и др.). Настои и экстракты являются источником факторов роста, гидролизаты – источником аминокислот и других органических питательных веществ.

В качестве уплотнителя питательных сред применяют агар-агар или желатин. Агар-агар – полисахарид, получаемый из морских водорослей. Он способен образовывать в воде гель, плавящийся при температуре 80 – 86 °C и застудневающий при температуре 40 – 45 °C; не расщепляется большинством микроорганизмов. Желатин – белок, получаемый из кожи и костей; желатиновый гель плавится при температуре 32 – 34 °C, застывает при 26 – 28 °C (т. е. при температуре инкубации 37 °C находится в жидком состоянии); расщепляется многими видами микроорганизмов. Поэтому желатин применяют редко.

При необходимости осветляют питательную среду, обрабатывая ее белком куриного яйца, сывороткой или путем осаждения. Разливают среду в колбы, флаконы, пробирки. Если среда подлежит стерилизации при температуре 120 °C, используют чистую нестерильную посуду, а если среда требует стерилизации текучим паром (100 °C) или при температуре 112 °C – стерильную. Закрывают посуду со средой ватномарлевыми пробками с бумажными колпачками. В зависимости от состава среды стерилизуют различными способами. Агаровые среды, не содержащие углеводов и нативного белка, а также синтетические среды стерилизуют в автоклаве при температуре 115 – 120 °C в течение 15 – 20 мин. Среды, содержащие углеводы, молоко, желатин, стерилизуют текучим паром (100 °C) дробно или в автоклаве при температуре 112 °C в течение 15 мин. Среды, содержащие нативный белок, мочевину, стерилизуют фильтрованием или добавляют стерильные компоненты (кровь, сыворотку и др.) в стерильную основу среды. Готовые стерильные питательные среды подвергают контролю на стерильность путем выдерживания в термостате при температуре 37 °C в течение 1 – 3 сут.

Можно готовить питательные среды из сухих (консервированных) порошков. Навеску сухой среды, указанную на этикетке, погружают в дистиллированную или водопроводную воду и кипятят до полного растворения порошка. Затем разливают среду в стерильные колбы, пробирки и стерилизуют. Некоторые среды (например, Эндо, Плоскирева, Левина) можно использовать без стерилизации.

Бактериологическому контролю подлежат все питательные среды промышленного производства и все среды, приготовленные в лаборатории. В качестве тест-культур используют типовые или местные штаммы бактерий, типичные по всем признакам, в гладкой форме. Определяют следующие биологические показатели питательной среды: чувствительность (ростовую), ингибирующие свойства, дифференцирующие свойства, скорость роста бактерий на среде, воспроизводимость.

Чувствительность питательной среды устанавливают исходя из минимального количества колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий, обеспечивающих появление роста колоний на среде, или по максимальному десятикратному разведению культуры из исходной концентрации 10 ед. мутности (по оптическому стандарту мутности Государственного контрольного института им. Л. А. Тарасевича), обеспечивающему появление роста бактерий на всех засеянных чашках Петри. Ингибирующие свойства среды оценивают как степень подавления прочей микрофлоры по величине посевной дозы в КОЕ, полностью подавляемой на среде, или по отношению количества выросших колоний бактерий к расчетному количеству посеянных бактерий.