Текст книги "Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований"

Дифференцирующие свойства сред изучают путем посева испытуемых видов бактерий в смеси с другими видами с последующим определением четкости дифференциации колоний искомых бактерий. Специфичность дифференцирующего свойства среды выявляют по отсутствию этого свойства у прочих видов бактерий. Скорость роста бактерий (в часах) на среде устанавливают по минимальному времени инкубации посевов, в течение которого обеспечивается четкий, видимый невооруженным глазом рост культуры (для селективных сред) или формирование колоний с типичными дифференциальными признаками. Воспроизводимость биологических показателей сред оценивают по частоте одинаковых результатов (%) при повторных использованиях сред с теми же штаммами бактерий. Контроль различных питательных сред по биологическим показателям проводят по конкретным методикам и нормативам, руководствуясь официальными документами.

Физико-химический контроль питательных сред в лабораториях осуществляют по показателям рН, rH и содержанию аминного азота. Прочие показатели изучают обычно при промышленном производстве питательных сред. Для определения рН и rH сред используют рН-метры, индикаторные бумажки, а также различные химические индикаторы рН и rН, вносимые в питательные среды. Содержание аминного азота изучают методом рН-метрического формолового титрования питательных сред по ГОСТу.

Изучение биохимических свойств выделенных микроорганизмов проводят на третьем этапе. Культуру микроорганизмов, выросшую на скошенном агаре, проверяют на чистоту путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. При этом обращают внимание на форму микроба, величину, расположение клетки. Используя специальное окрашивание выявляют споры, капсулы, включения и жгутики.

Для идентификации культур, т. е. установления вида и типа бактерий, помимо морфологических и культуральных изучают биохимические, антигенные и другие свойства.

Биологические особенности облигатных анаэробов обусловливают необходимость применения специальных методов их культивирования, отличающихся от используемых при работе с аэробными и факультативно-анаэробными микроорганизмами.

Важным условием, которое необходимо соблюдать на всех этапах выделения и идентификации анаэробов, является защита этих микроорганизмов от токсического действия молекулярного кислорода. Время между взятием материала и его посевом на питательные среды должно быть максимально коротким. Для защиты содержащихся в патологическом материале облигатных анаэробов от воздействия атмосферного кислорода используют специальные транспортные среды.

Анаэробные бактерии можно культивировать только на специальных бескислородных питательных средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом (10 – 150 мВ). Для контроля за степенью насыщения этих сред кислородом используют специальные редокс-индикаторы (метиленовый синий, резазурин), восстановленные формы которых бесцветны. При возрастании окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) метиленовый синий окрашивает среды в синий, а резазурин – в розовый цвет, что указывает на непригодность таких питательных сред для культивирования облигатных анаэробов.

Для сохранения низкого ОВП питательные среды должны быть агаризованы. Добавление даже 0,05 %-ного агара повышает их вязкость и уменьшает аэрацию. Для роста облигатно-анаэробных бактерий необходимо использовать только плотные свежеприготовленные питательные среды (не позднее двух часов после приготовления) или прередуцированные (выдержанные в анаэростате не менее суток). Для успешного выращивания анаэробов требуется внесение большого количества посевного материала, в связи с тем что большие концентрации облигатных анаэробов способны быстрее уменьшать ОВП среды и тем самым создавать благоприятные условия для своего роста.

Анаэробный тип дыхания во много раз менее продуктивен, чем аэробный, поэтому питательные среды для анаэробов должны быть более насыщены питательными субстратами и витаминами. В качестве питательной основы они содержат различные экстракты и белковые гидролизаты (сердечно-мозговой и печеночный настои, дрожжевой и соевый экстракты, пептон, триптон, гидролитический перевар казеина и др.), а также гемин, менадион, твин-80, сукцинат натрия, цельную или лизированную кровь. Для выделения различных анаэробов из смеси культур к питательным основам добавляют желчь, азид натрия, антибиотики, налидиксовую кислоту, малахитовый зеленый и другие ингредиенты. В лабораториях для выделения анаэробов из патологического материала чаще всего используют среду для контроля стерильности (СКС), СКС-199, среду Китта – Тароцци, анаэробный кровяной агар (на основе эритрит-агара или агара Д), среду Вильсона – Блера и некоторые другие с соответствующими добавками.

Необходимым условием культивирования анаэробных бактерий является создание анаэробных условий, что достигается с помощью физических, химических, биологических и смешанных методов.

Физические методы

1. Для удаления растворенного в питательных средах кислорода производят регенерацию этих сред путем кипячения в течение 15 – 20 мин на водяной бане. Затем среды быстро охлаждают до 45 – 50 °C.

После посева для предотвращения проникновения кислорода в жидкую питательную среду ее поверхность заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином.

2. Посев содержащего анаэробы патологического материала в высокий столбик плотной или полужидкой питательной среды, которая разливается в пробирки в объеме 10 – 12 мл. Кислород воздуха диффундирует обычно на расстояние 1,5 – 2,0 см от поверхности, а в глубине создаются благоприятные условия для роста облигатных анаэробов.

3. Эвакуационно-заместительный метод заключается в удалении воздуха из герметически закрытых сосудов (анаэростатов, анаэробных боксов) с помощью вакуумного насоса с последующей заменой его инертным газом (азотом, аргоном, гелием) или бескислородной газовой смесью, состоящей из 80 % азота, 10 % двуокиси углерода и 10 % водорода. В ряде случаев используют природный (магистральный) газ. Для поглощения остатков кислорода из газовой смеси применяют палладиевый катализатор. Для поглощения водяных паров на дно анаэростата помещают хлористый кальций, силикагель или хлористый натрий.

Химические методы

1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде. Для поглощения кислорода используют смесь раствора пирогаллола и насыщенного раствора карбоната натрия (Nа₂CO₃).

2. Для поглощения кислорода из замкнутого пространства можно применять гидросульфит натрия.

3. Для связывания остатков кислорода в предназначенных для роста анаэробов питательных средах используют вещества-редуценты, к которым относятся тиогликолевая кислота или тиогликолат натрия, аскорбиновая кислота, различные сахара, цистин и цистеин, муравьинокислый натрий и др.

4. Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий в замкнутой воздушной среде (микроанаэростатах, эксикаторах, прозрачных газонепроницаемых пластиковых пакетах).

Для образования водорода и двуокиси углерода, необходимых для роста облигатных анаэробов, используют специальные таблетки, которые активируются добавлением воды. Водород, генерируемый таблетками боргидрида натрия, связывает кислород воздуха в присутствии палладиевого катализатора с образованием воды. Углекислый газ вырабатывается при взаимодействии лимонной кислоты с бикарбонатом натрия. Этот метод особенно удобен при работе в полевых условиях.

Биологические методы

1. Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). На одну половину чашки Петри с плотной питательной средой засевают исследуемый материал, а на другую – культуру аэробного или факультативно-анаэробного микроорганизма, способного энергично поглощать кислород. После посева чашку закрывают крышкой, края которой для герметизации заливают парафином или заклеивают пластилином. В качестве активного поглотителя кислорода из замкнутого пространства часто используют культуру Serratia marcescens, которая является своеобразным индикатором качества анаэробиоза. При недостаточной герметизации чашки этот микроорганизм образует ярко-красный пигмент, а при сохранении строго анаэробных условий вырастают бесцветные или бледно-розовые колонии.

2. Помещение в питательную среду кусочков печени, головного мозга, почек и других внутренних органов. При этом тканевые клетки активно поглощают и адсорбируют на себе кислород, в результате чего в среде создаются анаэробные условия. Примером питательной среды, сконструированной по этому принципу, является содержащая кусочки печени среда Китта – Тароцци. К тому же в печеночной ткани содержится большое количество веществ с SH-группой (цистеин, глютатион и др.), обладающих сильным редуцирующим действием.

Смешанные методы

В большинстве практических лабораторий применяют смешанные методы создания анаэробных условий. Для работы с наиболее чувствительными к молекулярному кислороду анаэробами используют строгую анаэробную технику (метод Хангейта). Метод основан на создании лишенных кислорода питательных сред, воздух над которыми удаляется и замещается бескислородным газом.

Для предотвращения попадания кислорода сосуды с питательными средами закрывают резиновыми пробками. Во время инокуляции анаэробиоз поддерживается за счет постоянного омывания сред потоком бескислородного газа.

1. Метод Цейсслера. Исследуемый материал рассевают штрихами по поверхности плотной питательной среды, помещают в анаэробные условия и выдерживают в термостате при температуре 37 °C в течение 24 – 72 ч. Изолированные колонии анаэробов пересевают в среду для контроля стерильности (СКС) или среду Китта – Тароцци.

2. Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 0,9 % раствором хлористого натрия, перемешивают и переносят в пробирку с охлажденным сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания последовательно засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают под струей холодной воды. Выросшие через 24 – 72 ч в глубине агара изолированные колонии анаэробов засевают в среду Китта – Тароцци или СКС.

3. Метод Вейона – Виньяля. Готовят разведения исследуемого материала в пробирках с сахарным агаром. Из каждой пробирки разведенный материал насасывают в пастеровские пипетки и запаивают их концы. После получения микробного роста пипетку надпиливают в соответствующем месте, разламывают с соблюдением правил стерильности и переносят изолированную колонию в среду Китта – Тароцци или СКС.

4. Метод Перетца. Готовят разведения исследуемого материала. Содержимое пробирки с соответствующим разведением выливают в стерильную чашку Петри, на дне которой на двух стеклянных или деревянных палочках лежит стеклянная пластинка. Среду заливают сбоку таким образом, чтобы она заполнила все пространство между пластинкой и дном чашки Петри. При появлении микробного роста стеклянную пластинку удаляют, а изолированную колонию засевают в пробирку со средой Китта – Тароцци или СКС для получения чистой культуры.

Наиболее простой и удобной разновидностью метода Перетца является метод «перевернутых чашек». При этом каждое разведение исследуемого материала в пробирке с сахарным агаром заливают в крышку чашки Петри и закрывают ее стерильным донышком чашки, избегая образования пузырей воздуха. Щель между краями крышки и дном чашки Петри заливают расплавленным парафином. Термостатируют при температуре 37 °C до появления изолированных колоний анаэробов.

Биологическими называются методы исследований, проводимых на лабораторных животных. Они дополняют и углубляют данные микробиологического исследования. Целью этих исследований является выделение микроорганизмов из исходного материала, в том числе и загрязненного другими микроорганизмами, а также в тех случаях, когда возбудитель не может быть обнаружен методом посева, например при вирусных и риккетсиозных заболеваниях.

На лабораторных животных определяют вирулентность и токсигенность микроорганизмов, воспроизводят характерную клиническую картину (столбняк), изучают вопросы иммунитета, эффективность биологических и антибактериальных препаратов, получают иммунные сыворотки.

Их используют для выделения вирусов, не вызывающих развития цитопатических изменений в культурах клеток и не размножающихся в куриных эмбрионах: некоторых арбовирусов, вирусов бешенства, ящура, лимфоцитарного хориоменингита и др. Применение лабораторных животных позволяет также по клиническому симптомокомплексу идентифицировать характер вирусной инфекции, ставить реакцию нейтрализации, путем пассажей поддерживать лабораторные штаммы вирусов, сохранять антигенные свойства и активность вирусов, изучать в эксперименте течение вирусной инфекции, получать диагностические и лечебно-профилактические вирусные препараты.

Микробиологические исследования чаще всего проводят на белых мышах, морских свинках и кроликах. Для иммунизации в лабораторных исследованиях используют крыс и кроликов, а на производстве – лошадей, баранов и свиней. Некоторые специальные исследования проводят на кошках, мелком и крупном рогатом скоте и крысах. Из птиц используют кур, гусей, уток. В последние годы чаще применяют новорожденных животных (они более чувствительны к вирусам), «стерильных животных» (извлекают из матки и содержат в стерильных условиях с использованием стерильного воздуха и стерилизованного корма) и животных чистых линий с известной наследственностью (инбредных или линейных).

Имеет значение также вид животного, порода, возраст, масса, пол, упитанность, условия содержания. В опыт берут животных одного вида и возраста и содержат их в одинаковых условиях. Иногда используют разные виды животных, обладающих различной чувствительностью к одному и тому же вирусу, что помогает выявить разнообразные формы инфекции.

Для эксперимента берут только здоровых животных, лучше из одного питомника и одной партии. Температуру тела измеряют в одно и то же время, так как имеются ее суточные колебания. Исследуемый материал вводят с учетом тропизма вирусов к определенным тканям. Так, для выделения нейротропных вирусов материал вводят в мозг, для выделения пневмотропных – через нос (под легким эфирным наркозом).

У лабораторных животных после заражения инфекционным материалом важно своевременно и правильно взять материал для дальнейшего исследования, причем асептически. Результаты выделения вируса считают положительными, если у животного после соответствующего инкубационного периода развиваются симптомы инфекции.

Рис. 28. Внутрибрюшинное заражение белой мыши (по: Лабинская А. С., 1973)

При выборе лабораторного животного необходимо учитывать степень его восприимчивости к изучаемому возбудителю. Так, например, морские свинки восприимчивы к туберкулезу, дифтерии, чуме, сибирской язве; мыши – к туляремии, чуме, ботулизму, столбняку, газовой гангрене и т. д. Каждое лабораторное животное, взятое в опыт, маркируют.

Животных перед опытом необходимо зафиксировать и обязательно обезболить. Для обезболивания чаще всего применяют эфирный наркоз. Для этого морских свинок и мышей помещают на короткое время в закрытую стеклянную банку, на дно которой кладут кусочек ваты, смоченный эфиром. Животным более крупных видов накладывают на мордочку маску с эфиром.

При введении материала в вену кролика или взятии крови животное помещают в специальный деревянный ящик, в передней стенке которого имеется регулируемое отверстие для головы. Можно также запеленать кролика в полотенце, предварительно подогнув лапы к животу.

Способы введения исследуемого материала животным могут быть следующими: подкожный, внутрикожный, накожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, пероральный (через рот), интраназальный (через нос), интрацеребральный (в мозг) и др. Чаще всего в практической микробиологии используется внутрибрюшинный способ заражения (рис. 28).

Действие протеолитических ферментов, т. е. способность микроорганизмов расщеплять белки, изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. При посеве уколом в столбик желатиновой среды микробы, разлагающие желатин, разжижают среду. Действие микроорганизмов, разлагающих казеин (молочный белок), проявляется в пептонизации (просветлении) молока, которое приобретает вид молочной сыворотки.

В процессе ферментации пептонов микроорганизмами образуются индол (C₈Н₇N), сероводород (Н₂S), аммиак (NH₃) и другие соединения.

Способность микроорганизмов разлагать сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты, а иногда и газа изучают на средах Гисса. В состав этих сред входят пептонная вода, углевод (моносахариды – глюкоза, ксилоза, арабиноза; полисахариды – крахмал, гликоген), многоатомные спирты (глицерин, маннит, сорбит, инозит) и индикатор. Под действием образующейся при разложении углевода кислоты индикатор изменяет окраску среды («пестрый ряд»). Газообразование определяется по наличию пузырьков газа в толщине полужидких сред или, если среда жидкая, в поплавке (стеклянной трубочке, верхний конец которой запаян).

Сахаролитические свойства изучают и на таких средах, как Эндо, Левина, Плоскирева. В их состав входит молочный сахар – лактоза; при разложении его микроорганизмами до кислоты цвет колонии изменяется соответственно индикатору, находящемуся в среде.

Биохимическая активность микроорганизмов обусловлена их ферментативной деятельностью. Ферменты микроорганизмов являются биологическими катализаторами, определяющими метаболические процессы, протекающие в микробных клетках. Разные виды микроорганизмов нередко отличаются по набору ферментов, которые они способны синтезировать.

Плазмокоагулаза выявляется в пробирочном опыте по определению скорости свертывания испытуемым микробом цитратной кроличьей или человеческой плазмы.

Гемотоксин вызывает лизис эритроцитов. Определяется при посеве испытуемых микробов на кровяной агар. Вокруг колонии наблюдается зона просветления среды.

Лецитиназа разрушает лецитовителлин яичного желтка. Обнаруживается при посеве испытуемых микробов на желточно-солевой агар (ЖСА) по образованию вокруг колоний зоны помутнения с радужным венчиком.

Гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав соединительной ткани. В пробирку с испытуемой культурой внести гиалуроновую кислоту и после 30-минутной экспозиции при температуре 37 °C добавить две капли крепкой уксусной кислоты. При наличии фермента гиалуроновая кислота утрачивает способность образовывать сгусток.

Фибринолизин растворяет фибрин плазмы крови, добавленной к питательной среде.

Учитывая высокую фенотипическую изменчивость бактерий, необходимо использовать для идентификации стандартизованные методики тестов. Желательно использование минимального числа наиболее важных и легко выполнимых тестов. Вначале используют тесты, определяющие принадлежность бактерий к определенному отделу и группе по «Определителю бактерий Берджи», например, морфология, окраска по Граму, подвижность, наличие спор, отношение к кислороду и т. д. Затем применяют наиболее важные тесты, характеризующие предполагаемый таксон (род, вид).

Для идентификации бактерий наиболее важно определение их биохимических признаков, которые устанавливаются преимущественно с помощью микрообъемной технологии с использованием соответствующих таксону коммерческих тест-систем или приборов автоматических систем идентификации. Для идентификации также широко используют серологические реакции, направленные на выявление антигенов бактерий и их таксонов.

Совокупность полученной информации о свойствах бактерий сопоставляют с характеристикой определенных таксонов в «Определителе бактерий Берджи» или других руководствах и дают заключение о таксономическом положении бактерий.

В последние годы все шире применяются методы геноиндикации микроорганизмов, которые не требуют выделения чистых культур: метод ДНК-зондов, полимеразная цепная реакция (ПЦР) со специфическими праймерами.

В отличие от бактерий вирусы размножаются лишь в живых клетках. В связи с этим культивирование вирусов может осуществляться на уровне организма подопытного животного (куриный эмбрион как развивающийся организм относят к подопытным животным) или живой клетки, выращиваемой вне организма, т. е. на уровне культуры клеток.

В тканях куриного эмбриона, его оболочках, желточном мешке способны размножаться многие патогенные вирусы человека и животных. При этом имеет место избирательность вирусов к той или иной ткани: вирусы группы оспы хорошо репродуцируются и накапливаются в клетках хорион-аллантоисной оболочки, вирус паротита – в амнионе, вирусы гриппа – в амнионе и аллантоисе, вирус бешенства – в желточном мешке.

Культивирование вирусов в развивающихся эмбрионах имеет ряд преимуществ перед другими методами: плотная скорлупа довольно надежно защищает внутреннее содержимое от микроорганизмов; эмбрионы восприимчивы ко многим группам вирусов; при заражении куриных эмбрионов получают больший, чем при других методах культивирования, выход вируссодержащего материала; метод заражения куриных эмбрионов прост и доступен любым вирусологическим лабораториям; эмбрионы обладают достаточной жизнеспособностью и устойчивостью к возбудителям внешних факторов.

Однако куриные эмбрионы не всегда свободны от латентных вирусных и бактериальных инфекций. Трудно наблюдать за динамикой патологических изменений, происходящих в эмбрионе после заражения его вирусом. При вскрытии зараженных эмбрионов часто не обнаруживают видимых изменений и выявляют вирус с помощью реакции гемагглютинации и другими методами. В зараженных эмбрионах невозможно проследить за нарастанием титра антител, поэтому данный метод пригоден не для всех вирусов.

Для вирусологических исследований используют эмбрионы 7 – 12-дневного возраста, которые получают из птицеводческих хозяйств. Можно выращивать эмбрионы в обычном термостате, на дно которого ставят лотки с водой для увлажнения воздуха. Температура в термостате должна быть 37 °C, а влажность воздуха – 60 – 65 %. Отбирают крупные, чистые (но немытые), оплодотворенные яйца от белых кур, хранившиеся не более 10 сут. при температуре 5 – 10 °C. Оплодотворенные яйца распознают по наличию зародышевого диска, который при просвечивании с помощью овоскопа имеет вид темного пятнышка.

При работе с вирусами могут быть использованы различные методы заражения эмбрионов, но наибольшее практическое применение получили нанесение вируса на хорион-аллантоисную оболочку, введение в аллантоисную, амниотическую полость и желточный мешок. Выбор метода зависит от биологических свойств изучаемого вируса.

Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона на овоскопе. Живые эмбрионы подвижны, хорошо видна пульсация сосудов оболочек.

При овоскопировании отмечают простым карандашом на скорлупе границы воздушного мешка или место расположения эмбриона, которое определяют по его тени на скорлупе.

Рис. 29. Строение куриного эмбриона (по: Лебедева М. Н., 1973)

Куриные эмбрионы заражают в боксе в строго асептических условиях, используя инструменты, стерилизованные кипячением. При заражении на хорион-аллантоисную оболочку наиболее пригодны 12-дневные эмбрионы (рис. 29). Для заражения в аллантоисную полость используют эмбрионы 10 – 11-дневного возраста, в амниотическую полость – эмбрионы 7 – 11-дневного возраста, в желточный мешок – эмбрионы 7-дневного возраста.

Яйца с зараженными эмбрионами устанавливают на подставках тупым концом вверх. Температурный режим и срок инкубации зависят от биологических свойств инокулированного вируса. Ежедневно жизнеспособность эмбрионов контролируют под овоскопом. Эмбрионы, погибшие в первые сутки после заражения вследствие травмы, не исследуют.

Перед сбором материала эмбрионы охлаждают при температуре 4 °C в течение 18 – 20 ч для сужения сосудов и предотвращения кровотечения при вскрытии. Вскрывают их в боксе с соблюдением правил асептики.

Аллантоисную жидкость насасывают пипеткой, контролируют стерильность путем посева в сахарный или мясо-пептонный бульон, проверяют на наличие вируса в реакции гемагглютинации и хранят при температуре –4 °C (в замороженном состоянии).

Для получения амниотической жидкости вначале отсасывают аллантоисную жидкость, затем пинцетом захватывают амниотическую оболочку, слегка приподнимают ее и пастеровской пипеткой отсасывают амниотическую жидкость.

При изучении изменений на хорион-аллантоисной оболочке ее разрезают ножницами и через отверстие выливают все содержимое в чашку Петри. Хорион-аллантоисная оболочка остается внутри скорлупы и ее извлекают пинцетом и помещают в чашку Петри с физиологическим раствором. Здесь ее промывают, расправляют и изучают на темном фоне характер очаговых поражений.

Для получения амниотической оболочки амниотический мешок, в который заключен эмбрион, разрезают и освобождают от эмбриона, просматривают на наличие поражений.

Для получения желточной оболочки разрезают хорион-аллантоис, отсасывают аллантоисную и амниотическую жидкости, извлекают пинцетом плод, отделяют его за пупочный канатик, захватывают желточный мешок и помещают в чашку Петри, затем контролируют на стерильность, просматривают на наличие поражений. Желток в случае необходимости его извлечения можно отсосать шприцем без выведения наружу желточного мешка.

Наличие вируса в аллантоисной и амниотической жидкостях зараженного эмбриона определяют с помощью реакции гемагглютинации. Жидкости эмбрионов с положительным результатом гемагглютинации после проверки на стерильность соединяют и титруют в развернутой реакции гемагглютинации.

При наличии небольшого количества вируса или невозможности выявить его в исследуемом материале проводят последовательные пассажи на куриных эмбрионах. Если после трех последующих пассажей на эмбрионах в исследуемом материале вирус не обнаруживают, результат считается отрицательным.

Культивирование клеток вне организма требует выполнения ряда условий. Одним из них является строгое соблюдение стерильности при работе, так как используемые питательные среды служат отличным питательным субстратом также для бактерий и грибов. Клетки тканей обладают весьма высокой чувствительностью к солям тяжелых металлов. Поэтому необходимо придавать исключительное значение качеству различных ингредиентов, входящих в состав солевых растворов и питательных сред, а также способам обработки посуды и резиновых пробок, применяемых при культивировании клеток.

Одним из обязательных условий успешной работы с клетками является высокое качество дистиллированной воды (проверяется два раза в неделю). Для работы с клетками используют бидистиллированную или деионизированную воду. Лучшими дистилляторами являются приборы из стекла или легированной стали. Из такой аппаратуры не вымываются ионы тяжелых металлов, являющихся токсичными для клеток. Деионизированную воду получают на специальных установках, где очистка воды от солей осуществляется при ее последовательном прохождении через колонки с анионитом и катионитом.

При культивировании клеток особенно большие требования предъявляются к подготовке и стерилизации посуды и пробок. Во многих случаях именно неправильные их мойка и стерилизация служат причиной неприкрепления клеток к стеклу или быстрой дегенерации клеточного монослоя.

Для роста и размножения клеток вне организма необходим сложный комплекс физико-химических факторов: определенная температура, концентрация водородных ионов, неорганические соединения, углеводы, аминокислоты, белки, витамины, кислород и углекислота, поэтому для культивирования вирусов в культурах клеток используют сложные по составу питательные среды. По характеру компонентов, входящих в их состав, эти среды делят на две группы.

1. Среды, представляющие собой смеси солевых растворов (Хенкса, Эрла и др.) и естественных компонентов (сыворотка крови животных и человека, гидролизат альбумина). Количество каждого из этих компонентов в разных прописях сред различно.

2. Синтетические и полусинтетические среды, состоящие из солевых растворов (Эрла, Хенкса и др.) с добавлением аминокислот, витаминов, коэнзимов и нуклеотидов (среды Игла, 199 и др.). В синтетических средах клетки могут существовать в жизнеспособном состоянии непродолжительное время (до 7 дней). Для более длительного поддержания их в жизнеспособном состоянии, а также для создания лучших условий роста и размножения клеток к синтетическим средам добавляют сыворотку крови животных (коров, телят и др.).

Для выделения вирусов могут быть использованы разные методы культивирования клеток вне организма. Однако в настоящее время наибольшее практическое применение получил метод с использованием однослойных культур первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток. Однослойные культуры клеток выращивают в стеклянных плоскостенных сосудах-матрацах вместимостью 1 л, 250 и 100 мл или в обычных бактериологических пробирках, обработанных соответствующим способом.

Сущность метода с использованием первично-трипсинизированных культур клеток заключается в разрушении межклеточных связей в тканях протеолитическими ферментами и разобщении клеток для выращивания монослоя на поверхности стекла. Источником получения клеток могут служить ткани и органы эмбрионов человека и животных, забитых животных и птиц, а также извлеченные у человека при операции. Используют нормальные и злокачественные ткани, эпителиальные, фибробластического типа и смешанные. Способность к размножению клеток, извлеченных из организма, тесно связана со степенью дифференциации ткани. Чем меньше дифференцирована ткань, тем более интенсивной способностью пролиферации обладают ее клетки in vitro. Поэтому клетки эмбриональных и опухолевых тканей значительно легче культивировать вне организма, чем нормальные клетки взрослых животных.

Таблица 6

Наиболее употребляемые культуры перевиваемых клеток

Культуры ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа для определения характера их роста. Если клетки не пролиферируют, выглядят округлыми, зернистыми, темными и отслаиваются от стекла, значит посуда плохо обработана или токсичны ингредиенты питательной среды.

Наряду с первично-трипсинизированными тканями для культивирования вирусов широко используют культуры перевиваемых клеток, т. е. культуры клеток, способных к размножению вне организма неопределенно длительное время. Наиболее часто применяют культуры клеток, полученные из нормальных и раковых тканей человека. Широкую известность приобрели линия клеток HeLa, полученная из опухоли шейки матки, Нер-2 – из карциономы гортани, КВ – из ткани рака полости рта. Готовят также культуры клеток и из нормальных тканей животных – почки обезьяны, кролика и эмбриона свиньи (табл. 6).