Текст книги "Геном человека: Энциклопедия, написанная четырьмя буквами"

Устройство концов хромосом давно интересовало исследователей. Теперь стало ясно, что они устроены по особому. И эту некоди–рующую белки ДНК никак нельзя назвать «эгоистичной». Концевой участок ДНК, называемый теломерным, представляет собой область размером 3—20 тыс. п. н., состоящую из тандемно расположенных повторов TTAГГГ (рис. 28). С этими участками образуют комплекс различные специфические белки, и такой комплекс получил название теломера.

Самый–самый (в данном случае левый) кончик хромосомы человека выглядит так:

ГГГАТТГГГАТТГГГАТТГГГАТТГГГАТТГГГАТТ…

ЦЦЦТААЦЦЦТААЦЦЦТААЦЦЦТААЦЦЦТАА…

То есть каждый том Энциклопедии человека начинается с буквы Г, и первые 6 букв – это однонитевая ДНК, а вовсе не двунитевая, какова она на всем дальнейшем протяжении. В английском языке с буквы Г (G) начинается слово Бог (God), и некоторые исследователи склонны видеть в этом некий глубокий смысл. При определенном желании, конечно же, можно найти много всяких аналогий, но эта – безусловно случайная.

Рис. 28. Структура концов ДНК в хромосомах—теломер

3а короткими повторами располагаются более длинные повторяющиеся последовательности, которые назвали повторами, ассоциированными с теломерой. Далее следуют уникальные для каждой хромосомы последовательности, которые на практике используются для различения разных концов разных хромосом. Теломеры защищают основную часть ДНК от действия ферментов, которые в отсутствие теломер разрушали бы молекулы ДНК. Кроме того, тело–меры способствуют правильной рекомбинации хромосом и их прикреплению к оболочке ядра.

Концевые участки хромосом не статичны. При каждом делении клеток происходит их укорочение в среднем на 50 п. н. Все известные ДНК–полимеразы, которые участвуют в процессе репликации ДНК, неспособны полностью реплицировать концы молекул. Поэтому каждая следующая копия короче предыдущей. Как если бы машинистка, перепечатывая книгу, всегда ленилась бы перепечатать последнюю страничку.

Чтобы не происходила потеря генетического материала при делении клеток, у эмбрионов концы молекул ДНК наращиваются перед каждой репликацией короткими повторяющимися последовательностями. В этом участвует специальный фермент – теломераза. Однако в клетках взрослого организма этот фермент перестает работать, и в результате хромосомы постоянно укорачиваются, съеживаются, как шагреневая кожа, при каждом цикле репликации ДНК. Так происходит до определенного предела, после чего деление клеток становится, по–видимому, невозможным и наступает их гибель.

На фоне всеобщей эйфории, связанной с секвенированием генома человека, мало внимания было обращено на то, что необходимо еще некоторое время для получения действительно полной последовательности нуклеотидов генома. На современной карте генома человека все еще зияет множество «белых пятен». В сумме они составляли на начало 2002 года всего около 3—5%, что вообще–то сопоставимо с долей генома, занимаемой всеми генами. Причина этого заключается в первую очередь в существовании серьезных технических трудностей при секвенировании и картировании отдельных специфических участков ДНК. Так, некоторые нуклеотидные последовательности обладают нестандартной структурой, что усложняет процесс их расшифровки стандартными методами. В частности, это относится к таким районам хромосом, как теломеры – концевые участки, которые имеют необычную структуру. Их порой трудно выделять из общей массы нуклеотидных последовательностей в силу того, что они расположены на концах молекул ДНК. Другие участки трудно идентифицировать в связи с тем, что они часто повторяются и их пока не удается «вписать» в общий текст, поскольку не ясно, где их истинное место. Эти участки порой так похожи друг на друга, что нелегко понять, где какой из них точно расположен («Фигаро здесь, Фигаро там»). Такая ситуация характерна в основном для центро–мерных областей хромосом, содержащих тандемные кластеры аль–фа–сателлитных последовательностей, и районов расположения микро–и минисателлитов. Имеются проблемы и с секвенированием коротких «плечей» некоторых хромосом. Однако если сравнить эти проблемы с начальными этапами работы, то они теперь сродни «семечкам», большинство из которых исследователи безусловно «отщелкают» в самое ближайшее время, возможно даже еще до выхода в свет этой книги.

ОПЕЧАТКИ В ДНКовом ТЕКСТЕ
(полиморфизм и мутации)

Изменчивость—источник всех отрад, суть музыки и вечности уклад.

Джон Донн

Как великий художник,

природа умеет и с небольшими средствами достигать великих эффектов.

Г. Гейне

Каждый человек уникален, следовательно, уникальным должен быть и его геном. По этой причине между любыми двумя людьми, если они не однояйцовые близнецы, всегда имеются значительные индивидуальные различия (их называют различиями в фенотипе). Они проявляются во многом, в частности, во внешности, в физических возможностях, в отношении предрасположенности к развитию определенных заболеваний, в реакции организма на воздействие факторов окружающей среды или лекарственных средств, в умственных способностях и поведении. Однако, как оказалось, из свыше 3,2 миллиардов генетических букв, из которых состоит ДНК человека, 99,9 процента одни и те же у всех людей. Выходит, что всего от одной десятой процента генома зависит, кто мы есть, – высокие или низкие, красивые или не очень, больные или здоровые, сильные или слабые, умные или глупые, оптимисты или пессимисты, добрые или, наоборот, жестокие и так далее.

Различия между нуклеотидными последовательностями ДНК разных индивидуумов связаны главным образом с тем, что за время длительной человеческой эволюции в нашем геноме накопилось довольно много случайных, вызванных разными причинами, изменений. Эти «опечатки» в ДНКовом тексте, которые каждому из нас достаются от двух родителей в случайном сочетании и наследуются, называют мутациями.

Очень трудно издать книгу (особенно если она большая по объему) без опечаток, хотя в процессе подготовки их тщательно отслеживают и автор, и редактор, и корректор. Известна старая история о споре двух издателей, когда один из них утверждал, что сумеет выпустить книгу без единой опечатки. И, действительно, при самой тщательной проверке в тексте этой книги опечаток не нашли. Но издатель проиграл спор: опечатка была в самом названии книги! И книга, которую сейчас читаете вы, наверняка будет содержать опечатки (хотелось бы только, чтобы их число было минимальным и чтобы их не было в названии).

Мутации в ДНК – естественные наследуемые изменения – опечатки в ДНКовом тексте. Каждый раз, когда клетка в очередной раз делится, необходимо выполнить грандиозную задачу – копировать свыше 3 млрд. букв. В клетке этим занимается целая армия специальных ферментов, которые выполняют свою гигантскую работу в среднем за один рабочий день (7 часов). При этом неправильные буквы первоначально возникают в 10000 участках нового ДНКового текста, а потом эти же ферменты, выступая уже в роли «корректоров», исправляют его. В конечном итоге при копировании ДНК остается только 1 ошибка на 10 млн. п. н. Из этого легко понять, что чем больше раз копируется (реплицируется) ДНК, тем больше в ней накапливается ошибок.

Изменения в структуре ДНК имеют разнообразный характер. В первую очередь это «точковые мутации». Такие мутации представляют собой опечатки в ДНКовом тексте, когда одна из 4 букв выпадает из текста или заменяется на какую–нибудь другую из них. В сумме эти опечатки в масштабах одного генома, как правило, невелики. (Уже говорилось, что мы в среднем отличаемся друг от друга приблизительно в одной позиции нуклеотидов из каждой тысячи). Это явление называют полиморфизмом генома. Отличие между мутациями и полиморфизмом достаточно условно. Когда один из вариантов нуклеотидных последовательностей определенного участка ДНК выявляется более чем у 1% людей в популяции, то такую вариабельность чаще всего называют полиморфизмом, если же менее 1% – просто мутацией.

Мутации могут быть простейшими заменами одного нуклеотида на другой, а могут представлять собой более сложные изменения ДНКового текста, в виде вставки в готовый текст других «букв» и текстов или, наоборот, потери ряда «букв», «слов» или целых «предложений». Изредка отдельные куски ДНКового текста даже переворачиваются. Все это и есть «опечатки». Однако опечатка опечатке рознь. Чаще всего мутации не сказываются заметным образом на фенотипе человека. Это и понятно. В абракадабре, которую из себя представляет свыше 70% ДНКового текста человека, появление 1—2 и даже порой сотни «опечаток» может ровным счетом ничего не менять. Но это не всегда так. Некоторые из них очень сильно влияют на человека.

Этому есть аналогия в лингвистике. Так, существуют слова–паронимы, которые сходны по строению, имеют общий корень, но смысл которых сильно отличается при разнице всего в одной букве. Пример: нового посетителя представляют гостям, но бывают нерадивые хозяева, которые предоставляют гостей самим себе.

Известно и множество случаев из жизни, которые свидетельствуют о важном значении некоторых на первый взгляд незначительных «опечаток». Яркий примером может служить судьба марок бывшей британской колонии – острова Маврикий. В давние времена на этом острове решили вдруг срочно отпечатать свои марки. На этом настояла жена губернатора, которая организовывала пышный прием, а вот марок для приглашений на острове не оказалось. Срочность заказа привела к тому, что гравер в спешке, да еще и спьяну перепутал надпись на марке и вместо «Почтовый сбор оплачен» написал «Почтовая контора». Теперь эти марки стоят у коллекционеров бешеных денег. Такова цена полиграфической опечатки.

Сходная ситуация имеется и в геноме человека. Некоторые «опечатки» в ДНКовом тексте, особенно расположенные в генах или непосредственно рядом с ними, весьма существенны для человека. В качестве примера можно привести широко известный случай одной из мутаций (делеция части ДНКового текста) в человеческом гене CCR5. Укороченный вариант этого гена обеспечивает невосприимчивость людей к вирусу иммунодефицита человека. В результате этого чума XX века – СПИД – таким людям не страшна. В Европе такой вариант довольно широко распространен и достигает в некоторых регионах 9%. А вот в Африке он обнаружен менее чем у 0,1% жителей.

Хотя известны различные виды генетического полиморфизма, однако полиморфизм единичных нуклеотидов является самым распространенным типом вариабельности нуклеотидных последовательностей ДНК. Более того, он оказался наиболее перспективным и для чисто практического применения. Сейчас подсчитано, что в геноме человека приблизительно 3 млн. п.н. должны быть вариабельными. Такие вариабельные (полиморфные) участки были названы снипсами (по–английски SNPs – от Singte Nucleotide Polymorphisms – единичные (сингулярные) нуклеотидные полиморфизмы). Термином «снипсы» обозначаются «точечные» отличия (полиморфизмы) в нуклеотидных последовательностях ДНК различных индивидуумов, вызванные заменой единичного химического звена ДНК—нук–леотида. Постараемся запомнить этот непривычный пока еще термин – далее это нам очень пригодится.

Уже в процессе секвенирования генома человека в 1999 г. был создан специиальный международный консорциум для идентификации и картирования только снипсов – «The SNP Consortium Ltd». Целью нового многосотмиллионного исследовательского проекта стало создание сводной карты, показывающей расположение в геноме человека этих «генетических маркеров». В настоящее время установлены 2,2 млн. снипсов (напомним, что общее их число считается равным 3 млн.). Поскольку гены могут содержать от тысячи до миллиона нуклеотидов, то практически в каждом гене или рядом с ним можно обнаружить один или несколько снипсов. Сейчас выявлено 33,5 тыс. снипсов, расположенных в экзонах, что примерно соответствует общему числу генов у человека. Следовательно, большая часть снипсов (около 99%) расположена в тех участках молекулы ДНК, которые не кодируют синтез белков. По этой причине, как правило, снипсы не имеют существенного биологического эффекта. Хотя это и не всегда так.

Изначально было ясно, что создание карты снипсов – маркеров человеческого генома может стать весьма полезным для проведения различных генетических исследований в медицине и фармакологии, даст ключ к пониманию уникальности личности, роли наследственности в интеллектуальных способностях и чертах характера. И снип–сы стали использовать, в первую очередь, в качестве генетических маркеров, поскольку пока нет возможности секвенировать целиком геном каждого индивидуума. Нет сомнения, что в обозримом будущем на этой основе станет возможным создание генетического паспорта каждого человека.

Когда такие опечатки в ДНКовом тексте, как снипсы, не меняют сильно сам текст, их называют нейтральными или «молчащими» мутациями. Однако имеются опечатки, которые так искажают «слова», что их уже невозможно прочесть. Их называют значащими, «говорящими» мутациями. Такие значащие мутации часто приводят к возникновению разнообразных наследственных болезней. Поскольку снипсы достаточно стабильно передаются от поколения к поколению, их можно использовать в качестве маркеров в генетических исследованиях по выявлению связи генов с теми или иными заболеваниями, по пониманию особенностей метаболизма лекарственных веществ у разных пациентов. Так, например, сравнивая «профиль» снипсов в группах больных и здоровых лиц, можно установить, какие

из них наблюдаются чаще у пациентов с данным заболеванием. Последующий анализ этих и соседних со снипсами участков ДНК дает возможность идентифицировать гены, которые обусловливают предрасположенность к заболеванию. Таким образом, применение этого метода позволяет ускорить поиск генов, ответственных за развитие заболеваний, сделав его более направленным. В частности, ученые компании «Glaxo Wellcome» уже использовали методику картирования снипсов для выявления генов, принимающих участие в развитии таких распространенных заболеваний, как сахарный диабет II типа, псориаз и мигрень.

Такой же подход можно использовать для выявления у пациентов особенностей метаболизма, распределения или выведения лекарственных средств, то есть для исследований по фармакогеноми–ке (подробнее об этом речь пойдет далее в специальном разделе). Врачи смогут использовать данные генетических исследований для обоснования индивидуального подхода при назначении лекарственных средств, что значительно снизит риск развития побочных реакций. Хотя перспективность такого подхода очевидна, подробная карта снипсов–маркеров пока еще не составлена. Но работа в этом направлении идет очень активно. Составление таких карт человеческого генома сделает в конечном итоге технически возможным проведение быстрого и относительно недорогого генотипирования большого количества пациентов.

Поскольку снипсов в геноме человека довольно много, то было предложено изучать их не только по отдельности, но и группами, в которые объединяются снипсы, расположеные относительно рядом в геноме. Такие наследуемые вместе группы снипсов получили название гаплотипов. Проведенный анализ показал, что число гапло–типов для каждого гена сильно варьирует и может составлять от 2 до 53 (в среднем, по разным оценкам, – от 4 до 14). Было проведено сравнение таких гаплотипов у 21 белого человека, 20 афроамерикан–цев, 20 человек азиатского происхождения, 18 латиноамериканцев и 3 американских индейцев. В результате не удалось обнаружить вариантов гаплотипов, характерных для той или иной этнической группы. Вместе с тем некоторые варианты чаще встречались у людей, которые родом из одного географического региона.

По оценке ученых компании Genaissance Pharmaceuticals в среднем существует 14 вариаций каждого человеческого гена. Ученые проанализировали 313 генов у большого числа американцев, относящихся к 4 расам. Если в геноме человека присутствует примерно 35 тысяч человеческих генов, следовательно, имеется от 400 до 500 тысяч их вариаций. Обнаружение столь большой амплитуды генетических изменений может потребовать пересмотра традиционных представлений о геноме человека. Сейчас планируется создание каталога гап–лотипов каждого человеческого гена. Для этого потребуется проанализировать ДНК у тысяч представителей разных континентов нашей планеты.

Далее мы еще вернемся к вопросу о важности снипсов, когда будем говорить о практических применениях знаний о геноме человека для медицинской геномики и фармакогеномики. Помимо высокой плотности, снипсы имеют очень низкий уровень мутаций на поколение (~10 ^–8 ), что делает их удобными маркерами для анализа молекулярной эволюции (далее мы поговорим о «молекулярных часах», которые эффективно используются генетиками в геногеогра–фии и эволюционной геномике).

Другой вид полиморфизма генома человека связан с повышенной нестабильностью таких уже упоминавшихся повторов генома, как мини–и микросателлиты. Эта нестабильность проявляется в разном числе повторяющихся элементов в отдельных локусах у разных индивидуумов и приводит к сильному полиморфизму. Уровни нестабильности таких тандемно расположенных повторов значительно отличаются в разных локусах. Особое внимание привлекают к себе гипермутабельные сателлиты. В частности, нестабильность ди–и тринуклеотидных минисателлитов обуславливает так называемые динамические мутации, при которых увеличение числа копий повторяющихся элементов (экспансия) выше некого критического уровня приводит к опухолевому росту клеток и развитию некоторых наследственных нейромышечных заболеваний (миото–ническая дистрофия, хорея Хантингтона, болезнь Кеннеди и др.). В результате экспансии число повторяющихся элементов в одном локусе может достигать нескольких тысяч. Например, число три–нуклеотидных повторов ЦТГ в гене миотонинпротеинкиназы в норме не превышает 27, а при развитии миотонической дистрофии это число увеличивается обычно в тысячу и более раз. Причины такой нестабильности пока до конца не ясны. Как наиболее вероятный механизм этого явления – «проскальзывание» в ходе репликации ДНК.

Сильная изменчивость мини–и микросаттелитов нашла практическое применение и в так называемой геномной дактилоскопии. Наиболее известный пример ее использования – идентификация останков царской семьи. Подробнее об этом опять же поговорим дальше в специальном разделе.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ЧАСЫ

Вы говорите – время идет.

Безумцы – это вы проходите.

Талмуд

Достаточно твердо установлено, что большинство из происходящих точечных мутаций в геноме не представляются ни полезными, ни вредными для человека, то есть являются нейтральными. Скачки скорее всего не свойственны эволюции. Частоты возникновения точечных мутаций невысоки (порядка 10 ^–8 на генерацию) и относительно постоянны. Расчеты показывают, что при размере диплоидного генома человека около 7х10 ⁹ п. н. в нем происходит в среднем 175 новых мутаций на генерацию (25 лет). Накопление мутаций можно сравнить с перетеканием песчинок в песочных часах, которые служат мерой времени. Но на практике ученые применили не песочные, а «молекулярные часы». Поскольку большинство мутаций никак не сказываются на самом организме, они могут спокойно сохраняться в эволюции на протяжении длительного времени. Именно за эти факты и ухватились ученые, когда создавали новый подход, названный «молекулярными часами».

На первом этапе была проведена «юстировка» этих часов. Для этой цели были использованы данные о скорости изменения ДНК разных видов организмов, для которых время расхождения в эволюции было надежно установлено по палеонтологическим и археологическим данным. И только после этого началось «чтение» разных эволюционных глав Энциклопедии человека.

«Молекулярные часы» довольно строго показывают, как часто за миллион лет (в среднем) в ДНК того или иного гена или генома в целом происходят мутации. На этой основе по различиям в ДНК можно судить о том, как давно два разных вида организмов, время возникновения которых не известно, были одним видом, когда произошла их дивергенция, то есть расхождение на две разные ветви эволюции. Таким же путем можно сравнивать человеческие популяции или даже ДНК отдельных людей и судить об общности их происхождения или родственных связях. В частности, по «молекулярным часам» удалось оценить более точно время отделения человека от обезьян. Согласно молекулярной оценке, это произошло примерно 5 млн. лет назад. Это внесло существенную поправку в данные палеонтологов, которые долгое время полагали, что разделение человека и обезьян произошло около 25 млн. лет назад. Массовый анализ митДНК из разных рас показал, что одни митДНК отличаются от других числом замен одних нуклеотидов другими, то есть числом мутаций. Были определены такие показатели, как количество индивидуальных мутаций, их расположение и тип. Эти получившие широкую известность данные выявили общность происхождения всех ныне живущих людей по женской линии. Если читатель не прекратит знакомство с книгой в этом месте, то более подробный рассказ об этих интереснейших исследованиях он найдет далее.

Метод «молекулярных часов», применяемый к ДНКовым текстам, очень похож по своему смыслу на метод глоттохронологии, используемый в лингвистике при установлении родства разных языков. Это специальный статистический метод определения возраста родственных языков, т. е. давности их разделения, по количеству слов, имеющих в этих языках одинаковое происхождение. Ведь язык человека, как и геном человека, все время меняется. Если племя или народ, говорящий на одном языке, по какой–то причине разделится на две части, которые потеряют связь между собой, то язык, как и геном, каждого из этих двух новых племен или народов будет меняться по–своему. Чем больше времени пройдет после разделения двух народов, тем меньше общего сохранится в их языках и геномах, но они по–прежнему останутся родственными. По степени сходства можно судить о том, когда произошло разделение. Лингвисты установили, что за 1000 лет в так называемом базовом словаре (он включает те слова, которые есть в любом языке, – «дом», «земля», «небо», названия частей тела и т. д.) сохраняется 86% слов, т. е. каждый из языков двух народов, обособившихся 1000 лет назад, имеет 86% общих слов с предковым языком. В результате, друг с другом эти языки имеют 74% (86% от 86%) общих слов. При сопоставлении эволюционного древа популяций человека с лингвистическим анализом выяснилось, что в большинстве случаев языки генетически родственных популяций принадлежат к одной лингвистической группе. Вывод ученых гласит: чем раньше разделились две популяции, тем дольше они эволюционировали независимо и тем больше накопилось замен, как в их ДНК, так и в их языках. Конечно, языки напрямую не зависят от генов, и корреляции генетического и лингвистического родства определяются лишь историческими обстоятельствами. Но для нас важно, что здесь одно исследование довольно часто подтверждает другое.