Текст книги "Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре"

1.2 Трофические потребности ксилотрофных базидиомицетов в условиях чистой культуры

Культуры базидиомицетов, выделенные из естественных мест обитания и культивируемые затем в лабораториях, попадают при этом, как правило, в несвойственные для них условия существования. В лабораториях большинство микроорганизмов поддерживается и изучается в виде чистых культур, то есть в таком состоянии, в котором эти организмы природе никогда не встречаются. Развитие грибов в природном субстрате происходит зонами, микроколониями, в окружении организмов других видов. Многие клетки, споры вегетативного, бесполого и полового спороношения адсорбируются механическими частицами, находятся в иммобилизованном состоянии, обладая при этом свойствами, отличными от свободно живущих клеток. Отличие состоит также и в том, что при культивировании организмов в виде чистых культур исключается возможность влияния на них других организмов, не проявляется благоприятное или, наоборот, вредное действие продуктов жизнедеятельности других организмов, продуктов распада отмерших клеток других видов. В условиях лабораторного культивирования микроорганизмы нередко попадают в исключительно благоприятные условия питания; для них подбираются оптимальная температура развития, благоприятная для роста влажность, кислотность среды и другие факторы, которых организм обычно не имеет в естественных местах обитания.

Организмы, выделенные из природы и перенесенные в лабораторные условия, – это, по выражению Виноградского, «одомашненные, тепличные организмы» (Егоров, Самуилов, 1997; Егоров, 1988).

При культивировании грибов в лабораториях обычно имеет место развитие их в ограниченном пространстве. Все это способствует тому, что физиологическая деятельность микроорганизмов, находящихся в условиях лабораторного культивирования, значительно отличается от их деятельности при развитии, например, на древесном субстрате.

Таким образом, при лабораторном культивировании микроорганизмов на проявление их физиолого-биохимического потенциала могут влиять совершенно иные факторы, другие закономерности по сравнению с теми, которые имеют место в природе. Условия, искусственно создаваемые для развития организмов, можно легко контролировать, что позволяет определять роль и влияние отдельных факторов на рост, развитие изучаемого микроба и проявление им различных биохимических, в том числе и продукционных свойств.

К числу наиболее существенных факторов, оказывающих влияние на проявление ценных свойств микроорганизмов, реализацию их природного потенциала относятся состав среды, концентрация протонов водорода, редокс-потенциал, температура культивирования, методы совместного выращивания двух или большего числа видов микроорганизмов и другие факторы, иными словами, весь сложный комплекс условий культивирования микроорганизмов. При этом к важнейшим факторам, определяющим активность гетеротрофных организмов, следует отнести, прежде всего, наличие в среде элементов питания. Оптимальный состав питательной среды для каждого продуцента (биомассы или вторичных метаболитов) или коллекционной культуры может быть определен двумя способами: эмпирический и построение математической модели с использованием пакетов компьютерных программ. Последний способ, как наиболее объективный и статистически точный является более предпочтительным (Егоров, 1988). Основной принцип составления рецептур питательных сред – удовлетворение физиологических потребностей микроорганизмов. В каталогах культур и в определителях указаны эти потребности, а также оптимальные значения рН и температуры. Задача специалиста, оптимизирующего состав среды для конкретного штамма – продуцента целевого продукта, – выбрать из перечня источников углерода, азота, фосфора и других веществ наиболее оправданные в экономическом и экологическом отношении компоненты. С этой целью проводят лабораторные опыты, желательно с использованием методов математического планирования эксперимента. Отдельным, не менее важным вопросом является разработка питательных сред для коллекционных культур. Здесь требуется, с учетом индивидуальных особенностей сохраняемых культур, не только создать соответствующие условия температуры и влажности, способствующие замедлению процессов метаболизма, но подобрать «пролонгированные» источники питательных веществ, компоненты которых должны обеспечивать защиту от окислительного стресса и обеспечивать существование живой культуры в течение длительного времени (Ильин, Ильина, 2003).

В питании базидиальных грибов главную роль играют соединения, содержащие углерод, так как служат двум основным функциям в метаболизме этих организмов: снабжают собственно углеродом, необходимым для синтеза веществ живых клеток и участвуют в процессах окисления, где являются единственным источником энергии (Курсанов, 1940; Шиврина, 1965). Благодаря различной химической природе, благодаря неодинаковой степени окисленности, разные источники углерода сами по себе также оказывают существенное влияние на развитие микроорганизмов и, следовательно, на образование ими метаболитов.

Наилучшим образом роль различных источников углерода в качестве компонентов питательной среды освещена в применении к продуцентам антибиотиков. При этом многими исследователями выявлено, что тот или иной источник углерода способен обеспечить нормальный рост микроорганизма, но подавляет синтез антибиотика, другие – наоборот. Например, при развитии Penicillium chrysogenum (продуцента пенициллина) лактоза используется организмом медленнее, чем глюкоза, и это сказывается на выходе антибиотика. Если в среде в качестве источника углерода присутствует только глюкоза, то все обменные процессы, осуществляемые грибом, ускоряются. В этих условиях максимум образования пенициллина происходит приблизительно через 50 ч развития культуры, вследствие чего уровень биосинтеза антибиотика остается низким. В присутствии же лактозы максимум образования антибиотика происходит через 150 – 160 ч и это способствует повышению выхода пенициллина. Поэтому на практике для получения пенициллина обычно используют одновременно и глюкозу и лактозу, что обеспечивает хорошее развитие гриба и высокий уровень биосинтеза пенициллина.

К сожалению, таких данных, отражающих результаты исследований по значению различных источников азота для культур ксилотрофных базидиомицетов относительно немного. Без сомнения, высшие базидиомицеты, представляющие собой различные экологические группы, в природе сталкиваются с большим разнообразием углеводов, чаще всего с полимерными формами простых сахаров. В монографии А.С. Бухало (1988) сделан обзор зарубежных и отечественных исследований по вопросу предпочтений высшими базидиомицетами различных источников углерода при искусственном культивировании. Все источники свидетельствуют, что высшие базидиомицеты в культуре предпочитают сахара другим источникам углерода. Существует мнение, что глюкоза является универсальным источником углерода для всех высших базидиомицетов, хотя она и не всегда обеспечивает максимальный рост мицелия. Для большинства этих грибов таким же хорошим источником углерода, как глюкоза, служит фруктоза (Шиврина и др., 1969; Berry, 1975). Многие дереворазрушающие грибы из пентоз хорошо используют ксилозу, в то время как арабиноза утилизируется ими очень слабо (Fries, 1955; Worgan, 1968; Berry, 1975). Для многих базидиомицетов из спиртов пригодны маннит и глицерин (Шиврина и др., 1969; Бухало и др., 1972; Маслова, 1973; Berry, 1975; Gupta, Pathak, 1982). Всеми высшими базидиомицетами из дисахаридов потребляются мальтоза и целлобиоза. Сахароза не является универсальным источником углерода для этих грибов, а лактоза используется наименьшим количеством исследованных штаммов (Шиврина и др., 1969; Маслова, 1973; Johri, Brodie, 1972; Berry, 1975). Наилучшим источником углерода для ряда видов является крахмал (Fries, 1955; Worgan, 1968; Маслова, 1973; Sakamoto et al., 1978a, b). Для видов родов Tricholoma, Agaricus хорошим источником углерода служат пектиновые вещества, хуже усваиваются декстрины (Treschov, 1944; Fries, 1955; Worgan, 1968; Oyama et al., 1974).

Безусловную ценность представляют работы под руководством А.С. Бухало, посвященные изучению роли источника углерода при искусственном культивировании ксилотрофных базидиомицетов (1988). В качестве единственного источника углерода на синтетической среде были испытаны моносахариды – ксилоза, глюкоза, галактоза; дисахариды – сахароза, мальтоза, лактоза; трисахарид – рафиноза; полисахариды – крахмал, сахароза; спирт – маннит. Контролем служила питательная среда с глюкозой. Кроме того, в качестве источника углеродного питания были испытаны целлюлоза, лигнин и неуглеводные источники – мягкий парафин и этанол. Интенсивность роста исследованных видов, культивированных на питательных средах с разными источниками углерода, значительно отличалась. Так, Panus tigrinus, Flammulina velutipes и Kuehneromyces mutabilis лучше усваивали ксилозу по сравнению с глюкозой, однако большинство видов хуже росли на питательной среде с ксилозой. Глюкоза оказалась наилучшим источником углерода для Armillaria mellea и Pholiota adiposa. Большее количество биомассы на среде с галактозой, чем на среде с глюкозой, образовывали Schizophyllum commune, Panus tigrinus, Coprinus comatus, Agaricus silvaticus и другие виды. Из испытанных дисахаридов лучше использовалась мальтоза. Более активно, чем на других источниках углерода, на ней росли Schizophyllum commune, Panus tigrinus, Pholiota aurivella. Лактоза и рафиноза усваивались хуже, чем другие источники углерода. Многие испытанные виды – Kuehneromyces mutabilis, Panus tigrinus и другие глюкозе предпочитали крахмал (Бухало, 1988). Данные, полученные при культивировании Crinipellis schevczenkovii, свидетельствуют, что из 13 исследованных источников углерода (глюкоза, арабиноза, ксилоза, манноза, фруктоза, лактоза, мальтоза, сахароза, маннит, сорбит, крахмал, целлюлоза) лучшими для роста гриба и синтеза им полисахаридов являются глюкоза и крахмал (Бабицкая и др., 2005).

Усвоение высшими базидиомицетами углеводородов в литературе освещено неполно. Т. Сугимори с соавторами (Sugimori et al., 1971) приводят данные об использовании высшими базидиомицетами, в том числе Pteurotus ostreatus, Flammuiina velutipes, Lentinus edodes и Schizophyllum commune, неуглеводных источников углерода: алифатических спиртов, алканов, органических кислот трикарбонового цикла. На мягком парафине в качестве источника углерода растут Coriolus zonatus, Schizophyllum commune, Armillarieila mellea, Hirneola auricula-judae, Pholiota aurivella, Pleurotus ostreatus (Bilai et al., 1968; Билай, Коваль, 1980; Бухало, 1988; Антоненко, 2009).

Древоразрушающие базидиомицеты в природе принимают участие в разложении целлюлозы и хорошо используют этот высокомолекулярный углевод при искусственном культивировании. Многие виды активно растут на среде с фильтровальной бумагой в качестве единственного источника углерода. К ним относятся лигнотрофние виды из родов Panus, Pieurotus, Flammulina, Pholiota и Schizophyllum (Бухало, 1988). Автор цитируемой монографии свидетельствует, что наиболее высокой активностью целлюлозолитических ферментов характеризуются виды, приуроченные в природе к целлюлозосодержащим субстратам: Panus tigrinus, Pleurotus ostreatus, Flammulina velutipes, Crinipellis schevczenkovi и Armillarieila mellea.

Лигнин используется грибами белой гнили в природе. Однако в культуре для усвоения грибами он должен находиться в доступной форме, и грибы, как правило, должны быть к нему адаптированы (Шиврина и др., 1969; Berry, 1975). Проблема такой адаптации, а также получения соответствующих форм лигнина мало освещена в литературе.

Особенности содержания тех или иных функциональных групп в различных видах лигнина довольно подробно освещены в целом ряде специальных монографий (Грушников, Елкин, 1973; Закис, 1987). В качестве примера, иллюстрирующего разнообразие функциональных групп в препарате, который принято считать наиболее близким к природному лигнину еловой древесины, следует привести гипотетическую структурную формулу фрагмента макромолекулы лигнина Бьёркмана, предложенную Фрейденбергом (1969) (рис. 2).

Рисунок 2 – Гипотетическая структурная формула фрагмента макромолекулы лигнина хвойной древесины (по Freudenberg, 1968)

Схема эта, конечно же, не претендует на абсолютно точное отображение истинного строения макромолекулы лигнина, но наиболее удовлетворительно согласуется с аналитическими данными и позволяет объяснить многие реакции лигнина и его трофическую значимость для грибов белой гнили. Согласно формуле Фрейденберга, в природном (in situ) лигнине присутствуют следующие функциональные группы: метоксильные, фенольные гидроксильные, первичные и вторичные алифатические гидроксильные, кетонные и альдегидные (Азаров и др.,1999; Айзенштат, Боголицин, 2009). В других видах и препаратах лигнина количество групп будет иным. В зависимости от способа выделения и обработки препарата, особенно при химическом модифицировании, в нем могут появляться и другие, не свойственные природному лигнину группы.

Вопрос о том, является ли лигнин источником энергии для грибов, способен ли лигнин хотя бы отчасти обеспечивать энергетические и ростовые потребности этих организмов, является дискуссионным. По мнению Т.К. Кирка, лигнин не следует рассматривать как источник энергии, а его деструкция древоразрушающими грибами белой гнили является лишь частью вторичного метаболизма (Kirk, 1981). Существуют подобные обзоры, посвященные процессам биодеградации лигнина (Решетникова, 1997; Головлева, Леонтьевский, 1998; Eriksson et al., 1990; Hattaka, Vares, 1994). На основе существующих данных, выделяют следующие группы реакций, приводящих к деструкции макромолекулы лигнина:

– окисление боковых цепей лигнина по α– и β– углеродным атомам с образованием структур, содержащих кетогруппы, а также с образованием фенольных структур;

– гидролитическое расщепление β-О-4 эфирных связей с образованием спиртовых и фенольных структур;

– разрушение алкиларильных С-С-связей, образование nхиноидных структур и альдегидных или кислотных фрагментов;

– деметилирование и гидроксилирование ароматического кольца;

– расщепление ароматического кольца с образованием алифатических продуктов, чаще всего карбоновых кислот (Решетникова, 1997).

Исходя из приведенных данных, следует предполагать включение углерода метоксильных и других групп в метаболические процессы грибов, способных к деструкции лигнина. Исходя из цитируемой многими литературными источниками связи процессов окисления лигнина с реакциями вторичного метаболизма, можно предполагать и наличие в определенной степени регуляторной роли со стороны лигнина и промежуточных соединений, образующихся в процессе его деструкции (вератровый спирт и т.п.).

Изменения в лигнине при деструкции грибами белой гнили изучали химическими методами, а также с помощью УФ-, ИКи ПМР-спектроскопии с последующей качественной оценкой (Fengel, Wegener, 1979; Dietrichs et al., 1995). Установлено, что под действием грибов белой гнили в лигнине увеличивается содержание карбонильных и карбоксильных групп и уменьшается содержание алифатических гидроксильных групп. Содержание фенольных гидроксилов может и возрастать и понижаться. Отношение кислорода к углероду увеличивается, а водорода к углероду и метоксильных групп к углероду понижается. Уменьшаются также выходы метоксилированных ароматических кислот при окислительной деструкции после метилирования (вератровой кислоты из хвойного лигнина и вератровой и три-О-метилгалловой кислот из лиственного лигнина) и продуктов нитробензольного окисления (ванилина из хвойного лигнина и суммы ванилина и сиреневого альдегида из лиственного лигнина). Уменьшается выход продуктов ацидолиза и их число. Из лигнина здоровой древесины в качестве основного продукта ацидолиза получается 3гидрокси-1-(4-гидрокси-3-метоксифенил) -2-пропанон, тогда как из гнилого лигнина – ванилиновая кислота.

После воздействия грибов возрастает массовая доля кислорода и понижается содержание метоксильных групп (Фенгел, Вегенер, 1988). Увеличение содержания кислорода происходит в результате окисления α-углеродных атомов и окислительной деструкции связей между β– и γ-углеродными атомами пропановой цепи (Fengel, Wegener, 1979). Модельные опыты с различными метоксилированными фенолами показали, что грибы белой гнили деметилируют метоксильные группы. Опыты с меченым (¹⁴С) лигнином свидетельствуют, что при разложении лигнина грибами белой гнили (Coriolus versicolor, Phanerochaete chrysosporium) конечный продукт метаболизма СО₂ образуется главным образом из метоксильных групп и в небольшой степени из углерода пропановых цепей и ароматических колец (Фенгел, Вегенер, 1988). Таким образом, практически не остается сомнений относительно включения функциональных групп лигнина в метаболические процессы грибов белой гнили.

Дальнейшие реакции приводят к получению мономерных и димерных соединений, большинство из которых содержат карбоксильные группы. Для включения этих соединений во внутренний обмен веществ гриба необходимо также, по-видимому, и расщепление ароматических колец. Среди ферментов грибов идентифицировали диоксигеназы, осуществляющие деметилирование ванилиновой и вератровой кислот – мономеров, которые были найдены в продуктах деструкции лигнина под действием грибов (рис. 3) (Chen et al., 1981).

Рисунок 3 – Окислительное расщепление ванилиново й кислоты под действием диоксигеназ

Расщепление ароматических колец возможно не только у мономерных продуктов деструкции. Ароматические кольца в лигнинном полимере также, по-видимому, расщепляются ферментами (Kirk et al., 1976; Chen et al., 1981).

На расщепление ароматических колец указывают ¹³С-ЯМРспектры искусственного лигнина, зараженного грибами белой гнили. Происходит также разрыв арилэфирных связей и расщепление пропановых цепей. Изменение состава продуктов ацидолиза древесины березы, пораженной белой гнилью, позволило заключить, что деструкция лигнина происходит на пораженной поверхности, которая прогрессирующе увеличивается. Макромолекулы практически не подвергаются фрагментации. Процесс деструкции заключается в отщеплении концевых групп (Фенгел, Вегенер, 1988).

Лигнин, очевидно, включается в метаболизм грибов не полностью, так как некоторая часть его превращается в высоко-конденсированный продукт. Реакции, обратные ферментативной деструкции, обнаружили и при выращивании грибов Heterobasidion annosum и Coriolus versicolor на лигнине молотой древесины, сульфатном лигнине и лигносульфонатах (Cote, 1968). Модельные эксперименты указывают на образование бифенильных структур в результате ферментативной дегидратации. Эту реакцию, по-видимому, вызывает лакказа, так как добавка ингибиторов лакказы предотвращает конденсацию. Добавление целлюлозы к культуре Pleurotus ostreatus на лигносульфонатах ингибировало реакции образования полимеров (Crawford, 1981). Целлюлоза превращается в целлобиозу – совместный субстрат (косубстрат) для целлобиозохиноноксидоредуктазы. Этот фермент уменьшает число фенольных радикалов и тем самым ингибирует полимеризацию.

Конденсированные лигнины, содержащие дифенильные связи, проявляют высокую устойчивость к действию ферментов грибов (Chen et al., 1981). В лиственном лигнине и искусственном гваяцил-сирингильном лигнине сирингильные элементы подвергаются деструкции быстрее, чем гваяцильные. Это объясняется большим содержанием в гваяцильной части лигнина дифенильных структур, у которых фенольные гидроксильные группы не склонны к образованию феноксильных радикалов (Фенгел, Вегенер, 1988).

Таким образом, существующие обзоры свидетельствуют о существенной дискуссионности проблемы трофического использования грибами такого нестереорегулярного биополимера как лигнин, однако исследования характера динамики метоксильных групп в питательном субстрате, обогащенном лигнином, при лабораторном культивировании грибов белой гнили, на наш взгляд, способно несколько прояснить этот вопрос.

От химической природы и особенностей используемого источника углерода зависит в основном и доступность для мицелиальной культуры того или иного источника азота. Азотистые соединения, которые являются важнейшей составной частью протоплазмы и играют большую роль в обмене веществ у грибов, являются основой белков (Горленко, 1985). Грибы не в состоянии связывать атмосферный азот, а могут принимать его только в форме неорганических солей или органических азотных соединений (Morton, Mc Millan, 1954). Большинство грибов хорошо усваивает аммиачные соли – сульфат аммония, фосфат аммония, а также аммиак из водного раствора. Соли азотной кислоты не всегда хорошо усваиваются (Беккер, 1988). Только некоторые виды дрожжей испытывают потребность в нитратах. Часто источником азота в состав сред включают мочевину. Также как и в случае с источниками углерода, роль источников азота в процессах роста и метаболизма наилучшим образом изучена и описана вотношении продуцентов антибиотиков. На средах с одними источниками азота организмы могут хорошо развиваться, но не осуществляют в данных условиях биосинтеза антибиотика. Это свидетельствует о наличии регуляторной роли доступности азота для его включения в процессы метаболизма (Егоров, 1986). Обычно в средах для культивирования микроорганизмов в качестве источника азота используют соли азотной (HNO₃), или реже соли азотистой (HNO₂) кислот, аммонийные соли органических или неорганических кислот (-NH₄) или аминокислоты (NH₂), белки и продукты их гидролиза (пептоны, гидролизаты). Как видно, в этих источниках азот находится или в виде окисленной формы (-NO₃, – NO₂), или в восстановленной форме (NH; – NH₂). В натуральных средах неопределенного состава, содержащих соевую муку, кукурузный экстракт и другие подобные компоненты, азот содержится главным образом в форме белков, питательная ценность которых зависит от наличия у микроорганизмов соответствующих протеаз, расщепляющих эти белки, и определяется тем, насколько легко в процессе ферментативного гидролиза из белков освобождается азот в виде аминокислот и несложных полипептидов, а в конечном счете в форме – NH₂. Аминокислоты играют существенную роль в метаболизме микроорганизмов. Это объясняется, во-первых, тем, что аминокислоты непосредственно участвуют в синтезе белка (структурного и ферментов) и различных полипептидов; во-вторых, они могут принимать участие в образовании антибиотиков, в том числе и небелковой природы. Аминокислоты могут оказывать заметное влияние на активность ферментов (индуцировать их образование или репрессировать, подавлять активность). Присутствие в среде одних аминокислот может приводить к образованию других.

Как уже указывалось, доступность того или иного источника азота зависит в основном от химической природы используемого углерода. Использование аммония и некоторых органических источников азота грибами в большой степени зависит от наличия в среде органических кислот. Небольшие количества (0,1 – 0,2 %) дикарбоновых кислот с четырьмя углеродными атомами (например, янтарная, фумаровая) способствуют лучшему усвоению азота. Это, по всей вероятности, связано с тем, что в данном случае легче образуются кетокислоты, которые, как было указано выше, в свою очередь, связывают аммиак. В этом виде значительно упрощается включение аммиака в метаболизм грибов. Определенную роль в развитии организмов и образовании вторичных метаболитов играют также катионы и анионы солей используемых источников азота (Егоров, 1986). Если организм хорошо использует аммонийную форму азота, то для его развития небезразлично, в какой форме этот аммоний вводится в среду. При использовании, например, сернокислого и молочнокислого аммония можно получить различные результаты, несмотря на то, что азот представлен одной и той же формой. При использовании сернокислого аммония среда будет сильно подкисляться в результате накопления ионов серной кислоты. Если же будет использоваться молочнокислый аммоний, то резкого сдвига в значении рН субстрата может не произойти, так как освобождающаяся молочная кислота легко может быть использована организмом в качестве источника углерода. Таким образом, в данном случае роль аниона при одной и той же форме азота будет также различной. Все эти факторы необходимо учитывать при изучении развития микроорганизмов и возможностей образования ими метаболитов.

Для продуцентов антибиотиков указывается, что в зависимости от источника азота и формы, в которой он присутствует в среде, микроорганизм будет в состоянии синтезировать антибиотическое вещество или он будет лишен этой способности (Егоров, 1986). Так, продуцент стрептомицина не образует антибиотика при развитии на средах с нитратами или нитритами в тех случаях, когда они являются единственными источниками азота. Образование стрептомицина происходит на средах с аммонийными источниками азота. Биосинтез пенициллина идет более энергично, если в среде наряду с аммонийным источником азота имеется нитратный источник азота.

Роль особенностей и степени доступности различных источников азота активно изучалась и в отношении высших базидиальных грибов, в том числе, древоразрушающих. Выбор источника азота очень важен для получения хорошего роста мицелия в культуре и высокого содержания в нем протеина (Бухало, 1988). Факт того, что потребность грибов в азоте в значительной мере зависит от снабжения их углеродом, а также от других факторов обсуждается и в отношении базидиомицетов (Маслова, 1969; Биосинтетическая деятельность… 1969; Berry, 1975; Dijkstra, 1976). Высшие базидиомицеты могут использовать как неорганические, так и органические формы азота. Основными источниками неорганического азота являются аммонийные соли и нитраты. По мнению некоторых исследователей (Биосинтетическая деятельность … 1969; Маслова, 1969; Treschow, 1944; Вегту, 1975; Dijkstra, 1976), нитраты не усваиваются или плохо усваиваются многими высшими базидиомицетами. Имеются, однако, сведения, что некоторые виды родов Tricholoma, Coprinus, Collybia, Lentinus хорошо используют нитраты (Маслова, 1969; Бухало и др., 1972; Rawald, 1963).

Органический азот обычно обеспечивает лучший рост мицелия, чем минеральные соли азота (Биосинтетическая деятельность…1969; Маслова, 1969; Dijkstra, 1976). Из органических источников азота для выращивания мицелия съедобных грибов используются мочевина и аминокислоты. Как один из благоприятных источников азота отмечается аспарагин (Berry, 1975). Хорошими источниками азота для высших базидиомицетов являются белки, пептоны, свободные аминокислоты, гидролизат казеина. При исследовании физиологии грибов рода Coprinus (Fries, 1955) показано, что у них существуют видовые и штаммовые различия усвоения разных форм азота. Одни штаммы Coprinus fimetarius способны усваивать нитраты, другие – нитриты. Азотное питание у многих видов высших съедобных базидиомицетов до настоящего времени не изучалось.

В качестве источника азота на синтетической среде с глюкозой А.С. Бухало с сотрудниками испытаны нитратные и аммонийные соли (NaNO₃, NH₄C1, NH₄NO₃), а для некоторых видов – также органические соединения азота: аспарагин, мочевина и пептон (Бухало, 1988). Контролем служил рост мицелия на среде с NaNO₃. Не все испытанные виды росли на среде с нитратным азотом. Его не усваивают Agaricus bisporus, Lepista nuda, Flammulina velutipes, слабо утилизируют NaNO₃ Pleurotus ostreatus, Рanus tigrinus. В то же время, Agaricus hortensis, Armillariella jnellea, Macrolepiota procera, Marasmius scorodonius, Lycoperdon pyriforme и Coprinus micaceus лучше росли на среде с нитратным азотом, чем с аммонийным. На средах с аммонийными источниками азота лучше, чем на среде с нитратным азотом, развивались Schizophyllum commune, Sparassis rispa, Pleurotus ostreatus, Panus tigrinus, P. conchatus, Oudemansiella radicata, Agaricus arvensis, A. silvaticus, Coprinus comatus, Scleroderma citrinus, Suillus variegatus и др. Наилучший рост испытанных штаммов, кроме Macrolepiota procera и Pleurotus ostreatus, отмечен на среде с органическим источником азота – аспарагином. На среде с мочевиной в указанных исследованиях прекрасно развивались культуры Pleurotus ostreatus, Kuehneromytes mutabilis и Agaricus arvensis, но слабо росли Macrolepiota procera, Agaricus bisporus, Flammulina velutipes и др. Установлено, что на среде с NaNO₃ и аспарагином большинство испытанных штаммов незначительно изменяют рН среды в кислую сторону. При культивировании на среде с аммонийными соединениями азота, являющимися в данном случае солями сильных кислот, 40-50 % испытанных грибов подкисляют питательную среду до рН 3-4. А.С. Бухало (1988) отмечает, что аммонийные соли являются хорошим источником азота для культивирования высших базидиомицетов. Однако в связи с тем, что на синтетической среде с аммонийными солями происходит закисление питательной среды, культивирование следует проводить, используя аммонийные соли слабых кислот. Проведенные исследования, безусловно, имеют огромное теоретическое и прикладное значение, однако в анализе полученных данных авторами практически не уделяется внимания взаимосвязи между особенностями ассимиляции азота и трофической принадлежностью вида. Однако, на наш взгляд, это перспективная сфера исследований, которая приобретает особое значение в применении к биотехнологически ценным культурам, поскольку от источника азота могут зависеть не только ростовые, но и продуктивные показатели. Более того, заслуживает внимания такое направление, как возможности регуляции темпов развития, стимуляции или пассивации метаболических процессов модификацией видов источников азота, дробности их внесения в субстрат и т.п. При направленном биосинтезе, например, целлюлолитических ферментов грибом Peniophora gigantea наивысшая биохимическая активность клеток наблюдается на средах с органическим азотом (аспарагин, пептон и др.) (Мосин, 2002).

Питательные резервы мицелия имеют большое значение для последующего плодоношения (Robert, 1977, 1979; Morimoto et al., 1981). При использовании традиционных методов культивирования вегетативная и репродуктивная фазы развития грибов проходят на едином субстрате. В методах японских авторов (Oyama et al., 1974) вегетативная и репродуктивная фазы обеспечиваются оптимальными условиями питания на разных средах. Причем после появления зачатков плодовых тел все используемые соединения азота поступают из мицелия. Плодовые тела таких видов, как Flammulina velutipes, Panus tigrius, Pleurotus ostreatus и других, легко плодоносящих в культуре, образуются на том же субстрате, на котором сохраняется в лаборатории культура гриба.