Текст книги "Редактируя человечество: Революция CRISPR и новая эра изменения генома"

Очевидным выбором была кишечная палочка E. coli, лабораторная рабочая лошадка. Однако какую систему CRISPR взять? Оказалось, S. thermophilus обладала четырьмя такими системами – все они имеют кластер спейсеров, но различаются по строению и соседним Cas-генам. Шикшнис выбрал самую простую (тип II) с наименьшим числом генов Cas, среди которых был Cas9, как известно, необходимый для приобретения устойчивости к фагам. Обладая глубокими познаниями в области ферментов, разрезающих ДНК, Шикшнис заметил пару элементов в структуре Cas9, напоминавших активные каталитические центры, которые он знал в рестриктазах. Это говорило о том, что Cas9 сам мог обладать интересными свойствами разрезания ДНК.

Появление литовца в истории CRISPR означало еще одну новую точку на карте исследований. Однако на то, чтобы соединить точки пути, где разрабатывались закваски для йогурта и сыра для пиццы, и дойти до конечных пунктов в универсальной технологии редактирования генов, потребовалось пять лет. Следующий этап состоял в том, чтобы найти ответы на некоторые практические вопросы: как спейсеры CRISPR захватывались из атакующих фагов и вшивались в бактериальный геном? И как они вооружались, чтобы определять и уничтожать проникший фаг?

Группа Муано первой описала ключевую последовательность распознавания[133]133
  H. Deveau et al., «Phage Response to CRISPR-Encoded Resistance in Streptococcus thermophilus,» Journal of Bacteriology 190, (2008): 1390–1400, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2238228/.


[Закрыть], первую критическую точку соприкосновения Cas9 с ДНК. Когда фаги мутировали или избегали CRISPR-опосредованного разрушения, Муано проанализировал мутации, которые происходили лишь в одном основании в повторах CRISPR и затрагивали именно последовательность распознавания, которую Мохика назвал мотивом, прилегающим к протоспейсеру, или PAM (proto-spacer adjacent motif)[134]134
  F. J. M. Mojica et al., «Short Motif Sequences Determine the Targets of the Prokaryotic CRISPR Defence System,» Microbiology 155, (2009): 733740.


[Закрыть].

На протяжении последующих нескольких лет ученые по всему миру начали складывать молекулярную мозаику иммунной системы CRISPR. Это было похоже на британскую детскую игру «Передай другому»: на каждом этапе музыка останавливалась и разные участники снимали еще один слой упаковки, прежде чем раскрыть подарок. После того как Бэнфилд определила наличие CRISPR в своих образцах микроорганизмов[135]135
  A. F. Andersson and J. F. Banfield, «Virus Population Dynamics and Acquired Virus Resistance in Natural Microbial Communities,» Science 320, (2008): 1047–1050, https://science.sciencemag.org/content/320/5879/1047.abstract.


[Закрыть], она обратилась к Баррангу с предложением организовать совещание по CRISPR. Летом 2008 г. примерно 30 ученых собрались в Стэнли-холле Университета Беркли. Пришли и члены лаборатории Дудны, расположенной на седьмом этаже того же здания. Баррангу оплатил вино и пиво своей корпоративной кредитной картой.

Тем временем действие переместилось в Нидерланды. Изучавшие CRISPR у кишечной палочки Джон ван дер Ост, микробиолог из Университета Вагенинга, и Стэн Броунс показали, что спейсеры CRISPR сначала транскрибируются в длинную непрерывную нить РНК, которая потом разрезается на отдельные крРНК, соответствующие спейсерам. Эта РНК затем образует комплекс с белками Cas, воздействующими на соответствующий фаг[136]136
  S. J. J. Brouns et al., «Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes,» Science 321, (2008): 960–964, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5898235/.


[Закрыть]. (CRISPR кишечной палочки относится к I типу, в котором роль Cas играет комплекс из пяти белков, известный как Cascade.) Результат ознаменовал собой веху в истории CRISPR и был должным образом отмечен десятилетия спустя, когда ван дер Ост получил самую престижную научную премию Голландии – премию Спинозы. «Не думаю, что о работе Джона когда-нибудь забудут», – говорит Кунин, неофициальный летописец эволюции CRISPR[137]137
  Mark van der Meijs, «'Without John van der Oost, CRISPR-Cas would never have become this big,'» Resource, June 19, 2019, https://resource.wur.nl/en/science/show/Without-John-van-der-Oost-CRISPR-Cas-would-never-have-become-this-big-.htm.


[Закрыть].

В Чикаго Эрик Зонтхаймер и его постдок Лучано Марраффини разработали несколько детально продуманных экспериментов с использованием Staphylococcus epidermis, чтобы решить другой важный вопрос: системы CRISPR-Cas атакуют вирусную РНК, имитируя РНК-интерференцию, или вирусную ДНК? Марраффини подозревал, что бактерии будут более эффективно избавляться от вирусных инфекций, если они расщепят ДНК, одним махом занеся мачете над вирусным геномом. Он был прав[138]138
  L. A. Marraffini and E. J. Sontheimer, «CRISPR interference limits horizontal gene transfer in Staphylococci by targeting DNA,» Science 322, (2008): 1843–1845, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2695655/.


[Закрыть]. С практической точки зрения, писали они, «способность направлять специфическое адресное разрушение ДНК, которая содержит любую целевую последовательность длиной 24–48 оснований, может принести большую практическую пользу, особенно если эта система способна работать вне своего естественного бактериального контекста».

Зонтхаймер и Марраффини увидели проблеск клинической значимости – возможность «препятствовать все нарастающему распространению генов резистентности к антибиотикам и факторов вирулентности стафилококков и других бактериальных патогенов». Это был небольшой шаг на пути к точному редактированию генома с применением CRISPR, хотя в нем использовалась исключительно кнопка удаления (Delete). «Мы были первыми, кто предложил и четко описал возможность перепрофилирования CRISPR для использования в геномной инженерии», – утверждал Зонтхаймер[139]139
  Will Doss, «The CRISPR Revolution,» Northwestern Medicine, February 16, 2018, https://magazine.nm.org/2018/02/16/the-crispr-revolution/.


[Закрыть]. Однако празднование было недолгим: заявка на патент, поданная Зонтхаймером, была отклонена из-за недостатка экспериментальных подтверждений, равно как и амбициозная заявка на грант, опередившая свое время на много лет. (Как мы увидим в главе 12, это было началом напряженной юридической битвы за авторство изобретения.)

Интерес к CRISPR рос, открывались дополнительные типы систем CRISPR. В Университете Джорджии Майкл Тернс показал, что система CRISPR III типа атакует РНК, а не ДНК. Тем временем Дудна опубликовала свою первую статью по CRISPR в соавторстве с Виденхефтом и Рейчел Хаурвиц.

В 2010 г. Муано, который был очарован фагами с тех пор, как впервые увидел их под электронным микроскопом, вышел на авансцену. «Если вы подойдете к океану и зачерпнете воду ладонями, то в ней будет больше вирусов, чем людей на планете», – считал он[140]140
  K. Davies and S. Moineau, «The Phage Whisperer: An Interview with Sylvain Moineau,» The CRISPR Journal 1, (2018): 363–366, https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/crispr.2018.29037.kda.


[Закрыть]. Его сильной стороной были фаги, которые инфицируют S. thermophilus – ключевой ингредиент йогуртов и сыра. Муано утверждает, что мы съедаем больше 1 секстиллиона (10^-71) клеток S. thermophilus в год.

Интерес Муано приковывает продолжающаяся гонка вооружений между фагами и бактериями. Еще сотрудничая с Хорватом, Баррангу и командой Danisco, лаборатория Муано показала, что крРНК расщепляют свои ДНК-мишени, буквально вырезая из кольцевой молекулы ДНК (плазмида внутри бактерии) линейный фрагмент, образуя чистые тупые срезы около последовательности PAM[141]141
  J. E. Garneau et al., «The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA,» Nature 468, (2010): 67–71, https://www.nature.com/articles/nature09523.


[Закрыть]. Муано опубликовал эти данные в журнале Nature, что стало одним из важнейших событий в его карьере.

Тем временем исследователи продолжали расширять семейство генов Cas, прочесывая просторы жизни микроорганизмов на Земле, причем наибольшая заслуга в этом принадлежит Кунину и Макаровой. Число различных классов и подтипов CRISPR становилось все больше, и к 2020 г. было известно уже шесть классов. К счастью, бактерии Strep, которых изучали Хорват и Баррангу, обладали системой II типа, самой простой из систем CRISPR, и результаты были ошеломляющими.

На свое первое письмо, отправленное Эмманюэль Шарпантье в начале 2017 г., я получил немедленный ответ. Это была автоматическая рассылка, в которой говорилось:

По причине плотного графика в связи с церемониями получения наград я не смогу ответить на ваше электронное письмо…

Это был первый звоночек. Она не шутила. Шарпантье получила десятки престижных наград начиная с 2012 г. Когда журналист из Le Figaro спросил, не отвлекает ли ее вся эта суета вокруг постоянных церемоний награждения, она ответила: «Это довольно забавно! Конечно, я проводила исследования не ради этого. Я ученый, и мне нравится уединиться в лаборатории с моими коллегами»[142]142
  Pauline Freour, «Emmanuelle Charpentier: 'Des qu'on manipule le vivant, il y a un risqué de derive,'» Le Figaro, March 22, 2016, http://sante.lefigaro.fr/actualite/2016/03/22/24766-emmanuelle-charpentier-quon-manipule-vivant-il-y-risque-derive.


[Закрыть]. Научный руководитель ее кандидатской диссертации как-то заметил, что она настолько изобретательна, что могла бы открыть лабораторию даже на необитаемом острове[143]143
  Alison Abbott, «The quiet revolutionary: How the co-discovery of CRISPR explosively changed Emmanuelle Charpentier's life,» Nature, April 27, 2016, https://www.nature.com/news/the-quiet-revolutionary-how-the-co-discovery-of-crispr-explosively-changed-emmanuelle-charpentier-s-life-1.19814.


[Закрыть]. До этого не дошло, но после двух десятилетий кочевой жизни – переездов из Соединенных Штатов в Австрию и Швецию – она нашла пристанище в Берлине. Время покажет, сможет ли Эмманюэль повторить свой успех, которого она достигла в 2012 г.

Шарпантье, возможно, не обладает в США таким высоким научным авторитетом, как Дудна или Чжан, но в Европе все иначе. В 2015 г. газета Le Monde окрестила ее «очаровательным маленьким монстром» генной инженерии с «видом пересмешника, восседающего в лесу среди известных научных авторитетов Франции, Европы и Америки[144]144
  Florence Rosier, «Emmanuelle Charpentier, le 'charmant petit monstre' du génie génétique,» Le Monde, January 9, 2015, https://www.lemonde.fr/sciences/article/2018/05/31/emmanuelle-charpentier-le-charmant-petit-monstre-du-genie-genetique_4559167_1650684.html.


[Закрыть]. Ее называют «воинственной и храброй». Три музы, которые ее вдохновляют, – это любопытство, смелость и свобода. Через год та же газета выпустила статью под заголовком «Новые знаковые фигуры в биологии», где Шарпантье и Дудна были названы «Тельмой и Луизой» биомедицинских исследований, которые получают научные награды и признание так же, как белки собирают орехи[145]145
  N. Herzberg, «Les nouvelles icones de la biologie,» Le Monde, August 1, 2018, https://www.lemonde.fr/festival/article/2016/08/01/la-piste-aux-etoiles_4977125_4415198.html.


[Закрыть].

В сентябре 2018 г., всего через несколько недель после вручения премии Кавли в Осло, Шарпантье полетела в Нью-Йорк, чтобы прочитать мемориальную лекцию в Колумбийском университете[146]146
  The annual lecture is given in honor of the son of Columbia University chemistry professor Stephen Lippard, who died age seven of a neurological disease. Emmanuelle Charpentier, «The 44th Annual Andrew Mark Lippard Memorial Lecture,» (lecture, Columbia University, New York, September 26, 2018), http://www.columbianeurology.org/44th-annual-andrew-mark-lippard-memorial-lecture.


[Закрыть]. Как обычно, ее появления ожидал переполненный зал: сотни студентов и преподавателей, включая долговязую фигуру нобелевского лауреата Ричарда Акселя. Прибыв с опозданием, выдающийся нейробиолог водрузился в первом ряду, предвкушая, как и все остальные, услышать миниатюрную француженку, которая буквально по его стопам шла к премии в Стокгольме. После длинного представления Шарпантье вежливо упрекнула ведущего в преувеличении ее достижений. «Я не публиковала столько статей! – сказала она. – Я всегда была скорее сторонником перфекционизма, я уделяю больше внимания качеству, а не количеству».

В своей книге Дудна напишет, что при первой встрече Шарпантье показалась ей «мягкой и застенчивой». Это было так похоже и на лекцию Шарпантье, в которой она удивительно сдержанно рассказала о ее пути к CRISPR, вспоминая в этой связи легендарных французских молекулярных биологов Франсуа Жакоба и Жака Моно. На словах Моно, произнесенных им в 1970 г., она останавливается особо:

Современная молекулярная генетика не предлагает нам никаких средств для воздействия на наследие предков, чтобы улучшить его добавлением новых черт – создать генетического «суперчеловека». Наоборот, она раскрывает тщетность подобных замыслов: микроскопические пропорции генома сегодня и, вероятно, навсегда исключают манипуляции такого рода[147]147
  Jacques Monod, Chance and Necessity (New York: Vintage Books, 1972).


[Закрыть].

Шарпантье редко поднимает взгляд на слушателей и кажется мне настороженной, не готовой расслабиться и поделиться информацией. Аксель ерзает в первом ряду. Она задает риторический вопрос: помогла ли ее собственная склонность к переездам «понять способы защиты бактерий от подвижных существ»? Это скорее констатация факта, чем попытка пошутить. И если ей недостает юмора, то скромности хоть отбавляй. Шарпантье признается, что ей очень повезло. В течение многих лет ее лаборатория работала с бактерией Streptococcus pyogenes, которая вызывает опасные для жизни инфекции. Эта бактерия была источником белка Cas9. «Работа Cas9 в Strep pyogenes очень эффективна, – говорит Шарпантье. – Мы протестировали другие белки Cas9, некоторые из которых обладали той же эффективностью, но, если бы мы обнаружили эти механизмы в других видах бактерий, я бы не стояла перед вами».

После лекции Шарпантье отвечает на вопросы слушателей: она сетует на недавно принятое решение Европейского суда по вопросам ГМО («большое разочарование для европейских ученых») и отвергает опасения по поводу рисков, связанных с CRISPR. «Результативность – это более серьезное препятствие, чем сам механизм CRISPR», – уверенно заявляет она. Студенты выстраиваются в очередь, чтобы сделать с ней селфи. В конце концов, она настоящая научная знаменитость. Я тоже встаю в очередь, чтобы пригласить ее на интервью, прежде чем она отправится на ужин с некоторыми VIP-персонами из университета.

На следующее утро мы встречаемся в Верхнем Вест-Сайде Манхэттена. Она выглядит шикарно за два месяца до своего пятидесятилетия в блейзере и джинсах. На своей же выстиранной белой рубашке я замечаю свежие следы экскрементов голубей Центрального парка. «Видимо, это к удаче», – улыбается она, когда мы направляемся в ближайшее небольшое французское кафе.

Шарпантье родилась в двадцати пяти километрах к югу от Парижа в 1968 г., через полгода после студенческих протестов и гражданских волнений. С раннего возраста она хотела поступить в колледж по примеру старшей сестры. Отец научил ее латинским названиям растений, что, возможно, вдохновило ее на изучение биологии. Однажды в возрасте двенадцати лет Эмманюэль пришла из школы и сказала матери, что когда-нибудь поступит в Институт Пастера. Десять лет спустя она выполнила это обещание: «Я получила самую низкую оценку [по микробиологии], и это стало моей специальностью!» – смеется она. Шарпантье получила научную степень по микробиологии в 1995 г.: она писала диссертацию, сидя в библиотеке с видом на собор Парижской Богоматери.

Шарпантье признала, что ее жизнь ученого-исследователя соответствовала многим аспектам ее личности – любопытству, стремлению к знаниям, удовольствию от передачи знаний другим и от работы в команде, а также желанию перевести сложные научные открытия в практическую плоскость, что поможет обществу[148]148
  E. Charpentier, «The Kavli Prize: An autobiography by: Emmanuelle Charpentier,» 2018, http://kavliprize.org/sites/default/files/%25nid%25/autobiagraphies_attachments/Emmanuelle%20Charpentier_autobiography.pdf.


[Закрыть]. Она провела шесть лет в Соединенных Штатах, начав с Университета Рокфеллера в Нью-Йорке. Изучала бактерии, вызывающие кожные заболевания у мышей, в поисках новых биохимических механизмов и лекарственных препаратов. После работы с Streptococcus pneumoniae она перешла к S. pyogenes, которая стала ее любимым микроорганизмом. Благодаря опыту, полученному в Америке, Эмманюэль познакомилась с талантливыми исследователями, многие из которых обладали сильным духом предпринимательства. Эти знания она тоже усвоила.

Когда она решила вернуться в Европу, в Институте Пастера не было вакансий, но она оказалась в Венском университете в лабораториях, названных в честь нобелевского лауреата Макса Перуца, современника Крика и Уотсона[149]149
  В начале 1953 г. Перуц поделился с Уотсоном и Криком отчетом Совета медицинских исследований, содержащим неопубликованные данные кристаллографии ДНК, полученные Розалинд Франклин. Это оказалось критически важным при «сборке» двойной спирали.


[Закрыть]. «Для меня была важна независимость и еще – чтобы мне никто не мешал», – рассказывает она. Меня заинтриговала готовность Шарпантье путешествовать в поисках свободы и финансирования. Она продолжает: «За 27 лет я поработала в пяти странах, семи городах, десяти институтах. Четырнадцать разных офисов, тринадцать разных отделов и четырнадцать квартир. Это очень много!» Каждому шагу способствовал научный интерес или стремление найти лучшее место для работы.

Шарпантье познакомилась с CRISPR в 2006 г. Две ее студентки, Мария Экхерт и Карин Гонсалес, занимались компьютерным поиском совпадений последовательностей ДНК: это было похоже на исследования, опубликованные Мохикой годом ранее. Но на этот раз CRISPR была не приманкой, а наградой. Экхерт и Гонсалес искали в S. pyogenes гены малых РНК (молекулы РНК, которые не транслируются в белки). Чаще всего они сталкивались с ранее неизвестной трансактивирующей крРНК (tracrRNA). Ген, кодирующий эту tracrRNA, находился в непосредственной близости от группы последовательностей CRISPR, хотя значение такого расположения было непонятным. Основной интерес Шарпантье составлял не CRISPR или бактериальный иммунитет, а ее tracrRNA, которая была чем-то особенным. Она-то и окажется важной частью головоломки по редактированию генома.

В 2008 г. Шарпантье решила завершить работу в Вене и переехать в глубинку Северной Швеции, в Университет Умео. Климат этого региона суров, зато Шарпантье прониклась симпатией к сотрудникам лаборатории медицины молекулярных инфекций Швеции. Она сосредоточилась на tracrRNA, сотрудничая с немецким биохимиком Йоргом Фогелем и планируя эксперименты во время полетов из Швеции в Германию и обратно.

В следующем году ее группа установила связь между системой CRISPR-Cas9 и tracrRNA. «Это был простой эксперимент», – вспоминает она. Когда они отключили tracrRNA, то обнаружили, что не произошло синтеза крРНА, и наоборот. Логичный вывод заключался в том, что Cas9 формирует физический комплекс с этими двумя молекулами РНК. Когда команда Шарпантье сравнила последовательности tracrRNA ряда бактерий, они обнаружили одну общую черту: ею была последовательность, которая образовывала дуплекс с крРНК. В то время как другие исследовательские группы описывали более сложные типы систем CRISPR, прелестью системы второго типа у S. pyogenes было то, что наряду с крРНК для вирусной интерференции требовался лишь один ген – Cas9. А тут их стало три. Шарпантье и Фогель добавили третий компонент – tracrRNA. «Да, это очень важный компонент, поскольку Cas9 является ферментом, управляемым двумя видами РНК», – говорит она[150]150
  K. Davies and E. Charpentier, «Finding Her Niche: An Interview with Emmanuelle Charpentier,» The CRISPR Journal 2, (2019):17–22, https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/crispr.2019.29042.kda


[Закрыть].

В сентябре 2010 г. Шарпантье представила в Nature свою проработанную до мельчайших деталей статью об открытии tracrRNA и месяц спустя отправилась в Нидерланды, чтобы выступить с докладом на ежегодной конференции, посвященной CRISPR, в которой к тому времени уже участвовало около двух сотен приверженцев этой технологии. Лишь немногие из клуба CRISPR знали о французской ученой, работающей в Швеции с коллегами из Австрии и Германии. Но теперь, с улыбкой вспоминает Шарпантье, «они открыли знаменитую tracrRNA». На тот момент это была вершина карьеры Шарпантье. «Все пионеры этой области подошли ко мне пожать руку и сказать: „Думаю, это сенсация!“». Из выдающихся людей отсутствовала в тот день лишь Дудна, но она еще не была поглощена исследованием CRISPR.

В своей статье, опубликованной в Nature в начале 2011 г., Шарпантье наметила следующий этап своих исследований. Она набросала план, отправляясь на предстоящую конференцию. Ей нужен был специалист по биохимии РНК и структурной биологии. «Я очень хотела подойти к Дженнифер и спросить ее, не хотела бы она расшифровать структуру Cas9»[151]151
  Из того же источника.


[Закрыть].

Глава 5
Хирургия ДНК

В марте 2011 г. Дудна и Шарпантье впервые встретились на небольшой конференции, проводившейся в отеле InterContinental San Juan в Пуэрто-Рико, организованной Американским обществом микробиологов. Темой была «РНК-регуляция в бактериях». После того как обе женщины выступили со своими докладами, Шарпантье предложила Дженнифер прогуляться по историческому району Сан-Хуан. В каком-то смысле они были противоположностями: высокая блондинка и небольшого роста брюнетка. Шарпантье во многих отношениях была более молодым ученым: на пять лет моложе, она обладала относительно скромным списком публикаций, работая в отдаленном шведском университете. Дудна, напротив, прошла обучение у двух нобелевских лауреатов, вела полноценную профессорскую деятельность и уже почти пятнадцать лет участвовала в исследованиях Медицинского института Говарда Хьюза. Кроме того, она была автором почти двадцати статей, опубликованных в трех ведущих научных журналах; Шарпантье публиковали пока только дважды.

Пока они гуляли по мощеным улочкам, Шарпантье, будучи руководителем группы, поделилась результатами работы, которые должны будут скоро появиться впервые на страницах Nature. В ее лаборатории работали студентка магистратуры Елица Дельчева и польский аспирант Кшиштоф Хилински[152]152
  E. Deltcheva et al., «CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III,» Nature 471, (2011): 602–607, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3070239/.


[Закрыть]. После многих лет упорного труда Шарпантье определила ключевую роль tracrRNA в механизме защиты от вирусов на основе CRISPR. Теперь ей требовалась помощь в определении роли Cas9 в S. pyogenes, и она предложила сотрудничество. Шарпантье уже обнаружила несколько различных белков Cas9 в разных бактериях, но они всегда работали вместе с дуплексом молекул РНК – крРНК, соответствующим последовательности спейсера, и tracrRNA. Определение трехмерной структуры фермента имело решающее значение, поскольку «если бы потребовалось применить систему на практике, то структурная биология могла бы подсказать, как укоротить белки и провести белковую инженерию». Несомненно, это было по части Дудны.

Ученые поладили. «Мне очень понравилась Эмманюэль, – вспоминает Дудна. – Мне по душе было ее рвение. Мне это тоже свойственно, если я действительно сосредоточена на проблеме. Поэтому я тогда почувствовала, что мы единомышленники»[153]153
  Jennifer Kahn, «The Crispr Quandary,» The New York Times Magazine, November 9, 2015, https://www.nytimes.com/2015/11/15/magazine/the-crispr-quandary.html.


[Закрыть]. К тому времени Дудна уже опубликовала свои первые статьи о CRISPR.

Вернувшись в Беркли, Дудна убедила Мартина Джинека работать вместе с лабораторией Шарпантье над проектом, посвященным Cas9. Джинек начал общаться по Skype с Хилински, аспирантом, который остался без постоянной должности в Вене, после того как Шарпантье получила должность руководителя шведской группы. Хотя они могли разговаривать на чем-то вроде польского языка – Джинек выучил его в детстве, когда смотрел польское телевидение, – ученые в основном общались на английском.

Лаборатория Шарпантье попробовала выделить Cas9, «но это не получалось», рассказывает Джинек. После договоренностей в Пуэрто-Рико решение о сотрудничестве было закреплено во время посещения Шарпантье конференции по CRISPR, состоявшейся в Университете Беркли в 2011 г. Команды запечатлели свой союз на групповой фотографии, сделанной на ступенях Стэнли-холла на восточной окраине кампуса, где располагалась лаборатория Дудны. Все в джинсах, Джинек – в центре группы, Шарпантье и Дудна – справа от него, Хилински и Инес Фонфара (постдок Шарпантье) – слева. Они были похожи на кантри-квинтет, позирующий для обложки своего дебютного альбома, который скоро должен стать платиновым[154]154
  K. Davies and M. Jínek, «The CRISPR-RNA World: An Interview with Martin Jínek,» The CRISPR Journal 3, (2020): 68–72, https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/crispr.2020.29091.mji.


[Закрыть].

Первой задачей было выделить достаточное количество белка Cas9, чтобы получить кристаллы для рентгеноструктурного анализа. На этом этапе Джинека интересовало не столько редактирование генома, сколько понимание молекулярной работы Cas9. «Это система, которая использует направляющие РНК, но, скорее всего, воздействует на ДНК, – говорит он. – Это похоже на РНК-интерференцию, но мишень – не РНК». Это только усилило интерес Джинека к доказательству того, что Cas9, управляемый РНК, служит ферментом для разрезания ДНК. Возможно, это не новость для заголовков газет, но это стало бы впечатляющим завершением его стипендии постдока перед возвращением в Европу.

Вместе со студентом летней практики Джинек выделил Cas9 из образцов S. pyogenes, присланных из Европы. Уилсон вспоминает, что Джинек тогда был довольно скрытным. Он присвоил драгоценной плазмидной ДНК Cas9 непонятное название MJ923. «Так он вел учетную запись в лабораторном журнале до тех пор, пока не почувствовал, что стало безопасно об этом говорить», – вспоминает Уилсон. Первый эксперимент Джинека по воздействию на ДНК с использованием лишь крРНК провалился. Все изменилось, когда Джинек добавил в смесь tracrRNA.

Прорыв Джинека – он вряд ли бы позволил использовать такое сильное слово – заключался в соединении крРНК и tracrRNA, необходимых для воздействия на ген, в единую химерную молекулу РНК. «На самом деле это была довольно стандартная процедура», – объясняет Джинек. Будучи биохимиком, он всегда пытался упростить систему реакции, стараясь свести число ее компонентов к минимуму. Если обе РНК были частью дуплекса, то, предположительно, их концы должны находиться в непосредственной близости друг от друга. «Тогда вы можете сшить их вместе с помощью петли», – рассказывает Джинек. Такие генно-инженерные трюки были не редкостью в лаборатории Дудны. Например, добавление или удаление основания на конце молекулы РНК может резко изменить ее способность образовывать кристаллы. Джинек обнаружил, что он может обрезать крРНК на одном конце и подобным образом уменьшить tracrRNA. Однако ему необходимо было поддерживать определенную степень спаривания оснований между ними.

Джинек скромно описывает момент истины: «Мы с Дженнифер проводили мозговой штурм». Но затем объясняет, что, говоря «мы с Дженнифер», он подразумевал себя. Когда он нарисовал элементы CRISPR на доске в кабинете Дудны, они почувствовали, что, образовав единую молекулу направляющей РНК (sgRNA, от англ. single guide RNA) путем синтетического слияния основных молекул РНК, они, по сути, смогут запрограммировать любую направляющую последовательность. Другими словами, у них появилась возможность определять любой интересующий ген и воздействовать на него, а не только на встречающиеся в природе последовательности вирусов. Все, что требовалось, – это разработать специальную последовательность РНК примерно из двадцати оснований, которая бы соответствовала желаемой целевой последовательности. Дудна вспоминает, что это был «преобразующий» момент, хотя, когда она упомянула об этом нескольким коллегам из Беркли, они не могли понять, из-за чего весь сыр-бор[155]155
  Jennifer Doudna, «Why genome editing will change our lives,» Financial Times, March 14, 2018, https://www.ft.com/content/582d382c-2647–11e8-b27e-cc62a39d57a0.


[Закрыть]. «После этого к нам сразу присоединились Кшиштоф и Эмманюэль», – вспоминает Джинек.

Джинеку понадобилось несколько недель, чтобы создать химерные РНК, и он быстро показал, что система sgRNA могла разрезать ДНК соответствующей последовательности. Внезапно CRISPR стала еще одной технологией редактирования генов, находясь в одном наборе инструментов с TALEN и ZFN. После этого все закрутилось. Джинек представил свои результаты на лабораторном семинаре – еженедельной встрече, на которой студенты и постдоки Дудны по очереди делали доклады о своих результатах. По словам Уилсона, рассказ Джинека о sgRNA не вызвал особенного восторга, но он помнит, что спросил, могут ли они использовать этот метод для РНК-интерференции. Дудна ответила: «Мы можем это использовать для чего-то и поважнее, например для геномного редактирования».

В июне 2012 г. Джинек и Хилински представили свое открытие на ежегодной конференции по CRISPR, которая проходила в Университете Беркли. Шикшнис сделал доклад о своих неопубликованных результатах, которые тоже подтверждали, что Cas9 был ферментом, разрезающим ДНК. Общее впечатление «не было революционным», говорит Уилсон, возможно, потому, что не было открытого упоминания редактирования генов. Однако Джинек почувствовал растущее возбуждение. Область CRISPR, ранее малоизвестное направление молекулярной биологии, была готова перейти в разряд передовых биотехнологий.

8 июня 2012 г. Дудна отправила свою статью в Science. Джинек и Хилински были совместно отмечены как ведущие исполнители, в то время как имена Дудны и Шарпантье завершили список авторов (стандартное правило в естественных науках, подобно тому как спонсоры и режиссеры упоминаются в начальных титрах фильма). Обе были указаны как соавторы с равными правами. Редакторы Science действовали быстро, одобрив рукопись всего за двенадцать дней и опубликовав статью в электронном виде через двадцать дней после ее подачи[156]156
  M. Jínek et al., «A programmable dual-RNA – guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity,» Science 337, (2012): 816–821, https://science.sciencemag.org/content/337/6096/816/tab-article-info.


[Закрыть].

Статья в Science показала, что систему CRISPR-Cas9 можно было настроить так, что она будет способна расщеплять по выбору практически любую заданную последовательность ДНК в пробирке. Синтетическая sgRNA позволит любому исследователю адаптировать систему под свои собственные задачи. Демонстрируя достаточную сдержанность, Дудна и Шарпантье закончили утверждением, что CRISPR показывал «значительный потенциал в применении направленного воздействия на ген и редактирования генома». Для того момента это было равнозначно дразнящей недосказанности Уотсона и Крика в 1953 г.: «От нашего внимания не ускользнуло, что определенный принцип образования пар [оснований], который мы постулировали, сразу же указывает на возможный механизм копирования генетического материала».

Авторы тщательно подбирали слова, поскольку эти эксперименты ограничивались бактериальной ДНК – команда не показала, что CRISPR-Cas9 будет работать в клетках растений или животных, включая человека. Независимо от того, было ли это формальностью – кишечная палочка E. coli имеет ту же спиральную химическую молекулу, что и ДНК H. sapiens, – или серьезной технической проблемой, если учесть дополнительную биохимическую сложность клеточного ядра человека и других высших организмов, это был вопрос на миллион.

Пресс-служба Калифорнийского университета в Беркли подготовила пресс-релиз, чтобы подчеркнуть значение статьи Дудны. Этот релиз провозгласил «потенциально большие последствия для таких направлений, как биотопливо и лекарства, поскольку генетически модифицированные микроорганизмы, такие как бактерии и грибы, будут играть ключевую роль в экологически чистом производстве этих и других ценных химических продуктов»[157]157
  DOE/Lawrence Berkeley National Laboratory, «Programmable DNA scissors found for bacterial immune system,» Science Daily, June 28, 2012, https://www.sciencedaily.com/releases/2012/06/120628193020.htm.


[Закрыть]. Но в этом эффектном релизе не было упоминания ни о каком клиническом применении этой технологии на людях, так как это выходило далеко за рамки статьи.

На просьбу высказаться об изобретении «программируемых ножниц для ДНК» Дудна дала комментарий, который свидетельствовал об искренности и нежелании авторов работы преувеличивать результат. «Мы обнаружили механизм, лежащий в основе РНК-управляемого расщепления двухцепочечной ДНК, который играет центральную роль в системе приобретенного бактериального иммунитета, – сказала она. – Наши результаты могут предоставить специалистам по генной инженерии новую и многообещающую альтернативу искусственным ферментам для воздействия на геном и его редактирования у бактерий и в других типах клеток». Также она добавила: «Хотя мы еще не показали само редактирование генома, с учетом описанного нами механизма теперь это вполне реальная возможность».

Несмотря на освещение статьи в средствах массовой информации, она не вызвала большого интереса за пределами научного сообщества. Газета The New York Times не считала нужным опубликовать информацию о CRISPR до 2014 г.[158]158
  A. Pollack, «A powerful new way to edit DNA,» The New York Times, March 3, 2014, https://www.nytimes.com/2014/03/04/health/a-powerful-new-way-to-edit-dna.html.


[Закрыть] Газета San Francisco Chronicle родного города Дудны также воздерживалась[159]159
  S. M. Lee, «Editing DNA could be genetic medicine breakthrough,» San Francisco Chronicle, September 7, 2014, https://www.sfchronicle.com/technology/article/Editing-DNA-could-be-genetic-medicine-breakthrough-5740320.php.


[Закрыть]. Однако у посвященных лиц столкновение миров CRISPR и генной инженерии вызвало неподдельный интерес. Стэн Броунс назвал Cas9 «швейцарским армейским ножом иммунитета»[160]160
  S. J. J. Brouns, «A Swiss Army Knife of Immunity,» Science 337, (2012): 808–809, https://science.sciencemag.org/content/337/6096/808.


[Закрыть]. Федор Урнов, который придумал термин «редактирование генома», не сомневался в том, что статья Дудны – Шарпантье займет достойное место в научной литературе. «Я никогда не забуду, как читал последний абзац… – Он делает паузу, пытаясь подобрать нужные слова, подобно тому как нуклеаза выбирает направляющую РНК. – Бессмертный – это громкое слово, и я буду использовать его осторожно: последний абзац БЕССМЕРТНОЙ статьи Science, в которой они описали, что работой Cas9 можно управлять»[161]161
  Fyodor Urnov in Human Nature (2019), https://wondercollaborative.org/human-nature-documentary-film/.


[Закрыть].

Но главный вопрос заключался в следующем: может ли бактериальный фермент, которому сотни миллионов лет, совершить огромный эволюционный скачок и найти свою ДНК-мишень в чужеродном окружении ядра эукариотической клетки? ДНК человека может иметь тот же четырехбуквенный алфавит, что и бактериальный или вирусный геном, но в своей естественной среде двойная спираль эукариотических клеток намотана, связана и закручена на белковые катушки, как садовый шланг, образуя структуру, которая называется хроматином. Никто не знал наверняка, как с ним обойдется Cas9.

По этому поводу высказались два эксперта. Баррангу заявил, что возможность использования системы CRISPR-Cas для редактирования генома в клетках человека, растения и других сложных организмов зависят от того, смогут ли молекулярные ножницы разрезать хроматин. «Только будущее покажет, сможет ли этот программируемый молекулярный скальпель превзойти ДНК-ножницы технологий ZFN и TALEN в области точной геномной хирургии», – писал он[162]162
  R. Barrangou, «RNA-mediated programmable DNA cleavage,» Nature Biotechnology 30, (2012): 836–868, https://www.nature.com/articles/nbt.2357.


[Закрыть]. Позже он поведал: «2012 год был не о редактировании генома… Он был о технологии CRISPR-Cas9, технологии одной направляющей»[163]163
  Rodolphe Barrangou, interview, Victoria, Canada, February 21, 2019.


[Закрыть].