Текст книги "Редактируя человечество: Революция CRISPR и новая эра изменения генома"

Разрезание ДНК при помощи CRISPR. 1. Сканирование: нуклеаза Cas9 связывается с направляющей РНК, образуя рибонуклеопротеидный комплекс. Направляющая состоит из крРНК и трансактивирующей крРНК. Комплекс Cas9 сканирует ДНК в поисках последовательности PAM, которая служит первичным сигналом для проверки совпадения последовательностей. 2. Сцепление: Cas9 связывается с ДНК и расщепляет двойную спираль, позволяя крРНК комплементарно (взаимодополняюще) присоединиться к одной нити ДНК. 3. Разрезание: если ДНК и РНК полностью совпадают, Cas9 претерпевает конформационное изменение, в результате чего обе нити ДНК разрезаются в одном и том же месте. (По материалам пункта 23 примечаний.)

Клетки обладают множеством молекулярных механизмов восстановления разрывов и других мутаций в ДНК. Если бы их не было, нас бы не было в живых. Два наиболее известных механизма называются негомологичным соединением концов (NHEJ) и гомологически направленной репарацией (HDR). NHEJ небрежно сшивает вместе разорванные концы ДНК, что часто приводит к небольшим вставкам или делециям генетического текста в месте восстановления. Это идеально подходит для исследователей, использующих CRISPR для преднамеренного нарушения функции гена путем его нарушения с помощью добавления случайных вставок и делеций. Другой механизм, HDR, при наличии подходящей матрицы производит надежное восстановление. В нормальных условиях матрицей является соответствующий ген на сестринской хромосоме. Прелесть редактирования генома при помощи CRISPR заключается в том, что исследователь может предоставить подходящую матрицу, содержащую желаемую последовательность для восстановления разрыва, вызванного Cas9, что приводит к нужному изменению в определенном месте молекулы ДНК[83]83
  Это никогда не станет популярным, но Патрик Харрисон, генетик из Тринити-колледжа в Дублине, предложил по-другому расшифровать CRISPR – как мнемокод, объясняющий процесс редактирования/восстановления: Cut-Resect-Invade-Synthesis-Proofread-Repair (Разрез-удаление-вставка-синтез-проверка-восстановление). На передаче Last week Tonight комик Джон Оливер предложил свое собственное, более дерзкое определение: Crunchy-Rectums-In-Sassy-Pink-Ray-Bans (Хрустящая-прямая кишка-в-стильных-розовых-солнцезащитных-очках).


[Закрыть][84]84
  P. T. Harrison and S. Hart, «A beginner's guide to gene editing,» Experimental Physiology 103, (2018): 439–448, https://physoc.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1113/EP086047.


[Закрыть].

В январе 2020 г. около пятисот ученых собрались в Банфе, горнолыжном курорте на юге канадских Скалистых гор, чтобы провести первую большую конференцию года, посвященную CRISPR. (Она также оказалась и последней, поскольку пандемия COVID-19 лишила желающих возможности ездить на подобные мероприятия.) Организаторы пригласили Дудну выступить с речью на открытии, состоявшемся воскресным утром, – к этой роли она уже привыкла. Она начала с искренних извинений за то, что не сможет остаться и пообщаться с участниками в течение следующих нескольких дней, поскольку ей было необходимо вернуться в Беркли, чтобы в понедельник утром прочитать лекцию для шестисот студентов.

Лекция Дудны, прочитанная с той же скромностью и почтением перед наукой, что были ей свойственны в начале карьеры более трех десятилетий назад, служила биотехнологическим эквивалентом обращения президента США к конгрессу о положении в стране. Основная мысль ее вступительной речи – дани уважения не только ее собственной работе, но и труду множества исследователей за предыдущую четверть века – была простой:

«Прецизионное редактирование генома осуществимо»[85]85
  Jennifer Doudna, Keystone Symposium, Banff, Canada, February 9, 2020.


[Закрыть].

Глава 3
Мы можем быть героями

У великих моментов в истории науки и технологий может быть самая неожиданная завязка. В 1966 г. Playtex, компания, создавшая культовый бюстгальтер Cross Your Heart, приняла участие в конкурсе NASA по разработке скафандра для первой высадки «Аполлона» на Луну. Костюмы должны были выдерживать давление и резкие перепады температур. Кроме того, они должны были обладать гибкостью – свойством, которое Playtex продемонстрировала, засняв, как один из технических специалистов компании часами играет в американский футбол в скафандре. В результате четыре швеи Playtex сшили двадцатислойный скафандр A7L, в котором Нил Армстронг прошелся по лунному подиуму[86]86
  Fyodor Urnov, «Genome Engineering,» Keystone Symposium, Victoria Island, Canada, February 21, 2019.


[Закрыть].

Перенесемся от Моря Спокойствия на Луне к солончакам Санта-Полы у Средиземного моря. Я нахожусь в Аликанте, популярном туристическом курорте на побережье Коста-Бланка на юго-востоке Испании. Вряд ли можно сказать, что здесь самая экстремальная среда обитания на Земле. Однако, проехав примерно двадцать километров на юг, вы доберетесь до Салинас-де-Санта-Пола. Соляные озера, или солончаки, как следует из названия, представляют собой сеть прямоугольных лагун с экстремально высокой концентрацией соли, получившейся в результате сильного воздействия солнца и ветра. По периметру, где вода встречается с сушей, соль кристаллизуется, образуя твердую белую полосу, похожую на идеальный край бокала с коктейлем «Маргарита».

Это место имеет экологическое, историческое и коммерческое значение. Здесь живут фламинго и другие виды животных. Сторожевая башня, построенная в XVI в., служила подданным короля Филиппе II: отсюда они вели наблюдение за маврами. Это место похоже на заповедник, но на самом деле – это промышленная соляная шахта. В каждом озере размером с футбольное поле постоянно концентрируется соль. Сегодня Bras del Port добывает ежедневно из Средиземного моря в среднем около 4000 тонн соли. Горы соли готовы для отправки: около 60 % пойдет на очистку воды, остальное – в пищу.

Для Франсиско Мохики, микробиолога из Университета Аликанте, изучение галофильных организмов, которые процветают в этой своеобразной среде обитания, составляет особую страсть. Там, где он когда-то трудился в безвестности, сегодня изо всех сил стараются избежать внимания СМИ. В 2017 г. ведущая испанская газета El País высказала предположение, что однажды Мохика переберется из солончаков в нобелевские спа-курорты.

Мохика любезно согласился довезти меня на своем неброском Volkswagen Passat до Салинас. Этот путь он проделывает довольно часто, обычно в компании фотографов или съемочных групп, которые просят его изобразить, как он осматривает чистые розовые воды или смотрит сквозь стеклянную емкость с соленой водой на солнце, как в первый раз, будто любуясь бокалом риохи. По счастливому стечению обстоятельств Мохика никогда не собирал образцы для своих собственных исследований, поскольку во времена, когда он был молодым аспирантом, в лаборатории уже имелась груда материалов, собранных его руководителем за предыдущие десять лет.

Впервые Мохика попал на солончаки после того, как закончил военную службу в 1989 г. Он искал работу в качестве научного сотрудника, и вскоре ему предложили должность на кафедре микробиологии местного университета в лаборатории, изучающей микроорганизм под названием «галоферакс». «Меня не особенно интересовали эти организмы. Мой руководитель сам решил вопрос с моей диссертацией», – сообщил он, пока мы гуляли по соляным озерам[87]87
  Francisco Mojica, interview, Santa Pola, Spain, May 1, 2018.


[Закрыть].

Галоферакс – это не бактерией (хотя раньше его ошибочно называли Halobacterium), но принадлежит к особой группе одноклеточных организмов – археям. Невооруженным глазом эти два таксона трудно отличить друг от друга. Но это не согласуется с эволюционной пропастью продолжительностью около трех миллиардов лет. Признание того, что археи – это не просто ответвление от прокариот, но совершенно отдельный «третий домен» живых существ, является результатом плодотворной работы биолога-эволюциониста Карла Вёзе. Секвенирование ДНК выявило поразительные генетические различия между археями и бактериями, подобно тому как операционная система Windows отличается от macОS. Об этом удачно сказал Эд Йонг: «Это все равно, что мы смотрим на карту мира, а Вёзе вежливо объясняет, что треть ее еще не развернули»[88]88
  Ed Yong, «The Unique Merger That Made You (and Ewe, and Yew),» Nautilus, February 6, 2014, http://nautil.us/issue/10/mergers-acquisitions/the-unique-merger-that-made-you-and-ewe-and-yew.


[Закрыть].

Вода выглядит розовой, а соленые корки лагун усыпаны розовато-красными полосами, где кишит микроскопическая жизнь. Красноватый оттенок связан с выработкой каротиноидов – это часть механизма защиты микробов от соли и солнечного света. «Как будто солнцезащитный крем», – смеется Мохика. Цвет меняется в зависимости от степени солености: красный становится розовым при повышении концентрации соли от 10 до 30 %. Те же химические соединения придают оперению фламинго их фирменный розовый оттенок, поскольку они питаются крошечными солоноводными креветками, которые, как и Haloferax, обитают в этих соленых водах в огромном количестве.

Любящие соль археи Аликанте по определению являются экстремофилами – формами жизни, приспособленными для жизни в необычайно суровых условиях, будь то подводные вулканические источники, выжженные пустыни или замерзшая тундра. Для галоферакса концентрации соли в обычной морской воде просто недостаточно. Чтобы жить и развиваться, ему требуется соли в десять раз больше. Воспроизвести подобные условия в лаборатории чрезвычайно трудно, поэтому эти организмы остаются малоизученными по сравнению со своими дальними бактериальными родственниками. Два основных вида галоферакса – это H. mediterranei и H. volcanii (вторые названы так не потому, что они перепутали соляное озеро с кратером вулкана, а в честь открывшего их израильского ученого Бенджамина Вулкани). Я также чувствую присутствие анаэробных бактерий, благодаря сильному сернистому запаху, распространяющемуся над водой.

Одержимость Мохики солелюбивыми микроорганизмами Санта-Полы привела к впечатляющим результатам в его фундаментальных исследованиях. «Это получение знаний через познание, чтобы расширить знания», – говорит он[89]89
  Manuel Ansede, «Francis Mojica, de las salinas a la quiniela del Nobel,» El País, May 18, 2017, https://elpais.com/elpais/2017/05/18/eps/1495058731_149505.html.


[Закрыть]. По мнению Мохики, ключ к загадке любви галофераксов к соли должен заключаться в их кольцевой молекуле ДНК. Это стало ясно не сразу: первая полная последовательность генома микроорганизма была получена только в 1995 г. группой Клэр Фрейзер и Крейга Вентера, которые также первыми расшифровали полный геном архей двумя годами позже. Лаборатория Мохики не была богатым центром геномных исследований с новейшим оборудованием для секвенирования ДНК. В начале 1990-х для многих ученых секвенирование оставалось обременительным ручным процессом, включавшим в себя заливку большого пласта геля между двумя стеклянными пластинами и последующее разделение радиоактивных фрагментов ДНК по размеру с помощью электрического тока. По полученному изображению лэддера (от англ. ladder – «лестница») на чувствительной рентгеновской пленке Мохика мог «читать» последовательность ДНК.

Во время одной из своих первых попыток секвенирования в августе 1992 г. Мохика увидел нечто настолько удивительное, что решил, что все сделал неправильно. Он получил странные повторяющиеся последовательности, каждую длиной около 30 оснований, что он, как и положено, указал в своей первой статье[90]90
  F. J. M. Mojica et al., Transcription at different salinities of Haloferax mediterranei sequences adjacent to partially modified PstI sites. Molecular Microbiology 9, (1993): 613–621.


[Закрыть]. «Нам просто повезло, – заметил он после секвенирования менее 1 % генома галоферакса. – Это была первая статья, где к CRISPR отнеслись серьезно»[91]91
  Термин CRISPR был введен только в 2001 г. Хотя истинного значения открытия Мохики, сделанного в 1993 г., в то время еще не понимали, через 25 лет эта дата будет увековечена на киноэкранах IMAX по всему миру в качестве вступительных титров фильма «Рэмпейдж».


[Закрыть]. Мохика также обнаружил, что эти повторы, к удивлению, транскрибируются в РНК, что позволяет предположить наличие у них какой-то функции.

«Когда вы видите что-то необычное, у вас нет другого выхода, кроме как исследовать это. Я подумал, что над этим хорошо было бы продолжить работу», – говорит он, пока мы продолжаем прогулку по солончакам. Он догадывался, что загадочные повторы могут быть как-то связаны с адаптацией к концентрации соли, возможно за счет изменения их конфигурации, а следовательно, активности генов, при регистрации колебаний осмотического давления клетки. «В то время суперспирализация [ДНК] была ответом на все вопросы, связанные с регуляцией экспрессии генов!» Это была хорошая гипотеза, но неверная[92]92
  Повторы CRISPR не имеют ничего общего с адаптацией к солености. «Это все еще загадка!» – говорит Мохика. Пока он не получил финансирования для дальнейшего изучения вопроса.


[Закрыть].

Работая в университетской библиотеке в неурочное время, Мохика в конце концов обнаружил статью японских ученых за 1987 г. В ней Ацуо Наката и Йосизуми Исино[93]93
  Йосизуми Исино – профессор Университета Кюсю. Он изучает репарацию ДНК у термофильных архей и ищет новые CRISPR.


[Закрыть] из Университета Осаки описали аналогичный повторяющийся мотив в геноме E. coli. Секвенируя исследуемый ген, японская группа заметила необычную соседнюю последовательность с характерными повторами, похожими на круги на полях, вырезанные на поверхности ДНК. Этот участок состоял из серии (кластера) коротких повторов палиндромной последовательности (читающихся одинаково в прямом и обратном направлении). Повторы, состоящие из двадцати девяти букв, были отделены друг от друга отрезком уникальной последовательности из тридцати двух оснований (спейсерами). Однако, поскольку никто до этого не видел ничего подобного и ничто не говорило об их биологической функции, исследователи не придали этому значения. Команда, как положено, описала и опубликовала свои наблюдения, которые в то время не привлекли к себе внимания[94]94
  Y. Ishino et al., «Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product,» Journal of Bacteriology 169, (1987): 5429–5433, https://jb.asm.org/content/jb/169/12/5429.full.pdf.


[Закрыть].

Два года спустя[95]95
  F. J. M. Mojica et al., «Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning,» Molecular Microbiology 17, (1995): 85–93, DOI: 10.1111/j.1365–2958.1995.mmi_17010085.x.


[Закрыть] Мохика описал короткую последовательность, повторяющуюся сотни раз в тандемном повторе, охватывающем более 1000 оснований. Между каждой парой таких повторов была уникальная последовательность ДНК с неизвестной функцией. Руководитель Мохики предложил назвать эти повторы, которые также наблюдались у другого экстремофила – архей, любящих вулканы, TREP (от англ. tandem repeats – «тандемные повторы»). Несомненно, должна быть причина, по которой до 2 % драгоценной, компактной ДНК прокариот выделено под эти странные повторы. «Микроорганизмы не могут позволить себе такую роскошь, – думал Мохика. – Они должны выполнять важную функцию»[96]96
  Clara Rodriguez Fernandez, «Interview with Francis Mojica, the Spanish scientist that [sic] discovered CRISPR,» Labiotech, November 13, 2017, https://labiotech.eu/francis-mojica-crispr-interview/.


[Закрыть].

Другие ученые тоже сталкивались с такими повторами. Немецкий микробиолог Бернд Мазеполь ломал голову над фрагментом ДНК с тринадцатью повторами, найденным в цианобактериях, который он назвал LTRR, что означает «длинное тандемно повторяющееся повторение» (от англ. long tandemly repeated repetitive). Однако, сосредоточившись на этих участках ДНК, Мазеполь не обратил внимания на уникальные последовательности, расположенные между ними[97]97
  B. Masepohl et al., «Long tandemly repeated repetitive (LTRR) sequences in the filamentous cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120,» Biochimica et Biophysica Acta 1307, (1996): 26–30, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0167478196000401.


[Закрыть]. Другая команда также была близка к разгадке тайны повторов ДНК. В 2002 г. Евгений Кунин, российский специалист по вычислительной биологии из Национального центра биотехнологической информации при Национальном институте здравоохранения США, и его коллега Кира Макарова описали серию бактериальных генов, которые, как они подозревали, входят в систему репарации ДНК[98]98
  K. S. Makarova et al., «A DNA repair system specific for thermophilic Archaea and bacteria predicted by genomic context analysis,» Nucleic Acids Research 30, (2002): 482–496, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC99818/.


[Закрыть]. Вот только они не поняли, что эти гены располагались рядом с участком CRISPR и, как мы вскоре увидим, играли важную роль в работе CRISPR и в редактировании генов.

После нескольких лет работы в Оксфордском университете Мохика вернулся в Аликанте в 1997 г., чтобы собрать собственную научную группу. Получив небольшое финансирование, Мохика попытался провести несколько недорогих экспериментов, «хотя и понятия не имел о биоинформатике». Вопрос, который не давал покоя, касался происхождения спейсерной ДНК – последовательностей, вкрапленных между повторами. «Искать по базам данных и ждать, когда хоть что-нибудь найдется, несложно, но мы ничего не получали – до 2003 г.». К тому времени базы данных последовательностей ДНК были переполнены геномами бактерий и архей, многие из которых содержали версии этих повторов.

В 2000 г. Мохика переименовал объект своей одержимости в SRSR (от англ. short regularly spaced repeats – «короткие регулярно расположенные повторы»). Это название просуществовало недолго. Позже он обменялся электронными письмами с Руудом Янсеном из Нидерландов, который изучал семейство генов, примыкающих к загадочным повторам. Янсен чувствовал необходимость обозначить открытие как-то иначе, поэтому Мохика предложил CRISPR. 21 ноября 2001 г. Янсен ответил ему, восторженно выразив свое одобрение:

Дорогой Франсис,

Какая замечательная аббревиатура – CRISPR! Я считаю, что каждая буква, которой не хватало в других версиях, делала их менее «хрустящими», поэтому я предпочитаю более энергичный CRISPR, а не SRSR и SPIDR[99]99
  K. Davies and F. Mojica, «Crazy About CRISPR: An Interview with Francisco Mojica,» The CRISPR Journal 1, (2018): 29–33, https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/crispr.2017.28999.int.12.


[Закрыть].

У CRISPR наконец-то появилось название, как и у группы необычных генов, которые, казалось, были связаны с элементами CRISPR. Янсен разумно, хотя и без всякого воображения, назвал их Cas (от англ. CRISPR-associated – «связанные с CRISPR»). В то время Мохика был все еще сосредоточен на изучении любопытных спейсеров CRISPR.

В конце концов прорыв был совершен красивым вечером в августе 2003 г. Мохика проводил со своей женой отпуск недалеко от дома, около соляных озер. Из-за жары Мохика нашел повод вернуться в лабораторию, оборудованную кондиционером, где он мог провести еще несколько компьютерных поисков. Это было обычным делом, почти как в видеоигре: Мохика копировал последовательность одного из загадочных спейсеров и вводил ее в компьютерную программу BLAST, которая искала совпадения в огромной базе данных ДНК – GenBank. Мохика запускал этот поиск сотни раз, но безрезультатно. Коллеги говорили, что это пустая трата времени. Но в тот день, к его удивлению, компьютер зафиксировал совпадение. Один конкретный спейсер из E. coli соответствовал участку вирусной ДНК под названием P1, который, что важно, инфицирует эту же бактерию. В течение последующих недель Мохика каталогизировал десятки других совпадений между спейсерами CRISPR и различными вирусами.

В октябре Мохика отправил самую важную статью в своей жизни в ведущий журнал – Nature. «Я помню, что заголовок звучал так: „Повторы прокариот участвуют в работе иммунной системы“. Чтобы убедить редактора и рецензентов, мы написали, что открытие приобретенной иммунной системы прокариот будет иметь огромное значение для биологии и клинических наук. И каков был результат? Нашу работу даже не рассмотрели!»[100]100
  Из того же источника.


[Закрыть]

Возможно, что-то неверно перевели, но редакторы журнала Nature не нашли эту идею концептуальным достижением, «представляющим достаточный общий интерес», которого заслуживают публикации на его престижных страницах. Мохика подал апелляцию, утверждая, что это первое описание бактериальной иммунной системы с функцией памяти. Сотрудники Nature указали, что они готовы пересмотреть свое решение, если им будет предоставлено описание механизма, лежащего в основе этого свойства иммунитета. Однако группа Мохики не смогла найти экспериментального подтверждения гипотезе. Все, что у них было, – это бесспорное доказательство в виде последовательностей. Одна из причин, как оказалось, заключается в том, что CRISPR не работала в наиболее популярном лабораторном материале, E. coli[101]101
  Molly Campbell, «Francisco Mojica: The Modest Microbiologist Who Discovered and Named CRISPR,» Technology Networks, October 14, 2019, https://www.technologynetworks.com/genomics/articles/francis-mojica-the-modest-microbiologist-who-discovered-and-named-crispr-325093.


[Закрыть]. Как если бы у Мохики были уличающие вещественные доказательства, но не было видеозаписи с камер наблюдения.

Мохика зализал раны и подал статью на рассмотрение в другой журнал… и еще в другой. Три журнала, включая Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS), отказались от CRISPR. Каждая задержка публикации увеличивала вероятность, что Мохику обойдут конкуренты. Наконец в октябре 2004 г. он отправил рукопись в малоизвестный журнал, специализирующийся на эволюции. Прошло целых полгода, прежде чем он получил одобрение от редактора. Три месяца спустя его статья была принята в печать. «Эти два года были для меня кошмаром, – рассказывает он. – Когда у вас в руках есть что-то настолько сенсационное и вы отправляете это в очень хорошие журналы – и все они решают, что это недостаточно интересно для публикации, – вы думаете, я что, сумасшедший? или здесь что-то не так?»[102]102
  K. Davies and F. Mojica, «Crazy About CRISPR: An Interview with Francisco Mojica,» The CRISPR Journal 1, (2018): 29–33, https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/crispr.2017.28999.int.


[Закрыть]