Текст книги "Редактируя человечество: Революция CRISPR и новая эра изменения генома"

Домашний кабинет Эдварда Ланфье, бывшего генерального директора и основателя Sangamo BioSciences, располагается в гостевом домике в округе Марин, примерно в шестнадцати километрах к северу от Сан-Франциско. Я останавливаюсь, чтобы полюбоваться вещественными напоминаниями об успешной карьере в биотехнологиях. Помещенный в рамку заголовок первой полосы газеты San Francisco Examiner 1981 г. гласит: «Genentech потрясает Уолл-стрит». На книжной полке – предмет гордости в виде номерного знака (Sangamo), который Ланфье недавно снял со своей машины. Фотография в рамке, на которой изображены Ланфье со своей дочерью в Нью-Йорке у фондовой биржи Nasdaq, когда Sangamo выпустила на рынок акции, а его имя светилось на неоновой вывеске.

Мне не пришлось долго гадать, почему компанию так назвали: основание настольной лампы было сделано из счетчика Sangamo Electric. В 1890-х гг. прадед Ланфье, инженер-электрик, получивший образование в Йельском университете, Роберт Ланфье, был сооснователем компании в округе Сангамон, штат Иллинойс. Ланфье разработал и запатентовал счетчик электроэнергии с известным всем вращающимся элементом[266]266
  http://sangamoncountyhistory.org/wp/?p=1410.


[Закрыть]. Sangamo Electric стала публичной компанией еще до того, как была приобретена Schlumberger в 1975 г. В середине 1990-х Ланфье спросил своего отца, может ли он позаимствовать название и логотип для собственной молодой компании-разработчика.

Ланфье начал карьеру в фармацевтической промышленности в начале 1980-х в компании Eli Lilly, которая к тому моменту только получила лицензию на рекомбинантный инсулин от Genentech. В 1992 г. он присоединился к Somatix – компании, занимавшейся генной терапией «первого поколения». Три года спустя Ланфье запустил Sangamo, и вскоре его стали увлекать возможности использования генных регуляторов для генной терапии.

Нуклеазы типа цинковых пальцев (ZFPs) представляют собой обширный[267]267
  В геноме человека цинк-пальцевые белки кодируются почти 700 генами (3 % от общего числа).


[Закрыть] класс активаторов генов, которые были обнаружены десятью годами ранее нобелевским лауреатом Аароном Клугом, литовским евреем, который эмигрировал в Англию для защиты диссертации и работал с Розалинд Франклин незадолго до ее смерти в 1985 г. Эти факторы транскрипции обладали необычной структурой – серией пальцевидных выступов, непосредственно контактирующих с ДНК. Каждый «палец» состоял примерно из тридцати аминокислот, прикрепленных к «костяшке» за счет атома цинка, связанного с четырьмя аминокислотами. «Цинковый структурный домен» – не очень звучное название, поэтому Клуг придумал для каждого модуля термин «цинковый палец». Дальнейшая работа показала, что каждый «палец» распознает определенную последовательность из трех оснований ДНК, подобно слепому человеку, читающему шрифт Брайля. Таким образом, ДНК-связывающий белок, содержащий три «цинковых пальца», может распознать конкретную последовательность ДНК из девяти оснований.

Первоначальная цель Sangamo состояла в использовании «цинковых пальцев», чтобы включать или выключать определенные гены. Ланфье обратился к ведущим специалистам в этой области, в том числе к Карлу Пабо из Массачусетского технологического института. В Лондоне он сидел возле кабинета Клуга, президента Королевского общества, подобно школьнику, ожидающему директора, прежде чем скрепить решение о партнерстве трехчасовым обедом. После того как Клуг продал свою собственную компанию Gendaq Ланфье в 2001 г., он стал важнейшим советником Sangamo. Правление Sangamo также получило подкрепление в сфере биотехнологий в лице Билла Раттера и Херба Бойера, соучредителей Chiron и Genentech соответственно.

В 2000 г. Ланфье решил оседлать волну изобилия на рынках и выйти на биржу, получив $150 млн на пике раздувшегося пузыря в связи с биотехнологическим подъемом. Чтобы начать эту новую главу, он заманил Вольфа, чтобы тот стал руководителем научного направления. «Это был грандиозный переворот», – вспоминает Ланфье. «Алан был просто чертовой рок-звездой» с энциклопедическими знаниями. «Один из самых гениальных людей, которых я когда-либо знал. Каждый блестящий двадцатилетний постдок – альфа-самец хотел работать под руководством Алана»[268]268
  Ed Lanphier, interview, Ross, California, March 4, 2019.


[Закрыть]. К Урнову присоединился еще один русский экспат, Дмитрий Гущин. Вместе с разработчиком концепции «цинковых пальцев» Эдом Ребаром (из лаборатории Пабо), Майклом Холмсом (из лаборатории Боба Тиджана в Калифорнийском университете Сан-Франциско), Джеффри Миллером и Эндрю Джеймисоном Sangamo собрала команду бесстрашных молодых талантов. Их задача заключалась в том, чтобы превратить Sangamo, по словам Ланфье, «из парового двигателя в двигатель внутреннего сгорания чертовой Ferrari». Самым важным принятым на работу сотрудником стал постдок из Англии Филип Грегори. «Среди невероятно талантливых людей Филип органично возвысился и стал первым среди равных», – сказал Ланфье.

Опыт Вольфа имел решающее значение в создании искусственных факторов транскрипции – белков, которые связываются с конкретными последовательностями ДНК, чтобы включать и выключать гены, благодаря которым развитие клетки может пойти по тому или иному пути. Пабо показал, что путем смешивания и сопоставления «цинковых пальцев», обладающих различными структурами, исследователи способны создать новый гибридный транскрипционный фактор для распознавания определенной последовательности ДНК. К моменту прибытия Урнова в Sangamo уже существовали разработанные белки, содержащие «цинковые пальцы» для того, чтобы доказать, что выбранный подход осуществим, и было все подготовлено для тестирования их эффективности в клетках человека.

Затем, в мае 2001 г., случилась трагедия. Вольф прибыл в Рио-де-Жанейро для участия в конференции, и там во время утренней пробежки его насмерть сбил автобус. «Все крутилось вокруг Алана… а потом его не стало». Пабо, председатель научно-консультативного совета Sangamo, стал руководителем исследовательской группы, пока эту должность два года спустя не занял Грегори.

Когда Sangamo готовилась начать широко использовать в клиниках сконструированный белок, содержащий «цинковые пальцы», для лечения поврежденной нервной ткани у пациентов с диабетом путем включения гена VEGF, пришло известие еще об одной неудаче. Летом 2002 г., всего через несколько месяцев после того, как Ален Фишер и его коллеги опубликовали захватывающие результаты испытаний по генной терапии[269]269
  S. Hacein-Bey-Abina et al., «Sustained Correction of X–Linked Severe Combined Immunodeficiency by Ex Vivo Gene Therapy,» The New England Journal of Medicine 346, (2002): 1185–1193, https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa012616.


[Закрыть], появились сообщения, что у одного из их пациентов развилась лейкемия. Вирус, содержащий терапевтический ген, внедрился в геном пациента и вызвал рак. Как и после трагедии с Джесси Гелсинджером в 1999 г., испытания по генной терапии были приостановлены или прекращены.

К этому времени, однако, для «цинковых пальцев» обнаружилось еще одно возможное применение, дающее возможность не просто заменить ген болезни здоровой копией или включить молчащий ген, а непосредственно отредактировать и исправить ошибку на уровне ДНК. Команда из Университета Джонса Хопкинса разработала способ модифицировать «цинковые пальцы», чтобы воздействовать с их помощью на нужные гены.

В 1978 г. Гамильтон Хэм Смит, биохимик ростом под два метра из Университета Джонса Хопкинса, получил звонок, о котором мечтает почти каждый ученый: ему сообщили, что он получил Нобелевскую премию. Смит, который никогда не чувствовал себя комфортно, взаимодействуя с другими людьми, пережил натиск толпы фотожурналистов и поздравителей, а также сумел справиться с легкой формой синдрома самозванца. Даже его мать удивилась: услышав новость по радио в машине, она повернулась к мужу и сказала: «Я не знала, что в Университете Хопкинса есть еще один Гамильтон Смит»[270]270
  Douglas Birch, «Hamilton Smith's second chance; Scientist's journey; He won the Nobel, but lost his way. Could he put his family together? And could he crack one of life's great puzzles?,» Baltimore Sun, April 11, 1999, https://www.baltimoresun.com/news/bs-xpm-1999–04–11–9904120283-story.html.


[Закрыть].

Нобелевская премия была присуждена Смиту за его случайное открытие эндонуклеаз рестрикции – большого семейства бактериальных ферментов, которые распознают и разрезают определенные последовательности ДНК. Генные инженеры превратили эти ферменты в катализаторы революции в области рекомбинантной ДНК. «Всё в современной биологии – от идеи расшифровки последовательности ДНК до идеи о рекомбинантной ДНК и снятия отпечатков ДНК – всё начинается с рестриктаз», – сказал генетик Дэвид Ботштейн[271]271
  Из того же источника.


[Закрыть]. К середине 1990-х тысячи рестриктаз были описаны и отправлялись по всему миру в полистирольных контейнейрах с сухим льдом как обычные коммерческие продукты. Однако они оказывались малополезны в качестве скальпеля для точного редактирования генов. Эти ферменты разрезают ДНК на очень коротких участках узнавания, обычно состоящих лишь из 4–6 пар оснований. И хотя эти мотивы могут встречаться в геноме вируса лишь несколько раз, они тысячами разбросаны по геному человека.

Смит часто обсуждал идею об искусственных ферментах, которые могли бы быть более избирательными при разрезании ДНК, со своими студентами, в том числе с приглашенным химиком по имени Шринивасан Чандра Чандрасегаран в 1986 г. Спустя годы Чандра решил разработать химерную рестриктазу, новый вид нуклеазы. Просматривая каталог ферментов компании New England Biolabs, Чандра и его коллега Джереми Берг остановились на забавно названном ферменте FokI, выделенном из Flavobacterium okeanokoites. Подобно тому как космический истребитель из «Звездных войн» нацеливается на горячие выхлопные газы, FokI сканирует ДНК в поисках определенной метки – последовательности из пяти оснований, GGATG. Но как только он садится на ДНК, фактическое разрезание осуществляется другим доменом фермента – примерно на десять оснований в стороне от посадки. Поскольку два домена структурно отделены друг от друга, Чандра считал, что он может изменить целевые параметры, привязав к участку разреза другой домен для распознавания ДНК.

Чандра опубликовал данные о своем прорыве в области «гибридной рестриктазы» в 1996 г.[272]272
  Y. G. Kim, J. Cha, and S. Chandrasegaran, «Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain,» Proceedings of the National Academy of Sciences USA 93, (1996): 1156–1160, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC40048/.


[Закрыть] Его команда объединила разрезающий ДНК домен FokI с доменами «цинковых пальцев», которые обеспечивали специфичность. «Теоретически, – пишет Чандра, – можно создать „цинковый палец“ для каждого из возможных шестидесяти четырех триплетных кодонов и, используя комбинацию этих „пальцев“, создать белок для распознавания любого требуемого участка ДНК». Эти нуклеазы типа цинковых пальцев (ZFNs) можно запрограммировать для присоединения к любой последовательности ДНК, что нашло бы самое широкое применение. Что интересно, выбор Чандры выдержал испытание временем. «Все признают, что [футбольный] матч длится 90 минут, а раскладка клавиатуры у компьютера начинается с буквы Q, – говорит Урнов. – Людям не нужно что-то менять в своем развитии».

Чандра не сомневался, что его химерные нуклеазы – «новый вид молекулярных ножниц» – смогут изменить генную терапию: в 1999 г. он сказал, что его целью было вырезать генную мутацию и аккуратно заменить ее нормальной копией. Отбросив этическую сторону вопроса, он писал: «Генная терапия будет регулярно применяться в клинической практике, а это значит, что парадигма в лечении болезней человека изменится»[273]273
  S. Chandrasegaran and J. Smith, «Chimeric Restriction Enzymes: What is Next?,»Biological Chemistry 380, (1999): 841–848, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4033837/.


[Закрыть].

Чандра объединился с Дэйном Кэрроллом, биохимиком из Университета Юты: он хотел адаптировать нуклеазу, содержащую «цинковые пальцы» (ZNFs), под разработку мутаций в классической модели животного, такого как плодовая мушка. Если все сделать правильно, то клетки дрозофилы оказываются не коричневыми, а желтыми. Коллега Кэрролла увидел в микроскопе желтые щетинки[274]274
  M. Bibikova et al., «Targeted Chromosomal Cleavage and Mutagenesis in Drosophila Using Zinc-Finger Nucleases,» Genetics 161, (2002): 1169–1175, https://www.genetics.org/content/161/3/1169.long.


[Закрыть]. «На вашем месте я был бы очень рад», – сказал он своему боссу. К 2002 г.[275]275
  M. Bibikova et al., «Stimulation of Homologous Recombination through Targeted Cleavage by Chimeric Nucleases,» Molecular and Cellular Biology 21, (2001): 289–297, https://mcb.asm.org/content/21/1/289.


[Закрыть] группа Кэрролла продемонстрировала способность направленно изменять ДНК в живых организмах – это было первое применение нуклеаз типа «цинковых пальцев» (не только для управления экспрессией определенных генов, но и для непосредственного изменения последовательности ДНК). Разработка Кэрроллом нуклеаз, содержащих «цинковые пальцы» (ZNFs), в сочетании с идеями по изменению генов Ясин с коллегами заложила основу для редактирования генома человека[276]276
  K. Davies and D. Carroll, «Giving Genome Editing the Fingers: An Interview with Dana Carroll,» The CRISPR Journal 2, (2019): 157–162, https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/crispr.2019.29058.dca.


[Закрыть].

С 1997 г. штаб-квартира Sangamo располагалась на территории Пойнт-Ричмонда в здании, которое использовалось совместно с Pixar, анимационной студией, создавшей «Историю игрушек» и «Приключения Флика», а позже приобретенной Disney. Когда Pixar переехала в другую, более крупную штаб-квартиру в Эмервилле, Sangamo расширила свои площади. В течение трех лет Урнов и Холмс делили офис, который раньше у Pixar был кинозалом. Урнов рассказывает, что их сотрудничество было сродни партнерству Леннона и Маккартни. Правда, позже он признает, что это некоторое преувеличение. Команде Sangamo помогал Мэттью Портеус, ученый-врач из Стэнфорда, который когда-то учился вместе с Дэвидом Балтимором. Он был также вдохновлен статьями Кэрролла о нуклеазах типа «цинковых пальцев» (ZNFs) и хотел заставить их работать в клетках человека. Портеус создал метод анализа с использованием зеленого флуоресцентного белка, который мог сообщать об успешном воздействии на ген при помощи ZNFs[277]277
  M. H. Porteus and D. Baltimore, «Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells,» Science 5620, (2003): 763, http://science.sciencemag.org/content/300/5620/763.


[Закрыть].

Молодые таланты Sangamo выполняли задание, они не имели права на ошибку. «Ничто не вызывает такого чувства срочности, как присутствие на бирже Nasdaq», – говорит Урнов. В течение следующих нескольких лет в Sangamo смогли придумать, как сделать из ZFNs эффективные редакторы генов. В качестве мишеней выступало множество болезней: серповидноклеточная анемия, гемофилия и тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИД). (Урнов и Холмс даже пробовали внести изменения в ген CCR5.) Поскольку все еще помнили неудачу, случившуюся с французской генной терапией, Sangamo начала искать способы исправить генетический сбой у пациентов с ТКИД – мутацию в гене гамма-рецептора интерлейкина-2 (IL2Rζ).

Однажды Урнов смотрел на результаты, выдаваемые лабораторным прибором под названием «флуоресцентный сканер». «Похоже, мы достигли успешности редактирования генов один к пяти, – Урнов поделилcя результатами с Холмсом. – Если это правда, значит, мы только что вступили в новую эру!» Холмс согласился, уже планируя следующие эксперименты, проверить полученные данные, в то время как Урнов в возбуждении расхаживал по комнате. «Экстраординарные заявления требуют экстраординарных доказательств. Мы оба знали, что так просто нам никто не поверит!» – вспоминает Урнов. Они никому не рассказали о своих результатах, но в то же время тайно проводили все контрольные эксперименты, какие только могли придумать. Задел, которым обладала Sangamo, начал приносить плоды. «Мы наконец-то собрали мощный мотор для машины с превосходными шинами и супераэродинамичным корпусом, а также построили суперплоскую гоночную трассу».

Урнов и Холмс наблюдали коррекцию генов – нуклеаза, обладающая «цинковыми пальцами» (ZNFs), создавала разрыв в ДНК, замененный фрагментом генетической информации. Они включили в группу Грегори, Ребара и Миллера и придумали эксперимент, чтобы окончательно исключить возможность появления артефакта, вызванного загрязнением образца. Урнов выбрал клетку, гомозиготную по редактируемому гену. Если бы произошло заражение, то они бы всегда наблюдали две различные копии гена. Но если бы обнаруживалась только вводимая последовательность ДНК, это бы означало, что исходный ген был заменен – отредактирован – внешней последовательностью. На протяжении субботы и воскресенья Урнов анализировал группу отредактированных клеток. Несколько первых были нормальными, неизмененными, а значит, неинтересными. Следующей была гетерозигота – один нормальный аллель, другой измененный. Это происходило до тех пор, пока – о, счастье! – он не нашел клетку, в которой обе копии гена были изменены. Урнов быстро сбросил электронное письмо Холмсу: «ГОМОЗИГОТА!!! За которой вскоре последовала ЕЩЕ ОДНА гомозигота!!!»

Русская пословица гласит: «Взялся за гуж – не говори, что не дюж». Пришло время приоткрыть занавес и закончить важнейшее научное исследование. В качестве последнего доказательства Урнов провел самый важный эксперимент в своей жизни – Саузерн-блот, весьма трудоемкий метод, разработанный Эдом Саузерном в 1970-х гг., в котором фрагменты ДНК замысловатым образом высасываются из геля и переносятся на нейлоновую мембрану с помощью абсорбента в виде десятисантиметровой стопки бумажных полотенец. А Холмс показал, что они могут устранить внесенное изменение, и провел эксперименты не только на опухолевых лабораторных культурах, но и с лейкоцитами конкретных пациентов.

Перед отправкой статьи в журнал Nature один из главных консультантов Sangamo, сэр Аарон Клуг, предложил Урнову с коллегами использовать термин «высокоэффективная генная коррекция», а не «модификация». (Копия рукописи, содержащая комментарии Клуга, написанные им от руки, остается одной из самых ценных вещей Урнова.) После двух этапов рецензирования в апреле 2005 г. журнал Nature опубликовал статью, в которой были переписаны правила генной терапии[278]278
  F. D. Urnov et al., «Highly Efficient Endogenous Human Gene Correction Using Designed Zinc-Finger Nucleases,» Nature 435, (2005): 646–651, https://www.nature.com/articles/nature03556.


[Закрыть]. Компания Sangamo продемонстрировала возможность исправления генетических мутаций у человека. Более того, этот метод позволял избежать проблем инсерционного мутагенеза, который омрачил испытания генной терапии во Франции. «Принцип работы ZFNs – бей и беги – делает терапевтически полезные изменения, внесенные в геном, независящими от необходимости интеграции экзогенной ДНК, в то же время клетка навсегда остается модифицированной», – писал Урнов.

Когда редакторы Nature попросили предложить идеи для заголовка на обложке, Урнов выдвинул вариант: «Редактирование генома». (В тот момент его отец только что стал главным редактором российского литературного журнала.) Через пять лет после создания первого наброска генома человека ученые показали, что изменить язык жизни возможно, если необходимо устранить генетическое заболевание.

Сэм Джаффе из журнала Wired сообщил о знаменательной технологии «нанохирургии» с заголовком, который, я надеюсь, обеспечил редактора премией: «Показывая палец генетическому заболеванию»[279]279
  S. Jaffe, «Giving Genetic Disease the Finger,» Wired, July 5, 2005, https://www.wired.com/2005/07/giving-genetic-disease-the-finger/.


[Закрыть]. Джаффе процитировал Дэвида Балтимора: «Это не просто позволяет доставить чужеродный ген в клетку. Это делает возможным фактически удалить неправильно закодированный фрагмент и решить проблему». Воздействовать на любой ген в геноме стало очевидной реальностью. Рецензия Чандры на статью в Nature Biotechnology была озаглавлена: «Волшебные ножницы для геномной хирургии»[280]280
  K. Kandavelou et al., «'Magic' scissors for genome surgery,» Nature Biotechnology 23, (2005): 686–687, https://www.nature.com/articles/nbt0605–686.


[Закрыть].

Следующим шагом был переход к лечению пациентов с ТКИД, что требовало провести редактирование гена в стволовых клетках. Но, к отчаянию команды, все, что они смогли сделать, – это небольшие вставки и делеции последовательности ДНК, нокауты гена, но не точные исправления. «Это был, мягко говоря, не тот дроид, которого мы искали», – говорит Урнов. Ситуацию вывел из тупика новый главный врач компании Дейл Андо.

– Я знаю, что нужно сделать, – заявил Андо, – и знаю, с каким геном и в какой болезни. Мы не будем заниматься синдромом мальчика в пузыре. Мы возьмемся за ВИЧ.

– Хм, окей, – сказал Урнов.

– Мы будем воздействовать на ген CCR5 T-клеток.

– Хорошо.

– И мы будем сотрудничать с Карлом Джуном.

– Это кто?

Андо засмеялся. Неплохой способ произвести впечатление в первый рабочий день.

Не многие области медицинских исследований в 1990-е гг. были такими же актуальными и конкурентными, как изучение ВИЧ, описанного впервые как синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) у нескольких пациентов в 1981 г. По мере распространения эпидемии ученые из Калифорнии обнаружили, что некоторые люди обладают врожденным иммунитетом к этому вирусу. Между тем несколько групп исследователей определили пути проникновения ВИЧ в лейкоциты – рецептор CD4 и корецептор CXCR4.

В июне 1996 г. пять независимых статей, описывающих другой мембранный белок, CCR5 (C–C-рецептор хемокина 5), в качестве второго корецептора, были приняты в печать тремя ведущими научными журналами, причем все в пределах одной недели. Если ВИЧ был дирижаблем, который зацепился за Эмпайр-стейт-билдинг (CD4), то CCR5 был фуникулером, доставляющим пассажиров – генетический материал ВИЧ, на землю, в лимфоцит. Как и бульварная пресса, ведущие научные журналы конкурируют между собой, чтобы быть первыми в публикации прорывных научных исследований. Увы, одна из статей по CCR5[281]281
  B. J. Doranz et al., «A dual-tropic primary HIV-1 isolate that uses fusin and the betachemokine receptors CKR-5, CKR-3, and CKR-2b as fusion cofactors,» Cell 85, (1996): 1148–58, https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092–8674(00)81314–8.


[Закрыть] в журнале Cell была напечатана в такой спешке, что несколько страниц оказались перевернутыми.

Одним из главных авторов этой статьи был Марк Парментье, бельгийский врач-ученый, который предположил, что из-за различных вариантов в рецепторе CCR5 прогрессирование болезни у некоторых людей, инфицированных ВИЧ, может происходить медленнее. Команда Парментье взяла образцы трех таких людей и обнаружила нехватку 32 оснований ДНК (Δ32, или «дельта 32») в середине гена CCR5[282]282
  M. Parmentier, «CCR5 an HIV infection, a view from Brussels,» Frontiers in Immunology 6, (2015): 295, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4459230/.


[Закрыть]. Размер этой делеции не оставлял сомнений в нарушении работы укороченного белка. После тестирования сотен образцов и добровольцев он, к удивлению, обнаружил, что вариант Δ32 был распространен среди европейцев – частота носителей (имеется в виду одна копия) около 10 %, но ни у одного пациента с ВИЧ не было двух копий варианта Δ32. Один из коллег показал, что лейкоциты с геном Δ32 были устойчивы к ВИЧ-инфекции. К тому времени, когда Парментье представил статью в Nature в июле[283]283
  M. Samson et al., «Resistance to HIV-1 infection in caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene,» Nature 382, (1996): 722–725, https://www.nature.com/articles/382722a0.


[Закрыть], другая группа получила те же результаты на большей выборке пациентов.

В 1980-х гг. Стивен О'Брайен, руководитель лаборатории Национального института здравоохранения, начал поиск генетических факторов, влияющих на восприимчивость к ВИЧ и прогрессирование болезни. О'Брайен и генетик Майкл Дин начали систематический скрининг генов-кандидатов среди ВИЧ-инфицированных. Спустя двенадцать лет команда Национального института здравоохранения безуспешно проверила более сотни мутаций-кандидатов у тысяч пациентов, инфицированных ВИЧ. Однако изобилие статей о CCR5 показало, что этот ген – лучший кандидат[284]284
  Stephen J. O'Brien, Tears of the Cheetah (New York: Thomas Dunne, 2003).


[Закрыть]. 4 июля, пока О'Брайен смотрел премьеру фильма «День независимости», его команда неистово занималась секвенированием образцов. Они тоже обнаружили вариант Δ32, но не заметили ни одной гомозиготы по этому признаку у более чем 1300 пациентов с ВИЧ. Около 1–2 % населения США – гомозиготы по Δ32, но ими почти никогда не бывают больные с ВИЧ. Без проникновения в лейкоциты ВИЧ может находиться в организме, но не инфицировать его[285]285
  Последующие исследования показали, что некоторые гомозиготы по Δ32 инфицированы другим штаммом ВИЧ, который проникает через корецептор CXCR4.


[Закрыть].

Интерес представляет географическое распределение CCR5 Δ32: он наиболее распространен среди северных европейцев (частота 5–15 %). Однако по мере перемещения дальше на юг или восток частота падает – Δ32 почти не встречается у жителей Африки и Азии. Подобная закономерность позволяет предположить, что этот признак прошел положительный отбор по причине, не связанной с ВИЧ, который впервые инфицировал человека только в начале XX в. О'Брайен предположил, что единственное разумное объяснение – это «загадочная, захватывающая дух вспышка смертельного инфекционного заболевания, которое, подобно СПИДу, привело к огромной смертности и к которому были невосприимчивы носители CCR5 Δ32». Главный кандидат – чума, опустошившая Европу в Средние века. Возможно, вариант Δ32 возник в Скандинавии в ответ на более раннюю вспышку Черной смерти.

За год до волны открытий, связанных с рецептором CCR5, жителю Сиэтла по имени Тимоти Рэй Браун, пока он учился в Берлине, был поставлен диагноз ВИЧ. Он сдерживал развитие болезни, принимая смесь антиретровирусных препаратов, но в 2006 г., после участия в свадьбе в Нью-Йорке, по возвращении домой заболел. Его врач диагностировал анемию, но биопсия показала, что у Брауна острый миелолейкоз. Единственным лечением была пересадка костного мозга: к счастью, поиск потенциальных доноров выявил более 250 совпадений. Гематологу Брауна пришла в голову идея выбрать донора с дефектным геном CCR5. Из списка возможных кандидатов донор под номером 61 обладал вариантом Δ32.

Браун не хотел быть подопытным кроликом[286]286
  T. R. Brown, «I am the Berlin patient: a personal reflection,» AIDS Research and Human Retroviruses 31, (2015): 2–3, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4287108/.


[Закрыть], но подписал соглашение на пересадку. Через три месяца после операции, в феврале 2007 г., вирус уже не обнаруживался в крови Брауна, и тот перестал принимать лекарства от ВИЧ. После того как лейкоз вернулся, Брауну провели вторую операцию в феврале 2008 г. Врачи наконец объявили, что он здоров и обладает нормальным количеством T-лимфоцитов[287]287
  G. Hutter et al., «Long-term control of HIV by CCR5 delta32/delta32 stem-cell transplantation,» The New England Journal of Medicine 360, (2009): 692–698, https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa0802905.


[Закрыть]. «Меня зовут Тимоти Рэй Браун, и я первый человек в мире, излечившийся от ВИЧ», – с гордостью писал так называемый берлинский пациент.

Опыт Брауна дал представителям Sangamo много пищи для размышлений. Восстановление мутаций все еще было святым Граалем для многих болезней, но деактивация ключевых генов могла иметь важные медицинские преимущества в определенных ситуациях, включая ту, за которую выступал Андо. Цель состояла в том, чтобы попытаться «сконструировать ВИЧ-защитный генотип в клетках людей с ВИЧ-положительным статусом в надежде создать некую часть иммунной системы, которая будет защищена от инфицирования ВИЧ», вспоминает Урнов[288]288
  F. Urnov, «AWESOME interview with Dr. Fyodor Urnov,» The Sangamo Domain (blog), December 12, 2015, http://sangamodomain.blogspot.com/2015/12/awesome-interview-with-dr-fyodor-urnov.html.


[Закрыть].

Когда Холмс возглавил программу по борьбе с ВИЧ, Sangamo наконец в 2009 г. перешла к клиническим исследованиям в сотрудничестве (за что и выступал Андо) с Карлом Джуном, ведущим специалистом по генной терапии в Университете Пенсильвании. Спустя пять лет представители Sangamo сообщили о результатах, полученных у первой дюжины пациентов с ВИЧ, которые излечились благодаря своим же T-клеткам с отредактированным геном CCR5[289]289
  P. Tebas et al., «Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV,» The New England Journal of Medicine 370, (2014): 901–910, https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/nejmoa1300662.


[Закрыть]. Результаты были неоднозначными: терапия казалась безопасной и наблюдался некоторый противовирусный эффект, что позволило пациентам не прибегать к стандартной антиретровирусной терапии. В 2015 г. Sangamo получила одобрение Управления США по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) на перенос концепции T-клеток на стволовые клетки с целью защитить часть клеток иммунной системы от заражения ВИЧ. На сегодняшний день усилиями Sangamo излечено более ста пациентов с ВИЧ.

В то время как Sangamo известна как компания, специализирующая на «цинковых пальцах», французские исследователи выводили в клиническую практику технологию редактирования генов при помощи TALEN. Генеральный директор Cellectis, Андре Шулика, подумал, что CRISPR – это «суперкруто», когда впервые услышал о нем, но выбрал для работы, преимущественно в области иммунотерапии, TALEN. «Мы обнаружили, что эти системы более точные, современные, мощные, и решили, что они будут более безопасными для пациентов», – замечает он[290]290
  Emily Mullin, «Back to the Future: Pre-CRISPR Systems are Driving Therapies to the Clinic,»Genetic Engineering & Biotechnology News, February 7, 2019, https://www.genengnews.com/insights/back-to-the-future-pre-crispr-systems-are-driving-therapies-to-the-clinic/.


[Закрыть].

Ланфье ушел из Sangamo в июне 2016 г. после двадцати одного года работы, отчасти по состоянию здоровья, но также и потому, что чувствовал: настало время «привлечь настоящих профессионалов». В программе Mad Money на канале CNBC Джим Креймер спросил Ланфье о CRISPR и вере Sangamo в технологию ZFN. «Ключом к лечению человека является специфичность – способность воздействовать именно на тот ген, который вам нужен, и только на него, – ответил Ланфье. – Вот где „цинковые пальцы“ обладают полной монополией»[291]291
  CNBC, «Sangamo Biosciences CEO Edward Lanphier | Mad Money | CNBC,» YouTube video, 8:19, March 7, 2019, https://www.youtube.com/watch?v=c3dT1sH1PNM.


[Закрыть]. Спустя годы я спросил Ланфье, не поменялось ли его мнение. «CRISPR бактериальный. Он неспецифичный. Он иммуногенный, – ответил он. – Это прекрасный инструмент для исследований. Он многое дает для понимания редактирования генома. И когда люди действительно захотят использовать его в терапевтических целях, они в итоге обратятся к нам». Должно быть, ему было нелегко снимать тот номерной знак с автомобиля. «Никто не может делать это, как Sangamo, в таком масштабе и с такой точностью», – заявил он.

Перед выходом на пенсию Ланфье запустил терапевтические программы по лечению заболеваний крови, включая такие, как серповидноклеточная анемия, бета-талассемия и гемофилия. Эд Ребар придумал хитроумный план, как заставить работать гены в печени. Альбумин, самый распространенный белок в крови человека, синтезируется геном, который чрезвычайно активен в печени. Ребар подумал: что может помешать Sangamo ввести в печень ген, подобно троянскому коню, и использовать этот мощный промотор[292]292
  Генетический элемент, определяющий пространственную и временную активность гена. – Прим. ред.


[Закрыть] гена альбумина? Метод, названный заменой белка in vivo, или «невидимое исправление», включал в себя разрез в первом интроне гена альбумина, включение трансгена в это «безопасное пристанище» и использование возможностей промотора альбумина для активации интересующего гена. Это дало толчок программам, направленным на лечение редких наследуемых заболеваний, вызванных нарушениями генов, обычно экспрессирующихся в печени, таких как мукополисахаридоз (МПС) типов I и II (также известных как синдромы Гурлера и Хантера соответственно) и гемофилия B.

13 ноября 2017 г. 44-летний Брайан Мадо забрался на постель кабинета 1037 (инфузионная) в детской больнице Бениофф в Окленде (штат Калифорния). Одетый в серый свитер и шорты цвета хаки, он с волнением наблюдал, как медсестра подключает капельницу. Он знал о больницах не понаслышке, поскольку перенес более двух десятков операций из-за грыж, костных мозолей, заболеваний позвоночника, глаз и ушей, вызванных синдромом Хантера. Окруженный врачами, медсестрами и съемочной группой, он вот-вот должен был стать первым пациентом, которому напрямую введут препарат, редактирующий гены. «Это довольно унизительно», – сказал он представителю Associated Press[293]293
  Brian Madeux quoted in M. Marchione, «US scientists try 1st gene editing in the body,» AP News, November 15, 2017, https://apnews.com/4ae98919b52e43d8a8960e0e260feb0a.


[Закрыть].

Введение препарата в кровь Мадо состоялось в столетнюю годовщину первого описания его болезни. Чарльз Хантер, шотландский врач, эмигрировавший в Виннипег (Канада), опубликовал статью о болезни двух братьев в возрасте десяти и восьми лет с синдромом физических отклонений, который позже будет носить его имя[294]294
  C. Hunter, «A rare disease in two brothers,» Journal of the Royal Society of Medicine 10, (1917): 104–116, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2018097/pdf/procrsmed00727–0110.pdf.


[Закрыть]. Братья обладали несколькими общими чертами: они были низкорослые, крупноголовые, с короткой шеей, широкой грудью, и у них легко начиналась одышка. Теперь мы знаем, что эта болезнь вызвана дефицитом фермента под названием «идуронат-2-сульфатаза». В организме пациентов с синдромом Хантера не расщепляется два определенных углевода, которые в итоге накапливаются в различных тканях. Лечение с заменой фермента включает еженедельные инфузии, которые могут стоить более $100 000 в год. Врачи Мадо надеялись, что лечение остановит прогрессирование болезни и послужит примером для других пациентов. Первые несколько дней он чувствовал слабость и головокружение, позже у него произошел частичный коллапс легкого (возможно, это не было связано с терапией). Обнадеживало то, что его печень работала нормально. Были набраны другие пациенты, некоторые из них получали более высокую дозу препарата. Тем не менее первичные результаты были неоднозначны.

Преемник Ланфье – Сэнди Макрей, шотландский врач, обучавшийся молекулярной биологии в 1990-е гг. у великого Сидни Бреннера. «Жена сказала, что мне это никогда не пригодится, а потом появилась эта работа», – шутит Макрей. Изменив название компании на Sangamo Therapeutics, он начал подписывать сделки с крупными фармацевтическими партнерами на разработку методов лечения различных заболеваний. Sangamo не собиралась отказываться от многолетнего опыта в области ZFNs, но уже не была просто компанией, специализирующейся на «цинковых пальцах». «Если бы я снова работал постдоком, я бы использовал CRISPR», – замечает Макрей.