Текст книги "Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии"

Изопропанол не применяется в гистологии в качестве самостоятельного фиксирующего вещества в связи с плохим проникновением в ткани. Однако он может быть использован в комбинации с другими веществами в составе сложных фиксаторов. В качестве примера можно привести жидкость Ньюкомера и цинк-ацетонизопропанол-формальдегид (Коржевский Д. Э. [и др.], 2006).

Жидкость Ньюкомера дает примерно такие же результаты фиксации, как и жидкость Карнуа. Этот фиксатор состоит из 60 мл изопропанола, 30 мл пропионовой кислоты, 10 мл ацетона и 10 мл диоксана. Образцы тканей следует фиксировать 12 – 24 ч при комнатной температуре и затем хранить при 3 °C в свежей порции фиксатора. Для промывки после фиксации и обезвоживания следует использовать изопропанол (Лилли Р., 1969).

Уксусная кислота сама по себе употребляется для фиксации очень редко, так как в чистом виде она дает плохие результаты. Очень часто ее прибавляют к другим фиксирующим жидкостям. Ледяной уксусной кислотой называют 100 %-ю уксусную кислоту, концентрированная уксусная кислота содержит 4 % воды. Фиксирующее действие уксусной кислоты распространяется в основном на структуры клеточного ядра и хромосомы.

Уксусная кислота – орсеин. 1 г орсеина растворяют в 45 мл горячей уксусной кислоты, охлаждают и добавляют 55 мл дистиллированной воды. Полученный реактив обладает одновременно фиксирующими и окрашивающими свойствами. Он хорошо окрашивает гетерохроматин и хромосомы в цитологических препаратах (Лилли Р., 1969).

Формалин – наиболее распространенная и универсальная фиксирующая жидкость. Формалин хорошо проникает в ткани и потому применяется для фиксации довольно крупных объектов. Формалин придает ткани плотность, вполне подходящую для резки на замораживающем микротоме и вибратоме. Существенное преимущество формалина состоит в том, что препараты можно хранить в нем годами, у них сохраняется способность к окрашиванию наиболее часто используемыми методами (гематоксилинэозином, по Ван-Гизону). Особенно ценной является способность формалина хорошо сохранять липиды, что важно для фиксации нервной ткани. Фиксация чистым формалином менее пригодна для различных цитологических исследований, например для ядерных структур, для органов кроветворения, для обнаружения гликогена или железа. Недостатками формалина являются:

– ухудшение окраски тканей при продолжительной фиксации и хранении «влажного архива»;

– возможность выпадения формалиновых осадков;

– сильное маскирующее действие на большинство антигенов, выявляемых иммуноцитохимически.

Для приготовления формалинового фиксатора используют готовый 35 – 40 % водный раствор формальдегида (альдегида муравьиной кислоты). Следует учитывать, что концентрированный раствор формальдегида обычно содержит метиловый спирт (около 10 %), который добавляют для стабилизации раствора и предотвращения полимеризации формальдегида. Формалин следует хранить в защищающих от света коричневых склянках при температуре не ниже 9 °C. При более сильном охлаждении в растворе появляется муть, которая постепенно оседает в виде белого осадка (параформальдегид и триоксиметилен). При длительном хранении раствор формальдегида медленно окисляется, происходит накопление муравьиной кислоты.

В большинстве случаев препараты удовлетворительного качества можно получить при использовании в качестве фиксирующей жидкости обычного (кислого, не нейтрализованного) 10 %-го формалина. Его готовят из концентрированного раствора формальдегида, добавляя к одной его части 9 частей водопроводной воды. Не следует использовать формальдегид с белым осадком. Часто рекомендуемый способ растворения осадка путем нагревания в вытяжном шкафу на практике мало применим. При появлении незначительного осадка в емкости с концентрированным раствором формальдегида следует уменьшить его разведение (1: 6 вместо 1: 9). При наличии значительного осадка раствор формальдегида становится непригодным для использования (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

Определение концентрации формалина в растворе представляется затруднительной задачей. Существующий метод титрования описан у Б. Ромейса (1954), однако он чрезвычайно сложен и поэтому не может быть рекомендован для практических целей. Упростить решение этой задачи позволяет специальная индикаторная бумага, выпускаемая фирмой Sakura (Япония).

При необходимости использования нейтрального раствора формалина (для фиксации нервной ткани, при применении специальных окрасок, при проведении иммуноцитохимического исследования) его готовят следующим образом: раствор формальдегида (37 – 40 %) – 100 мл, вода дистиллированная – 900 мл, однозамещенный фосфат натрия – 4 г, безводный двузамещенный фосфат натрия – 6,5 г. Этот раствор стабилен при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. Использование нейтрального формалина позволяет существенно уменьшить вероятность отложения формалиновых осадков, появление которых обусловлено взаимодействием гемоглобина с кислыми растворами формалина (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

Нейтрализация формалина по Б. Ромейсу. Формалин оставляют надолго в коричневой склянке над слоем порошкообразного углекислого кальция толщиной 1 – 2 см. Вначале склянку несколько раз энергично взбалтывают. Обычно кислота достаточно нейтрализуется уже через 24 ч.

Если нейтрализация формалина не производится, то его следует развести до нужной концентрации заранее, а не в день фиксации. Этот прием улучшает качество фиксации.

Кусочки органов толщиной 0,5 – 1,0 см фиксируются в 10 – 20 %-м растворе формалина в течение 24 – 48 ч. Спустя сутки раствор меняют. Более длительная фиксация нежелательна. Критерием достаточной фиксации служит равномерное уплотнение объекта как с поверхности, так и выявляемое на контрольном разрезе. В центральной части не полностью фиксированных кусочков ткань сохраняет красно-розовый цвет. Фиксацию в формалине проводят при комнатной температуре (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

Формалин-пиридин. Рекомендуется следующий раствор: дистиллированная вода – 75 мл, формалин – 25 мл, чистый пиридин – 5 мл. Количество фиксирующей жидкости должно превышать объем препарата по крайней мере в 20 раз. Продолжительность фиксации – 48 ч. Периферические нервы лучше фиксировать 2 нед. (допустимо и 6 нед.), не должно быть никаких осадков формалина. После этой фиксации применимы все обычные методы окраски и импрегнации. Этот метод фиксации рекомендован для тех случаев, когда предписывается нейтральный формалин. рН формалин-пиридина – около 7,0 – 7,5 (Ромейс Б., 1954).

Формалиновые осадки. Очень часто в фиксированных формалином препаратах появляются темно-коричневые кристаллические осадки, которые образуются в результате взаимодействия формальдегида с гемоглобином (Ромейс Б., 1954). Чаще всего они обнаруживаются в области кровоизлияний и над просветами кровеносных сосудов, заполненных эритроцитами. По цвету формалиновые осадки невозможно отличить от скоплений гемосидерина, что затрудняет диагностическую оценку препарата.

Метод Кардазевича. Удаление осадков лучше всего производится путем помещения неокрашенных срезов в 1 – 5 % раствор нашатырного спирта (NН₄ОН) в 70 %-м этиловом спирте. Время исчезновения осадков варьирует от 5 мин до 4 ч. Cтруктура и окрашиваемость объекта остаются неизмененными. Этот метод превосходит часто употребляющийся метод Верокая. Единственный недостаток этого способа состоит в том, что, кроме формалинового осадка, растворяется и малярийный пигмент. Остальные пигменты, прежде всего липофусцин, меланин, гемосидерин, антракотический пигмент, не растворяются (Ромейс Б., 1954).

Метод Верокая. Для освобождения от формалиновых осадков срезы помещают на 10 мин в смесь 1 части 1 %-го водного раствора едкого калия и 100 частей 80 %-го спирта, затем на 5 мин – в дважды сменяемую воду, на 5 мин – в 80 %-й спирт, после чего промывают в проточной воде (Ромейс Б., 1954).

Размягчение перефиксированных препаратов. Если вследствие длительного пребывания в крепком формалиновом растворе препараты станут слишком плотными, то избыточную плотность можно устранить помещением их на 14 дней в 1 %-й раствор азотнокислого серебра или в 10 %-й раствор лимонной кислоты (Ромейс Б., 1954).

Формалин часто комбинируют с другими фиксирующими жидкостями, причем непосредственно перед употреблением, так как жидкости, особенно если они содержат окислители, после смешения достаточно быстро изменяют свои свойства из-за окисления формальдегида.

Пикриновая кислота (тринитрофенол) – желтое кристаллическое вещество, слаборастворимое в воде и хорошо растворимое в органических растворителях. В сухом виде пикриновая кислота взрывоопасна. В увлажненном состоянии и в водных растворах она не способна к детонации. В лаборатории не следует хранить сухую пикриновую кислоту. Она очень часто применяется в технике фиксации, особенно в соединении с другими веществами, такими как формалин, ледяная уксусная кислота, азотная кислота, сулема, в чистом виде – сравнительно редко.

Из многочисленных смесей, содержащих пикриновую кислоту, на первом месте по комплексу показателей (качество фиксации, простота приготовления, отсутствие эффекта перефиксации) стоит жидкость Буэна, состоящая из пикриновой кислоты, формалина и ледяной уксусной кислоты. Способность тканей к окраске очень хорошо сохраняется во всех пикриновокислых смесях. При исследовании на содержание кальция нужно учитывать, что пикриновая кислота оказывает слабое декальцинирующее действие (Ромейс Б., 1954).

В фиксационной технике пикриновая кислота употребляется обычно в виде насыщенного водного раствора, к которому перед употреблением прибавляют другие жидкости. По Б. Ромейсу, для приготовления запасного раствора, который может сохраняться очень долго, всыпают 30 – 50 г пикриновой кислоты в бутылку объемом 1 – 2 л, наполняют ее подогретой дистиллированной водой, энергично взбалтывают и дают остыть. При комнатной температуре в 100 мл воды растворяется около 1,2 г кислоты, так что в остывшем растворе на дне осаждается большой избыток нерастворенных кристаллов. Если раствор использован, то к осадку снова добавляют горячую воду. Чтобы всегда был запас, лучше всего иметь две запасные емкости с пикриновой кислотой.

Отмывка пикриновой кислоты производится почти исключительно 70 – 80 %-м спиртом, но не водой, так как вызванные пикриновой кислотой осадки большей частью нерастворимы в воде. Кроме того, при помещении в воду наступает набухание соединительной ткани. При отмывке следует несколько раз сменить спирт, однако обычно нет необходимости полностью вымывать пикриновую кислоту (Ромейс Б., 1954).

Желтая окраска срезов после регидратации может быть устранена обработкой в 5 %-м водном растворе тиосульфата натрия.

Пикриновая кислота – формалин-уксусная кислота. Эта предложенная Буэном смесь принадлежит к лучшим фиксирующим жидкостям. Относительно быстро проникающий фиксатор рекомендуется как для обзорных препаратов, так и для специальных исследований. Жидкость Буэна пригодна и для фиксации эмбрионов. Окрашиваемость тканей очень хорошая. Коллагеновые волокна в ней несколько набухают; жиры и липоидные вещества сохраняются хуже. Считается, что жидкость Буэна недостаточно хорошо фиксирует ткани почки (Меркулов Г. А., 1969).

Жидкость Буэна. Фиксатор готовится ex tempore из насыщенного 1,2 %-го водного раствора пикриновой кислоты, концентрированного формальдегида (35 – 40 %) и ледяной уксусной кислоты в соотношении 15: 5: 1. Продолжительность фиксации – около 24 ч при комнатной температуре. Возможно и более длительное (до нескольких суток) пребывание срезов в жидкости Буэна без ухудшения качества последующей окраски. После фиксации полагаются короткая промывка в воде (1 – 15 мин) и более длительная (до суток) – в 70 %-м этаноле, обезвоживание и заливка в парафин. Заливка в целлоидин нежелательна. После фиксации в жидкости Буэна срезы ярко окрашиваются кислыми красителями (эозином и др.) и несколько хуже воспринимают основные анилиновые красители. В связи с этим для окончательного удаления пикриновой кислоты после депарафинирования рекомендуют обработать срезы в 0,2 %-м водном растворе карбоната лития в течение 30 с (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

При заливке в целлоидин материала, фиксированного по Буэну, часто обнаруживается, что даже после длительного пребывания в растворе целлоидина препараты пропитываются не полностью и крошатся при резке. Для устранения этого недостатка рекомендуется после 96 %-го спирта переносить препараты на 10 – 48 ч в следующую масляную смесь: 10 мл кедрового масла, 80 мл абсолютного спирта, 20 мл ориганового масла, 10 мл азотной кислоты. После этого объекты снова помещают на 24 – 48 ч в 96 %-й спирт, который сменяют 2 – 3 раза. Далее проводят те же манипуляции, как при целлоидиновой заливке. После такой обработки препараты хорошо режутся и не крошатся. Предполагается, что хрупкость объектов обусловлена образованием пикрата калия, который препятствует проникновению целлоидина; масляная смесь, содержащая азотную кислоту, растворяет и удаляет его (Ромейс Б., 1954).

Полигексаметиленгуанидин относится к фиксаторам общего назначения, предложенным в последние годы. Он применяется (Аничков Н. М.[и др.], 2010) в виде 10 %-го водного раствора (время фиксации – 5 сут).

Ацетат меди (Арасланов С. А. [и др.], 2007), тоже фиксатор общего назначения, применяется в виде 0,2 М водного раствора, время фиксации в нем составляет 7 сут.

Проведение иммуноцитохимического исследования возможно после фиксации материала в нейтральном растворе формалина, спирт-формалине, жидкостях Карнуа и Буэна, фиксаторах СФУ и B5. Наиболее устойчивые антигены могут быть выявлены и после продолжительной фиксации в обычном (не нейтральном) 10 %-м растворе формалина. Однако при использовании этих фиксаторов часть антигенов маскируется в связи с конформационными изменениями белков, экстракцией липидов, образованием перекрестных сшивок, модифицирующих антигенные детерминанты, снижается интенсивность иммуноцитохимической реакции на большинство антигенов.

С целью улучшить сохранность тканевых антигенов были предложены специальные фиксирующие смеси, которые наряду с фиксацией материала обеспечивают сохранность отдельных групп антигенов. Их использование вместо формалина позволяет во многих случаях добиться более эффективного выявления различных тканеспецифических белков, ферментов и онкомаркеров.

Цинк-формалин имеет наибольшее значение среди предложенных фиксаторов, поскольку он обеспечивает качество фиксации, свойственное формалиновым растворам. При применении обзорных и наиболее распространенных специальных способов окраски тинкториальные свойства тканевых элементов существенно не меняются, так что при проведении обычного патогистологического исследования не возникает дополнительных трудностей. Кроме того, для приготовления цинк-формалина не требуется использования дефицитных или дорогостоящих реагентов.

Цинк-формалиновый фиксатор с хлоридом цинка (Naish S. J., 1989) готовят, растворяя в 2 л дистиллированной воды 50 г хлорида цинка и добавляя 300 мл концентрированного раствора формальдегида и 1,9 мл ледяной уксусной кислоты. Этот фиксатор обычно применяют для иммуноцитохимических исследований, поскольку он хорошо сохраняет белки, ассоциированные с клеточными мембранами. Продолжительность фиксации – не более 24 ч при комнатной температуре. Приготовленный фиксатор может храниться в течение нескольких недель.

Цинк-формалиновый фиксатор с сульфатом цинка (Kiernan J. A., 2008). Для приготовления фиксатора берут 900 мл дистиллированной воды, 100 мл концентрированного раствора формальдегида и 10 г сульфата цинка (ZnSO₄4··7H₂O). Считается, что лучший результат фиксации антигенов получается при pH = 4,0 – 6,5. Если pH приготовленного раствора выходит за указанные границы, следует использовать 1 М растворы HCl и NaOH, которые добавляют к раствору фиксатора по каплям до необходимого уровня pH. Цинк-формалиновый фиксатор с сульфатом цинка может быть использован для перфузионной фиксации лабораторных животных. Для иммерсионной фиксации небольших объектов достаточно 6 – 8 ч. Объекты можно оставить в фиксаторе на срок до 1 нед. После фиксации в цинк-формалине можно заливать объекты в парафин (после промывки в воде), изготовлять срезы незалитого материала на замораживающем микротоме и криостате.

Раствор параформальдегида с пикриновой кислотой, по Замбони. Первоначально этот фиксатор был предложен (Zamboni L. [et al.], 1967) для электронной микроскопии. Способ приготовления: 20 г параформальдегида растворяют в насыщенном водном растворе пикриновой кислоты (150 мл). Раствор нагревают до 60 °C. Для улучшения растворения параформальдегида необходимо добавить в раствор 2 – 5 капель 1 М (4 %) водного раствора NaOH. После растворения параформальдегида раствор фильтруют, охлаждают и доводят до 1 л при помощи фосфатного буфера.

Приготовленный фиксирующий раствор стабилен в течение 12 мес. Особенно его рекомендуют для фиксации препаратов головного мозга и почки (Kiernan J. A., 2008). Время фиксации составляет 8 – 24 ч. По окончании фиксации рекомендуется промывка в воде, после чего для обезвоживания используют 70 %-й этанол.

Фосфатный буфер Замбони. Способ приготовления: однозамещенный фосфат натрия (NaH₂PO₄4··H₂O) – 3,31 г, двузамещенный фосфат натрия безводный (Na₂HPO₄) – 17,89 г, дистиллированная вода – до 1 л.

Цинк-этанол-формальдегид (Kоржевский Д. Э. [и др.], 2006). Способ приготовления: для приготовления 1 л фиксатора берут 900 мл 96 %-го этанола, 100 мл концентрированного раствора формальдегида и 10 г хлорида цинка. Готовый раствор сохраняет свои свойства в течение 4 – 5 нед. Продолжительность фиксации составляет 18 – 24 ч. Поскольку одновременно с фиксацией материала происходит его обезвоживание, после завершения фиксации кусочки перекладывают сразу в 96 %-й этанол. Этот фиксатор рекомендован для обработки головного и спинного мозга, поскольку наряду с улучшением сохранности тканевых антигенов обеспечивает высокое качество окраски по Нисслю.

ЛИТЕРАТУРА

1. Аничков Н. М., Данилова И. А., Васильев О. Д. [и др.]. Применение раствора полигуанидина для фиксации биологических и анатомических объектов // Морфология. – 2010. – Т. 137, № 1. – С. 58 – 61.

2. Арасланов С. А., Зайцев В. Б., Мешандин А. Г. [и др.]. Новый фиксатор биологического материала // Морфология. – 2007. – Т. 131, № 1. – С. 79 – 81.

3. Артишевский А. А., Леонтюк А. С., Слука Б. А. Гистология с техникой гистологических исследований. – Минск: Вышэйшая школа, 1999. – 236 с.

4. Вайль С. С. Практическое руководство по патолого-гистологической технике. – Л.; М.: ОГИЗ, 1934. – 228 с.

5. Коржевский Д. Э., Гиляров А. В. Основы гистологической техники. – СПб.: СпецЛит, 2010. – 96 с.

6. Коржевский Д. Э., Григорьев И. П., Отеллин В. А. Применение обезвоживающих фиксаторов, содержащих соли цинка, в нейрогистологических исследованиях // Морфология. – 2006. – Т. 129, № 1. – С. 85 – 86.

7. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. – М.: Мир, 1969. – 643 с.

8. Меркулов Г. А. Курс патогистологической техники. – Л.: Медицина, 1969. – 423 с.

9. Ромейс Б. Микроскопическая техника: пер. с нем. – М.: Изд-во иностр. литер., 1954. – 718 с.

10. Bancroft J. D., Gamble M. Theory and practice of histological techniques. – Edinbugh; London; N. Y.: Churchill Livingstone, 2002. – 796 p.

11. Kiernan J. A. Histological and histochemical methods. Theory and practice. – London: Scion Publishing Ltd, 2008. – 606 p.

12. Naish S. J. Immunochemical staining methods. – Glostrup: DAKO Corporation, 1989. – 41 p.

13. Zamboni L., DeMartino C. Buffered picric acid – formaldehyde: a new rapid fixative for electron microscopy // J. Cell Biol. – 1967. – Vol. 35. – P. 148A.

Глава 2
ДЕКАЛЬЦИНАЦИЯ КОСТНОЙ ТКАНИ

Для изучения гистологических препаратов плотных кальцифицированных тканей могут быть изготовлены шлифы, которые позволяют сохранить минеральные компоненты, придающие тканям высокую плотность. Однако эта процедура трудоемка и требует специального оборудования. На обычном микротоме невозможно изготовить срезы недекальцинированной костной ткани. Перед заливкой таких объектов в парафин или целлоидин производят декальцинацию, в ходе которой из объекта удаляются соли кальция, он теряет свою плотность и становится пригодным для последующей микротомии. Как правило, декальцинацию проводят после полной фиксации ткани. Однако существуют методы, благодаря которым декальцинация начинается одновременно с фиксацией. В этом случае фиксирующая среда должна содержать декальцинирующее вещество. После декальцинации в кислотах желательна тщательная промывка материала в слабощелочных растворах на протяжении 1 – 3 ч.

В литературе указывается много прописей различных декальцинирующих составов. Наиболее часто употребляемые из них приводятся в руководстве В. В. Некачалова (2000). При необходимости для декальцинации может быть использован раствор любой кислоты. Вместе с тем необходимо учитывать:

– простоту изготовления применяемых декальцинирующих растворов, безопасность для работы;

– скорость выполнения декальцинации;

– возможное повреждающее действие декальцинирующего раствора на костную ткань;

– оценку качества и информативности для анализа изготовляемых гистологических препаратов;

– возможность длительного хранения гистологических препаратов в архиве.

При декальцинации ткани, содержащей много жира (губчатой костной ткани пожилых людей, костного мозга и т. п.), ее необходимо обезжиривать, выдерживая объект 3 – 5 дней в 80 – 90 %-м этаноле (лучше в термостате при температуре 37 °C).