Текст книги "Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии"

Азотная кислота. В мензурку с притертой пробкой наливают 5,0 – 7,5 мл химически чистой концентрированной азотной кислоты (плотность 1,40) и добавляют до 100 мл дистиллированную воду. Небольшие кусочки самой плотной кости при этом декальцинируются в растворе азотной кислоты уже через 10 ч. После декальцинации для предотвращения набухания соединительной ткани кусочки кости на 24 ч подвешивают в 5 %-м растворе сульфата натрия или лития и после этого промывают в течение 24 – 48 ч в проточной воде. Кислота применяется только для очень плотных объектов, в частности зубов. Используется только 5 – 7 %-й водный раствор азотной кислоты. Не рекомендуется применять растворы азотной кислоты как более низкой, так и более высокой концентрации: в первом случае происходит набухание, во втором – повреждение клеточных структур.

Трихлоруксусная кислота. Применяют 5 – 10 %-й водный раствор этой кислоты, который одновременно фиксирует материал. К раствору целесообразно добавлять 10 – 20 %-й раствор формалина. Декальцинацию в трихлоруксусной кислоте рекомендуется проводить после предварительной фиксации в формалине, жидкости Буэна. Для декальцинации небольших кусочков достаточно 1 – 4 дней. Материал промывают в 96 %-м спирте в течение 3 – 4 дней, ежедневно меняя его. Для промывки нельзя использовать воду, иначе произойдет очень сильное набухание соединительной ткани.

Жидкость Дженкинса. Состав: 4 мл концентрированной соляной кислоты, 3 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл дистиллированной воды, 73 мл 100 %-го спирта и 10 мл хлороформа. Кусочки костной ткани декальцинируются в этом растворе 2 – 4 сут при 20 °C.

После декальцинации материал промывают в двух порциях абсолютного спирта, меняя его каждые 4 ч. Перед заливкой в парафин или целлоидин спирт удаляют, промывая объекты в 2 порциях хлороформа (по 3 мин). После декальцинации в жидкости Дженкинса не происходит набухания коллагеновых волокон, срезы костной ткани хорошо окрашиваются.

Жидкость Рихмана – Гельфанда – Хилла. Декальцинирующая жидкость состоит из 100 мл 90 %-й муравьиной кислоты, 80 мл 38,8 %-й соляной кислоты (удельный вес 1,19) и 820 мл дистиллированной или водопроводной воды. Объем декальцинирующей жидкости должен значительно превышать объем декальцинируемого объекта (в 10 – 20 раз). Небольшие кусочки компактной кости (1 – 2 г) декальцинируются при температуре 24 °C за 12 – 24 ч. В практической работе (за исключением декальцинации зубов) ее можно рекомендовать как мало меняющую тинкториальные свойства тканей и не вызывающую их набухания.

При проведении иммуногистохимического исследования необходимо использовать более мягкие (или щадящие) методы декальцинации, поскольку быстрая декальцинация в растворах кислот приводит к изменению тканевых антигенов и появлению артефактов. Поскольку декальцинирующие растворы, применяемые при иммуногистохимических исследованиях, медленно удаляют соли кальция из объектов, продолжительность декальцинации существенно увеличивается и может быть сокращена только при уменьшении объема декальцинируемого объекта.

Декальцинацию для иммуногистохимии проводят в течение 5 – 30 сут в зависимости от объема и плотности костной ткани. В процессе декальцинации раствор желательно сменить несколько раз.

Фиксатор-декальцинатор формалин/этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA). Состав: EDTA, динатриевая соль – 5,5 г; дистиллированная вода – 90 мл, формальдегид (37 – 40 %) – 10 мл. В этом растворе объекты можно не только декальцинировать, но и фиксировать, если для дальнейшего исследования пригодна формалиновая фиксация.

Декальцинирующий водный раствор EDTA. Состав: EDTA, динатриевая соль – 250 г, дистиллированная вода – 1750 мл. Этот раствор имеет pH 7,0 – 7,4. Если раствор мутный, нужно довести рН до 7,0 с помощью NaOH. При этом раствор должен стать прозрачным. Раствор используется после предварительной фиксации объектов.

Декальцинация маленьких объектов (Merchan-Perez А. [et al.], 1999).. Состав: аскорбиновая кислота – 1 г, хлорид натрия – 0,85 г, дистиллированная вода – 100 мл. Декальцинация этим раствором рекомендована при иммуногистохимическом изучении малых фрагментов костной ткани структур внутреннего уха (Merchan-Perez А. [et al.], 1999). Этот декальцинирующий раствор готовится непосредственно перед использованием и не может долго храниться.

Контроль за ходом декальцинации осуществляют в сочетании с заменой декальцинирующей жидкости. При использовании в качестве декальцинаторов слабых кислот тестирование на завершение декальцинации обычно проводят ежедневно. Для контроля последнего используют различные тесты (Некачалов В. В., 2000). Наиболее простыми являются пробный надрез, прокалывание кусочка препаровальной иглой. Для выполнения тестов требуется некоторый практический опыт, так как ни один из тестов не может быть признан удовлетворительным.

Химические тесты основаны на определении содержания кальция в декальцинирующей жидкости. Кальций-оксалатный метод позволяет обнаруживать в ней кальций за счет преципитации нерастворимых гидроокиси и оксалата кальция. Берут 3 мл использованной декальцинирующей жидкости, опускают в нее маленький кусочек лакмусовой бумаги и добавляют по каплям концентрированный (25 %) водный раствор аммиака до тех пор, пока раствор не станет нейтральным (взбалтывают после добавления каждой капли). Затем добавляют примерно 5 мл насыщенного при комнатной температуре раствора оксалата аммония, хорошо взбалтывают и оставляют на 30 мин. Образование преципитата свидетельствует о том, что в декальцинирующей жидкости имеется значительное количество кальция. Если исследуемая жидкость остается прозрачной в течение 30 мин, то декальцинация завершена.

ЛИТЕРАТУРА

1.  Некачалов В. В. Патология костей и суставов. – СПб.: Сотис, 2000. – 285 с.

2. Merchan-Perez A., Gilloyzaga P., Bartolome M. V. [et al.]. Decalcification by ascorbic acid for immuno– and affinohistochemical techniques on the inner ear // Histochem. Cell Biol. – 1999. – Vol. 112. – P. 125 – 130.

Глава 3
ОБЕЗВОЖИВАНИЕ ОБЪЕКТОВ И ЗАЛИВКА В ПАРАФИН

Обезвоживание фиксированных объектов обязательно предшествует их заливке в парафин. Из фиксированных объектов можно готовить срезы и без заливки при помощи замораживающего микротома (замораживающего столика) и вибратома.

Перед обезвоживанием материала производят подготовку фиксированных кусочков органов и тканей для гистологического исследования (вырезку). Вырезанные кусочки должны иметь толщину не более 0,8 см (оптимально – 0,3 – 0,5 см), длину и ширину в пределах 1,5 – 2,0 см, т. е. не более длины сторон стандартного покровного стекла. При использовании для проводки гистологических кассет размеры кусочка ткани ограничиваются размерами кассеты. Не рекомендуется изготавливать слишком крупные кусочки, так как если они будут плотно прилегать к стенкам кассеты, то пропитка материала растворами в этом месте будет плохая. Также не рекомендуется складывать несколько кусочков тканей в одну кассету, поскольку они могут слипнуться и плохо пропитаться.

Перед проводкой материала кусочки органов и тканей, которые были фиксированы в формалине, промывают в проточной воде (до 24 ч) и подсушивают на фильтровальной бумаге.

Для обезвоживания материала обычно используют несколько порций этилового спирта восходящей крепости. Для материала, фиксированного в формалине, рекомендуется начинать с 70 – 80 %-го этанола, в котором объекты могут находиться длительное время без существенного сжатия и изменения тинкториальных свойств. Кроме этанола для обезвоживания может быть применен безводный ацетон, изопропанол, диоксан, глицерин. Обезвоживание ускоряется при постоянном перемешивании жидкости, которое обеспечивают автоматизированные системы проводки карусельного типа (Sakura Rotary Tissue Processor, Leica TP1020, Microm STP 120, АТ-5).

Продолжительность пребывания объектов в спирте обусловлена их размерами, свойствами тканей и особыми задачами исследования (например, необходимостью максимального удаления липоидов из нервной ткани перед заливкой в целлоидин и окраской по Нисслю).

Для обезвоживания кусочков обычного размера (1,0 – 2,0 × × 1,0 – 1,5 × 0,5 – 0,8 см) можно рекомендовать следующие схемы ручной проводки (при комнатной температуре без постоянного перемешивания).

Первая схема:

– этанол 80 %-й – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (I) – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (II) – 18 – 24 ч;

– этанол абсолютный – 6 – 24 ч.

Вторая схема:

– этанол 80 %-й – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (I) – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (II) – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (III) – 18 – 24 ч.

Третья схема:

– этанол 80 %-й – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (I) – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (II) – 18 – 24 ч;

– метилсалицилат (или метилбензоат) – этанол 96 %-й (1: 1) – 2 ч;

– метилсалицилат (или метилбензоат) – 12 – 24 ч.

В метилсалицилате материал можно долго хранить без ухудшения качества препаратов (Коржевский Д. Э., 1996; Коржевский Д. Э. [и др.], 2008). Так как проводка через метилсалицилат и метилбензоат приводит к смягчению плотных объектов, ее полезно использовать при обработке кусочков кожи и органов, содержащих много мышечной и соединительной ткани.

Ускорения процесса обезвоживания можно добиться, вырезая кусочки тканей меньшего размера (например, 1,0 × 0,5 × 0,2 см), обеспечивая постоянное перемешивание растворов (например, в автоматизированной системе гистологической проводки) и проводя обезвоживание при 37 °C в термостате. Большее повышение температуры растворов не рекомендуется в связи с опасностью сжатия и чрезмерного уплотнения тканей. Плотные объекты (кожа, декальцинированная кость) не следует обезвоживать при повышенной температуре.

Для обезвоживания маленьких кусочков (размерами до 1,0 × 0,5 × 0,3 см) можно рекомендовать следующие схемы ручной проводки.

Первая схема:

– этанол 80 %-й – 6 – 8 ч;

– этанол 96 %-й (I) – 12 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (II) – 4 – 24 ч;

– этанол абсолютный – 2 – 4 ч (при комнатной температуре).

Вторая схема:

– этанол 80 %-й – 6 – 8 ч;

– этанол 96 %-й (I) – 12 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (II) – 6 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (III) – 3 – 5 ч (при комнатной температуре).

Третья схема:

– этанол 80 %-й – 2 – 4 ч;

– этанол 96 %-й (I) – 6 – 18 ч;

– этанол 96 %-й (II) – 2 – 4 ч;

– этанол 96 %-й (III) – 2 – 4 ч (при температуре 37 °C).

Высокое качество обезвоживания может быть достигнуто только при использовании этанола соответствующей крепости. Поэтому качество спирта необходимо проверять с помощью ареометра. Абсолютный спирт пригоден для обезвоживания (в качестве абсолютного спирта), если его крепость не ниже 98 %. Объем обезвоживающего раствора должен не менее чем в 10 раз превышать объем погруженных в него обезвоживаемых объектов. Абсолютный этанол можно заменить абсолютированным изопропанолом (99 %). Пригодна для этого и смесь абсолютированного изопропанола и этанола 96 %-го (1: 1).

Получение тонких срезов образцов исследуемых тканей возможно только после пропитывания последних достаточно плотными средами, какими являются парафин и целлоидин. В настоящее время целлоидин применяется очень редко.

Парафин – смесь высокомолекулярных предельных углеводородов, получаемая при перегонке нефти. Сорта парафина, используемые в качестве среды для гистологической заливки, имеют температуру плавления от 48 до 60 °C. Наиболее удобен в повседневной работе парафин с температурой плавления 52 – 56 °C. Без дополнительной подготовки технический, пищевой и медицинский парафины не позволяют производить заливку, обеспечивающую высокое качество срезов. В гистологической лаборатории желательно использовать очищенные сорта парафина с добавлением восков или специально разработанные на основе парафина среды с модифицирующими добавками, такие как гистомикс («БиоВитрум», Россия), Paraplast (Sigma, США), Histoplast (Shandon, США).

Пропитку парафином проводят в термостате, обеспечивающем поддержание температуры на 1 – 2 °C выше температуры плавления используемого парафина (обычно устанавливают температуру 58 °C).

Поскольку расплавленный парафин и этанол не смешиваются, из обезвоженного материала следует удалить спирт (или метилсалицилат, если он был использован для длительного хранения объектов) при помощи промежуточной среды – растворителя парафина, смешивающегося с этанолом. В качестве промежуточной среды можно использовать хлороформ, авиационный бензин (рекомендован Р. Лилли, 1969), петролейный эфир, ксилол, бензол, толуол, октан, гексан и др. В практической работе наиболее часто применяют хлороформ и ксилол. Неудовлетворительное качество заливки при использовании хлороформа может быть обусловлено применением хлороформа «для спектроскопии», в который добавлен этанол, разливного хлороформа (при использовании недостаточно просушенных после промывки емкостей) и реактива, долго хранившегося на свету. При доступности абсолютного этанола следует предпочесть менее токсичный петролейный эфир, который лучше удаляет этанол и позволяет достичь более высокого качества пропитки парафином.

Можно рекомендовать следующие схемы ручной проводки и пропитывания материала.

Заливка в парафин с использованием хлороформа. Обезвоженные объекты помещают последовательно в следующие среды:

– смесь абсолютного этанола с хлороформом 1: 1 – 1 – 2 ч;

– хлороформ (I) – 1 ч;

– хлороформ (II) – 1 ч;

– хлороформ (III) – 1 ч;

– хлороформ – парафин (1: 1) в термостате при 37 °C – 12 – 24 ч;

– парафин (I) в термостате при 56 – 58 °C – 40 – 60 мин;

– парафин (II) в термостате при 56 – 58 °C – 40 – 60 мин;

– парафин (III) в термостате при 56 – 58 °C – 40 – 60 мин.

При отсутствии возможности использовать абсолютный этанол первый этап проводки можно пропустить, однако качество пропитки парафином может быть несколько хуже. После обезвоживания с использованием метилсалицилата (или метилбензоата) этот этап следует пропустить. Качество заливки при этом не ухудшится.

Заливка в парафин с использованием петролейного эфира. Обезвоженные объекты помещают последовательно в следующие среды:

– петролейный эфир (I) – 30 – 60 мин;

– петролейный эфир (II) – 30 – 60 мин;

– петролейный эфир (III) – 30 – 60 мин;

– петролейный эфир-парафин (1:1) в термостате при 37 °C – 3 – 24 ч;

– парафин (I) в термостате при 56 – 58 °C – 60 мин;

– парафин (II) в термостате при 56 – 58 °C – 60 мин.

Схема проводки материала и заливки в парафин после фиксации объектов в жидкости Буэна, применяемая в отделе общей и частной морфологии НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН.

Перед фиксацией мелкие, тонкие и легко деформирующиеся объекты необходимо поместить на кусочек плотной бумаги. Обезвоженные объекты помещают последовательно в следующие среды:

– жидкость Буэна для фиксации – 1 сут;

– короткая промывка в водопроводной воде – 1 – 15 мин;

– этанол 70 %-й – 1 сут;

– этанол 80 %-й – 1 – 7 сут;

– этанол 90 %-й – 1 сут;

– этанол 96 %-й – 1 сут;

– абсолютный этанол – 1 сут;

– абсолютный этанол-хлороформ 1: 1 – 2 – 3 ч;

– хлороформ (I) – 90 мин;

– хлороформ (II) – 90 мин;

– хлороформ-парафин (1: 1) в термостате при 37 °C – оставить на ночь (10 – 15 ч);

– парафин (I) в термостате при 56 – 58 °C – 1 ч;

– парафин (II) в термостате при 56 – 58 °C – 1 ч;

– парафин (III) в термостате при 56 – 58 °C – 1 ч.

Автоматизация процесса замещения промежуточных сред на парафин достигается использованием вакуумных процессоров (например, VIP 6, Sakura), в которых не только происходит автоматическая смена и перемешивание реактивов, но и создаются специальные условия для лучшей пропитки тканей реагентами.

По окончании проводки осуществляется заливка. Объект помещают в бумажную или подогретую в термостате специальную пластиковую (из полипропилена, полистирола и т. п.) или металлическую формочку. Далее в нее наливают свежую порцию разогретого до 58 – 65 °C парафина. Разогрев заливочного парафина свыше 56 °C рекомендуется в связи с возможностью быстрого застывания парафина, вынутого из термостата, что приводит к неравномерной заливке блока с сохранением пустот. В случае необходимости особой ориентации кусочка ткани при изготовлении срезов можно повернуть материал, обратив плоскость резки ко дну формочки, с помощью подогретых препаровальной иглы и глазного пинцета.

Для получения лучшей консистенции парафинового блока и обеспечения более высокого качества срезов производят ускоренное охлаждение залитых объектов. Для этого формочки (бумажные или пластиковые) опускают в холодную воду. До тех пор пока парафин не застынет, формочки должны плавать на поверхности воды. Способ является крайне трудоемким и неудобным в связи с опасностью проникновения воды вовнутрь блока и его растрескивания и деформации. Поэтому формочки часто помещают на охлажденную поверхность (на специальный охлаждающий столик или в камеру холодильника при 4 °C). Не рекомендуется длительное охлаждение при температурах ниже 0 °C в связи с опасностью появления трещин в блоке.

Из затвердевшего парафина (обычно спустя час и более после заливки) подогретым скальпелем вырезают блоки таким образом, чтобы по периметру кусочка оставалась кайма парафина 1 – 2 мм. Если при изготовлении срезов прямоугольные кусочки должны располагаться более длинной стороной параллельно лезвию микротомного ножа, с более коротких сторон парафин может быть подрезан до края ткани. Сразу так поступать не обязательно, но если трудно расправить тонкие срезы, этот прием может быть полезен. Приготовленные блоки с помощью разогретого скальпеля или специальной лопаточки (шпателя) прикрепляют к деревянному блокодержателю, на котором карандашом, ручкой или фломастером надписывают номер объекта. К изготовлению срезов можно приступать после охлаждения блока.

Чтобы упростить и ускорить процесс ручной заливки, можно использовать специальные станции заливки (TEC5 (Sakura) и др.). В настоящее время выпускаются аппараты, обеспечивающие полностью автоматическое изготовление блоков, – AutoTEC (Sakura).

Если необходимо залить в парафин плотные ткани, из которых трудно изготовить качественные срезы, или нужно сохранить форму легко деформирующихся объектов (например, эмбрионов), рекомендуется комбинированная заливка в целлоидин-парафин. При планировании иммуногистохимических исследований использовать целлоидин-парафиновые методы заливки не рекомендуется из-за частого развития неспецифической фоновой реакции. Ее можно избежать, только предварительно удалив из срезов целлоидин.

Существует несколько методов первоначальной пропитки тканей слабыми растворами целлоидина. Приведем наиболее удачный (по простоте и качеству результатов) способ (подробнее см.: Коржевский Д. Э., 1996).

После обезвоживания в абсолютном или 96 %-м этаноле кусочки переносят в смесь равных объемов этанола и метилсалицилата на 1 – 24 ч (до просветления). Затем переносят объекты в чистый метилсалицилат и оставляют на 12 – 24 ч. Перекладывают материал в 1 – 2 % раствор целлоидина в метилсалицилате и оставляют на 3 – 7 сут. Увеличение времени пребывания в этой среде не сказывается отрицательно на качестве дальнейшей проводки и заливки. Затем отмывают объект от метилсалицилата петролейным эфиром или хлороформом (2 – 3 порции по 15 – 30 мин) и переносят в петролейный эфир-парафин или хлороформ-парафин (37 °C) или сразу в первый заливочный парафин. Далее продолжают заливку в соответствии с одной из рекомендованных прописей.

Для приготовления раствора целлоидина в метилсалицилате берут 1 – 2 г целлоидина в хлопьях и помещают в плотно закрывающуюся емкость со 100 мл метилсалицилата, ставят в термостат (37 °C) на 2 – 3 нед. Раз в сутки емкость желательно встряхивать для ускорения растворения целлоидина. Готовый раствор представляет собой прозрачную, слегка желтоватую сиропообразную жидкость, которая может долго храниться при комнатной температуре.

ЛИТЕРАТУРА

1. Коржевский Д. Э. Использование метилсалицилата в качестве промежуточной среды при заливке в парафин // Морфология. – 1996. – Т. 109, № 1. – С. 105.

2. Коржевский Д. Э., Гиляров А. В. Иммуноцитохимическое выявление тканевых антигенов после длительного хранения объектов в метилсалицилате // Морфология. – 2008. – Т. 134, № 6. – С. 76 – 78.

3. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. – М.: Мир, 1969. – 643 с.