Текст книги "Анализы. Полный медицинский справочник. Ключевые лабораторные исследования в одной книге"

Принцип метода

Исследуемая биологическая жидкость титруется раствором азотнокислой ртути, образующаяся каломель выпадает в осадок. Когда весь хлор связан, избыток ионов ртути образует с индикатором дифенилкарбазоном темное, сине-лиловое окрашивание, что служит признаком конца титрования.

Необходимые реактивы

1. Ртуть азотнокислая, раствор 6 ммоль/л: 2 г Hg(NO₃)₂ × 0,5Н₂О растворяют в 200 мл воды, добавляют 20 мл 2 н азотной кислоты и доводят водой до 1 л.

2. Дифенилкарбазон, спиртовой раствор: 100 мг дифенилкарбазона растворяют в 100 мл 96%-ного этилового спирта, хранят в посуде из темного стекла в холодильнике (стоек в течение месяца).

3. Азотная кислота, 2 н: 14 мл концентрированной азотной кислоты (плотность 1,4) разводят в 100 мл воды.

4. Калибровочный раствор, 10 ммоль/л: хлорид натрия (поваренная соль) высушивают до постоянной массы при температуре 120 °С, 584 мг препарата растворяют в воде и доводят объем до 1 мл.

Ход исследования

Сначала устанавливают величину фактора раствора для титрования (титранта). Для этого в маленький стаканчик или колбочку вносят 2 мл калибровочного раствора и 4 капли (0,2 мл) раствора фенилкарбазона, постоянно перемешивая, титруют раствором азотнокислой ртути до появления темного окрашивания. Фактор титранта вычисляют, разделив 20 (количество микромолей хлорид-ионов в калибровочной пробе) на число миллилитров, пошедших на титрование. Фактор указывает, какому количеству микромолей хлорид-ионов соответствует 1 мл титранта.

При исследовании опытной пробы поступают аналогично: в маленький стаканчик или колбочку наливают 1,8 мл воды и вносят 0,2 мл исследуемой биологической жидкости, добавляют 4 капли (0,2 мл) раствора дифенилкарбазона и титруют раствором азотнокислой ртути при постоянном перемешивании до появления темной окраски. Удобнее всего перемешивать магнитной мешалкой. На титрование сыворотки должно пойти примерно 3 мл титранта.

Раствор азотнокислой ртути можно приготовить из красной окиси ртути. Для этого 1,3 г HgO растворяют в 11 мл концентрированной азотной кислоты и доводят объем водой до 1 л. Раствор дифенилкарбазона должен быть красно-оранжевого цвета; если окраска становится желтой или вишнево-красной – реактив непригоден.

Микроэлементы

К микроэлементам относят химические элементы, содержание которых в организме колеблется от нескольких микрограммов до нескольких нанограммов. Несмотря на такое мизерное количество, их влияние на биохимические процессы и функции организма очень существенно, так как они входят в состав ферментов, комплексы белков и нуклеиновых кислот, являются катализаторами многих процессов. Избыток или недостаток микроэлементов может приводить к тяжелым расстройствам функций клеток и органов. Определение концентрации микроэлементов проводят только в специализированных лабораториях и в особых случаях, так как, во-первых, нарушение баланса микроэлементов как самостоятельная причина заболеваний встречается редко, и, во-вторых такой анализ продолжителен и дорогостоящ в силу сложности и трудоемкости.

Для анализа используют не только кровь, мочу или ткани, но и волосы, иногда – ногти, где микроэлементы накапливаются и долго сохраняются.

Ниже мы остановимся только на тех показателях, которые имеют наибольшее диагностическое значение.

Железо

Железо входит в состав молекул гемоглобина, миоглобина, цитохромов и некоторых ферментов. Общее содержание в организме – 4–5 г. Основная часть, около 70%, входит в состав гемоглобина, 20–25% находится в запасных депо (в печени, селезенке, костном мозге) в виде ферритина и гемосидерина. Переносится в организме в составе специального транспортного белка – трансферрина. Из пищи усваивается около 10–15% железа, поэтому суточная потребность составляет 12–15 мг.

Лабораторными анализами определяется плазменное железо, которое в основном связано с трансферрином, ферритином и внеэритроцитарным (внутрисосудистым) гемоглобином. В норме трансферрин насыщен железом примерно на 30%. Дополнительное количество железа, которое может связаться с трансферрином, определяется как «ненасыщенная железосвязывающая способность сыворотки крови» (НЖСС). Максимальное количество железа, которое может присоединить трансферрин, обозначается как «общая железосвязывающая способность сыворотки крови» (ОЖСС).

Нормальная концентрация плазменного железа у мужчин – 12–32 мкмоль/л, ОЖСС – 54–72 мкмоль/л, НЖСС – 26,9–41,2 мкмоль/л; у женщин эти показатели на 10–15% ниже.

Нормальное насыщение трансферрина железом: у мужчин – 25,6–48,6%, у женщин – 25,5–47,6%.

Железо, высвобождающееся при разрушении старых эритроцитов, не выводится из организма, а используется повторно для синтеза гемоглобина. Наибольшая потеря железа происходит при кровопотерях – физиологических (менструация) и патологических (желудочные, кишечные, легочные, маточные, геморроидальные и другие кровотечения). В связи с этим у женщин потребность в железе примерно вдвое выше, чем у мужчин. При беременности женщина теряет около 350 мг железа, которое идет на формирование депо у ребенка.

Причинами дефицита железа могут быть его недостаточность в пище (однообразное питание с низким содержанием животных белков и зелени) и нарушение всасывания при недостатке витамина С, заболеваниях желудка и кишечника (атрофические процессы, удаление части желудка, воспалительные процессы), злокачественных заболеваниях. На начальных этапах недостаток поступления или большие потери железа компенсируются его запасами из депо. Выраженная недостаточность проявляется снижением содержания гемоглобина и цветного показателя – железодефицитной анемией.

Это весьма распространенное заболевание, особенно у беременных. Определение уровня сывороточного (плазменного) железа и трансферрина позволяет проводить дифференциальную диагностику железодефицитной анемии с другими формами анемий, назначать соответствующее лечение и объективно судить об его эффективности.

Значительное увеличение сывороточного железа с высоким (до 85%) насыщением трансферрина отмечается при различных по природе (наследственных или приобретенных) гемохроматозах – заболеваниях, характеризующихся повышенным всасыванием железа в кишечнике и отложением в органах и тканях железосодержащих пигментов.

Подавляющая часть всего железа человеческого организма находится внутри эритроцитов и входит в состав гемоглобина. Каждая его молекула содержит 4 атома двухвалентного железа, на долю которых приходится 0,334% ее массы, что при концентрации гемоглобина в крови 140 г/л соответствует содержанию железа 500 мг/л крови. Определение содержания железа в цельной крови не имеет практического значения, так как определять гемоглобин значительно проще. Иное дело плазма крови, содержание железа в которой примерно в 300 раз ниже и составляет около 1,5 мг/л. Его большая часть находится в окисленном состоянии, т. е. трехвалентна, и связана с белком трансферрином (сидерофилином); кроме того, в плазме имеются геминовое железо, ферритин и внутрисосудистый гемоглобин. Так называемое геминовое железо входит в состав молекул, содержащих только по одной порфириновой группе. Это продукты неполного синтеза или распада гемоглобина и дыхательных ферментов, они связаны с транспортным сывороточным белком гемопексином. Ферритин – самый богатый железом сывороточный белок, в его составе находится мицелла, содержащая до 4300 атомов окисленного железа. Молекулы гемоглобина, образовавшиеся в результате внутрисосудистого гемолиза, содержат 4 порфириновых кольца, они связываются не с гемопексином, а с гаптоглобином. Разрушение эритроцитов и увеличение содержания в плазме свободного гемоглобина почти неизбежны при взятии крови. Считается, что при соблюдении всех предосторожностей (игла с широким просветом, свободное вытекание крови, центрифугирование в течение 45 мин при скорости 2500 об./мин, отсасывание сыворотки и повторное центрифугирование) удается уменьшить количество свободного гемоглобина в сыворотке лишь до уровня около 30 мг/л, что соответствует содержанию железа 100 мкг/л или примерно 1/15 всего железа сыворотки. Используемые при получении плазмы антикоагулянты сами связывают железо, поэтому рекомендуется исследовать содержание железа именно в сыворотке.

Железо поступает в организм через желудочно-кишечный тракт, а выводится почти исключительно с калом (конечно, если нет кровотечения или гематурии), поэтому содержание его в моче у здоровых людей очень мало – 0,7–5,7 нмоль/сутки (0,04–0,3 мкг), это количество не может быть уловлено обычными методами. После приема некоторых железосодержащих препаратов или комплексообразователя десферала, который способствует опустошению депо, выведение железа с мочой значительно увеличивается и может быть измерено. Состояние обмена железа лучше всего характеризует количество негеминового сывороточного железа, т. е. железа трансферрина и ферритина, так как это основной резерв, который используется организмом в случае необходимости. Общее количество трансферрина, связанного с железом и свободного, может быть определено также иммунологическими методами. Определяют количество свободного трансферрина и по его способности связывать радиоактивное железо. Для практических лабораторий, использующих обычные биохимические методы, наибольшее значение имеет определение негеминового железа сыворотки, а также ее железосвязывающей способности, т. е. того максимального количества трехвалентного железа, которое может связаться с белками сыворотки.

Прочность комплекса трансферрин – железо максимальна при рН 7,0 и зависит от природы буферного раствора. При увеличении кислотности, а также восстановлении железа комплекс распадается. Другие соединения, например гемоглобин, в этих условиях не разрушаются или разрушаются лишь незначительно, поэтому кислотноотщепляемое, или негеминовое, железо лучше других компонентов плазмы характеризует резервы железа в организме.

Существуют несколько вариантов методов определения негеминового железа. В частности, некоторые рекомендуют проводить нагревание на водяной бане для лучшего разрушения комплекса, но при этом всегда существует угроза, что разрушатся и другие железосодержащие соединения, поэтому результаты анализа будут завышенными.

Известно много цветных реактивов как на восстановленное (Fe⁺²), так и на окисленное (Fe⁺³) железо; лучшие результаты получаются с батофенантролином, который образует наиболее прочный и ярко окрашенный комплекс. Но батофенантролин не растворяется в воде, поэтому его надо предварительно обработать хлорсульфоновой кислотой либо использовать спиртовой раствор. При определении железа после минерализации с серной кислотой надо всегда иметь в виду, что почти неизбежно образующаяся в этих условиях пирофосфорная кислота, связывая железо, мешает проведению цветной реакции, поэтому ее надо разрушать, нагревая на водяной бане слегка разбавленный минерализат.

Условия взятия материала

Определение сывороточного железа обычно проводят для выявления железодефицитного состояния, поэтому, как правило, информативно уменьшение его содержания. Обследуемые по крайней мере в течение 2 недель перед взятием крови не должны получать железосодержащих препаратов. Кровь надо брать широкими иглами. Сыворотка должна быть свободна от видимых следов гемолиза.

Принцип метода

Белки осаждают трихлоруксусной кислотой, которая при прогревании разрушает также комплекс железа с трансферрином. Для установления оптимальной величины рН 4,8–5,0 добавляют аммония ацетат, а для восстановления всего железа – гидразин. Двухвалентное железо образует окрашенный комплекс с батофенантролином, который переведен в сульфатированную форму добавлением хлорсульфоновой кислоты.

Необходимые реактивы

1. Трихлоруксусная кислота, 20%-ная.

2. Аммония ацетат: 70 г ацетата аммония (CH₃COONH₄) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл, препарат гигроскопичен.

3. Гидразина сульфат, насыщенный раствор, готовят, заливая 2,5 г препарата 100 мл воды.

4. Раствор сульфонированного батофенантролина: в пробирке к 100 мг батофенантролина (4,7-дифенил-1,10-фенантролина) приливают 0,5 мл хлорсульфоновой кислоты, нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 с, охлаждают и медленно приливают 10 мл воды, после чего снова нагревают на водяной бане в течение 5 мин и разбавляют 100 мл воды, добавляя 5 н NaOH, устанавливают рН 4,0 и доводят объем водой до 200 мл.

5. Калибровочный раствор железа, содержащий 30 мкмоль/л. Сначала готовят раствор соли Мора (железо-аммиачные квасцы, аммоний-железо II сернокислое), FeSO₄ × (NH₄)SO₄ × 6H₂O, содержащий 3 ммоль/л, растворяя 1,178 г в 5 мл 0,3 н НСl и доводя объем до 1 л водой, содержащей в 1 л 1 мл концентрированной серной кислоты. Этот раствор разводят подкисленной водой в 100 раз; получается раствор, содержащий 30 мкмоль/л, или 1,67 мкг/мл.

Ход исследования

К 2 мл исследуемой сыворотки прибавляют 2,5 мл воды и 1,5 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и ставят на 15 мин на водяную баню температурой 90–95 °С. Затем центрифугируют в течение 20 мин при скорости 2000 об./мин и отбирают 4 мл прозрачного слоя, к которым приливают 0,35 мл 70%-ного раствора аммония ацетата и 0,3 мл раствора сульфата гидразина. Смесь фотометрируют при длине волны 535 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см, затем прибавляют 0,4 мл раствора сульфонированного батофенантролина, оставляют на 1 ч и снова фотометрируют при той же длине волны. Обе фотометрии выполняют против холостого опыта, в котором берут вместо исследуемой сыворотки 2 мл воды.

Калибровку проводят так же, как и основной опыт, но вместо сыворотки берут 2 мл калибровочного раствора.

Расчет сывороточного железа (мкмоль/л) выполняют по формуле:

Е_оп1– Е_оп2/ Е_к1– Е_к2× 30,

где Е_оп1 и Е_оп2 – отсчеты опытной пробы до и после прибавления раствора сульфонированного батофенантролина;

Е_к1 и Е_к2 – соответственно результаты фотометрии калибровочной пробы;

30 – содержание железа в калибровочном растворе, мкмоль/л.

Надо тщательно следить за содержанием железа в дистиллированной воде и реактивах, используя в случае необходимости бидистиллированную воду, приготовленную в стеклянном перегонном аппарате. Если после удаления белков не удается набрать точно 4 мл надосадочной жидкости, можно взять меньшее ее количество и сделать поправку при Расчете или же взять точно такое же количество калибровочного раствора.

Принцип метода

Сывороточное железо восстанавливают тиогликолевой кислотой, белки осаждают трихлоруксусной кислотой, в фильтрате устанавливают нужную величину рН, добавляя ацетат натрия, и проводят цветную реакцию с батофенантролином. В связи с тем что он в воде не растворяется, используют спиртовой раствор.

Необходимые реактивы

1. Кислота тиогликолевая, кислота трихлоруксусная, раствор 400 г/л.

2. Натрия ацетат, насыщенный раствор (в случае необходимости его очищают от следов железа, растворяя 500 г в 1 л воды при 37 °С). К прозрачной надосадочной жидкости добавляют раствор батофенантролина из Расчета 10 мл на 1 л и этиловый спирт в количестве, равном количеству надосадочной жидкости; на холоде выпадают кристаллы СН₃СООNа × 3Н₂О.

3. Батофенантролин, 40 мг в 100 мл этанола.

4. НСl 1 н раствор.

5. Калибровочный раствор железа: 100 мг мягкой железной проволоки растворяют в 4 мл концентрированной НСl и разводят до 1 л водой, получается раствор, содержащий 100 мкг/мл. Из него разведением в 60 раз получают раствор, содержащий 30 мкмоль/л (1,67 мкг/л).

Учитывая, что метод определения очень чувствительный, необходимо принять все меры, чтобы реактивы и посуда не содержали железа, присутствие которого выявляется при постановке холостых проб. Посуду, в том числе пробирки для взятия крови, необходимо обрабатывать разбавленной НСl; должна использоваться только деионизированная или перегнанная в стеклянной посуде вода; реактивы очищаются перекристаллизацией.

Ход исследования

К 0,7 мл сыворотки прибавляют 2 капли тиогликолевой кислоты, взбалтывают, а затем еще 0,35 мл 1 н НСl, опять перемешивают и прибавляют 0,2 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Энергично размешивают стеклянной палочкой в течение 45 с, а затем центрифугируют при скорости 2500 об./мин. В пробирку с притертой пробкой отбирают из надосадочной жидкости 0,7 мл, к которым прибавляют 0,6 мл насыщенного раствора аммония ацетата и 0,7 мл раствора батофенантролина. Окраска развивается за 20–30 с. Фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 536 нм против холостой пробы, в которой вместо сыворотки берут 0,7 мл воды. Одновременно обрабатывают и калибровочную пробу, в которой вместо сыворотки используют 0,7 мл калибровочного раствора, содержащего 30 мкмоль железа в 1 л.

Расчет проводят по правилу пропорций.

Принцип метода

Исследуемую сыворотку выдерживают с раствором трехвалентного железа, при этом весь трансферрин насыщается. Избыток солей железа удаляют адсорбцией на карбонате магния и определяют содержание железа в надосадочной жидкости одним из приведенных выше методов.

Необходимые реактивы

1. Железо хлорное, 5 мг/мл: 2,42 г FeCl₃ × 6H₂O растворяют в 100 мл 0,005 н HCl.

2. Магния карбонат в порошке.

3. Все реактивы, необходимые для определения сывороточного железа одним из описанных выше методов.

Ход исследования

К 2 мл исследуемой сыворотки добавляют 4 мл раствора хлорного железа и тщательно перемешивают. Через 5 мин прибавляют порошок магния карбоната в объеме примерно 0,5 мл, встряхивают в течение 10–15 с и центрифугируют. В надосадочной жидкости определяют железо одним из описанных выше методов. Полученный результат умножают на 3 (разведение сыворотки).

Принцип метода

Моча минерализуется с серной кислотой, образовавшийся пирофосфат железа разрушается гидролизом на кипящей водяной бане, раствор нейтрализуется ацетатом аммония, железо восстанавливается сульфатом гидразина, и проводится цветная реакция с сульфонированным батофенантролином.

Необходимые реактивы

1. Кислота серная концентрированная.

2. Перекись водорода, 30%-ный раствор в воде (пероксид).

3. Сульфат гидразина, насыщенный раствор: 2,5 г вещества заливают 100 мл воды.

4. Аммония ацетат, насыщенный раствор: к 148 г соли добавляют 100 мл воды.

5. Раствор сульфонированного батофенантролина.

6. Калибровочный раствор железа, содержащий 30 мкмоль/л.

Ход исследования

В колбу Кьельдаля помещают 5 мл исследуемой мочи и 1 мл концентрированной серной кислоты и нагревают на электрической плитке с закрытой спиралью или на песчаной бане; не должно быть бурного кипения и образования пены, которая поднималась бы в горлышко колбы. В конце сжигания должны образовываться тяжелые белые пары, занимающие нижнюю часть колбы. Когда материал потемнеет и объем его уменьшится примерно наполовину, добавляют несколько капель пергидроля, что способствует просветлению пробы. Сжигание проводят до тех пор, пока раствор не станет совсем светлым. После охлаждения доливают 10 мл воды и ставят на кипящую водяную баню на 5–10 мин, после чего объем пробы доводят водой до 20 мл. Отбирают 4 мл, к которым прибавляют 0,3 мл насыщенного раствора сульфата гидразина и 1,2 мл насыщенного раствора ацетата аммония, после чего фотометрируют при длине волны 535 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см, прибавляют 0,5 мл раствора сульфонированного батофенантролина и оставляют на 1 ч, затем повторно фотометрируют в тех же условиях.

В норме этим методом железо в моче не определяется.

Медь

Медь входит в состав ферментов, участвующих в процессах кроветворения, иммунных реакциях.

Нормальная концентрация в сыворотке крови – 11–24 мкмоль/л. 90–92% этого количества связано с α2-глобулинами, в частности церулоплазмином, и менее 10% находится в свободном состоянии.

Снижение концентрации меди в крови – характерный признак болезни Коновалова—Вильсона – наследственно обусловленного снижения синтеза (вплоть до полного прекращения) церулоплазмина и нарушения транспорта меди, приводящих к увеличению содержания меди в тканях, прежде всего в печени и головном мозге. При этом концентрация не связанной с церулоплазмином меди значительно увеличивается.

Повышение уровня церулоплазмина и соответственно меди в крови отмечается при многих заболеваниях, но не является для них информативным анализом. У рабочих медных рудников может развиваться профессиональный гиперкупреоз – избыточное содержание меди.