Текст книги "Анализы. Полный медицинский справочник. Ключевые лабораторные исследования в одной книге"

ГГТП катализирует перенос γ-глутамила с глутатиона на аминокислоту или пептид. Фермент занимает важное место в метаболизме аминокислот. В почках фермент играет главную роль в реабсорбции аминокислот из первичной мочи.

ГГТП располагается в основном на мембранах клеток, обладающих высокой секреторной активностью, – эпителиальных клеток, выстилающих желчные пути, печеночные канальца, проксимальные канальца нефрона, клеток панкреатической экзокринной ткани, выводных протоков, ворсинчатых клеток тонкой кишки. В порядке снижения активности ГГТП ткани располагаются почки, печень, поджелудочная железа, щеточная кайма клеток тонкой кишки. Предполагают, что в печени ГГТП связывает молекулы веществ, которые необходимо экскретировать.

Повышение активности ГГТП сопровождает все заболевания печени. Наиболее часто увеличение активности ГГТП при заболеваниях печени и желчевыводящих путей считают результатом нарушения оттока желчи и повышения содержания ГГТП в гепатоцитах. Регургитация желчи, поступление ее в кровоток, с одной стороны, освобождает ГГТП из мембран эпителия, выстилающего желчные пути, с другой – повышает активность фермента в крови.

Увеличение активности ГГТП всегда сопровождается внутри– и внепеченочной обтурацией желчных протоков, а также вторичным вовлечением печени в онкологические процессы организма путем метастазирования.

Желтуха всегда сопровождается увеличением активности ГГТП. Высокая активность фермента связана с нарушением проходимости желчных протоков, менее высокая соответствует острому гепатоцеллюлярному поражению. При остром вирусном гепатите многократное исследование активности ГГТП позволяет следить за течением болезни, постоянное повышение активности ГГТП свидетельствует о развитии хронической формы заболевания.

Исследование активности ГГТП применяется для выявления лиц, принимающих алкоголь, при контроле над хроническими алкоголиками в процессе их лечения.

Принцип метода

γ-глутамилтрансфераза (ГГТ, γ-ГТФ) переносит глутамиловый остаток с γ-L-(+)глутамил-4-нитроанилина на дипептидный акцептор, которым является глицилглицин, служащий одновременно и буфером.

Концентрацию освобожденного 4-нитроанилина измеряют фотометрически, после остановки ферментативной реакции подкислением.

Пределы активности:

1) мужчины – 11–49 Ед/л × 0,017 или 0,19–0,83 мккат/л;

2) женщины – 7–32 Ед/л × 0,017 или 0,12–0,54 мккат/л.

Необходимые реактивы

1. L-γ-глутамил-п-нитроанилид.

2. Натрия хлорид.

3. Глицилглицин, 0,55 моль/л, рН 8,3: 3,63 г глицилглицина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доливают до метки водой и растворяют (буферный раствор).

4. Субстратно-буферный раствор: в пробирку наливают 10 мл воды, добавляют 0,028 г L-γ-глутамил-п-нитроанилида и 0,082 г хлорида натрия и, не переставая мешать, растворяют содержимое пробирки на кипящей водяной бане в течение 60 с. Затем раствор охлаждают до температуры 37 °С и добавляют 2,5 мл буферного раствора.

Приготовленный раствор субстрата во время работы хранят в водяной бане при 37 °С. Неиспользованный раствор субстрата можно хранить в холодильнике в течение недели. Субстрат плохо растворим и при комнатной температуре выпадает в осадок. Поэтому перед употреблением выкристаллизовавшийся субстрат растворяют нагреванием в кипящей водяной бане. Нагревание и растворение субстрата можно повторить не более 2 раз.

5. Уксусная кислота ледяная, раствор 100 г/л: 10 мл кислоты доводят водой до 100 мл.

6. Основной калибровочный раствор п-нитроанилина: 0,0829 г п-нитроанилина помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки водой и растворяют. Для определения активности γ-ГТФ можно пользоваться набором реактивов «Лахема».

Ход определения

Опытная проба: в пробирку вносят 0,5 мл раствора субстрата и помещают в водяную баню при температуре 37 °С, приливают 0,05 мл сыворотки крови; содержимое перемешивают и инкубируют точно 15 мин при температуре 37 °С. Затем прибавляют 3 мл раствора уксусной кислоты и перемешивают. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.

Измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм или на ФЭК при длине волны 400–500 нм (фиолетовый или синий светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 1 см против холостой пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов.

Расчет активности производят по калибровочной кривой. Построение калибровочной кривой: из основного калибровочного раствора готовят рабочие растворы так, как указано в таблице 17.

Таблица 17

Определение активности γ-глутамилтранспептидазы

В каждую из шести пробирок наливают по 0,05 мл рабочих калибровочных растворов № 1–6, прибавляют по 3,5 мл раствора уксусной кислоты, перемешивают и измеряют экстинкцию против раствора уксусной кислоты при тех же условиях, что и опытную пробу. По полученным значениям экстинкции строят калибровочную кривую. Линейность калибровочного графика сохраняется до активности 5000 нмоль/(с × л).

Клинико-диагностическое значение

Значительное повышение активности ГГТП имеет место при обструктивных поражениях печени, внепеченочной обтурации желчных протоков. Повышение активности возникает при таких заболеваниях печени, как цирроз, гепатит, при инфекционном мононуклеозе, пересадке почки, гипертиреоидизме, сахарном диабете, панкреатите, алкоголизме, при раке поджелудочной железы, раке предстательной железы, гепатоме.

КК катализирует обратимую реакцию образования креатинфосфата из креатина и АТФ. Креатинфосфат является макроэргическим фосфатом, используемым мышцами для сокращения, расслабления и транспортировки метаболитов. Молекулы КК имеют свои особенности распределения в организме. Существуют 3 активных изофермента КК: мышечный изоэнзим-КК-ММ, сердечный изоэнзим-КК-МВ, мозговой изоэнзим-КК-ВВ.

Установлено, что в сыворотке крови здоровых людей активность ММ-изофермента составляет около 95% общей активности КК, около 5% приходится на активность КК-МВ. При остром инфаркте миокарда спустя 4–6 ч после развития очага повышается активность КК. Максимум активности КК выявляется в течение 12–36 ч, увеличение активности происходит в основном в результате подъема активности КК-МВ.

Принцип метода

Креатинкиназа катализирует превращение креатинина в креатинфосфат. Ион фосфата, освобожденный при гидролизе креатинфосфата, определяют после депротеинирования как желтый комплекс фосфорно-ванадиево-молибденовой кислоты.

Посуда для определения креатинкиназы не должна содержать следы фосфатов.

Повторные внутримышечные инъекции могут вызвать значительное повышение концентрации креатинкиназы в сыворотке крови.

Пределы активности:

1) мужчины – 10–65 Ед/л × 0,017 или 0,17–1,11 мккат/л;

2) женщины – 7–55 Ед/л × 0,017 или 0,12–0,94 мккат/л.

Необходимые реактивы

1. Аденозин-5-трифосфорной кислоты динатриевая соль.

2. L-цистеин, 0,024 моль/л: 2,9 мг растворяют в 1 мл воды. Готовят раствор перед употреблением. На одну пробу требуется 0,1 мл.

3. Креатин.

4. Магния сульфат 7-водный.

5. Аммоний молибденовокислый 4-водный, 0,02 моль/л: 2,5 г молибденовокислого аммония растворяют в мерной колбе в 70–80 мл воды и доводят объем до 100 мл водой.

6. Натрия сульфат безводный.

7. Натрий пиросернистокислый (метабисульфит натрия).

8. 1-амино-2-нафтол-4-сульфокислота (эйконоген).

9. Серная кислота, 2,5 моль/л.

10. НСl, 0,1 моль/л.

11. Трис-(оксиметил)-аминометан (трис).

12. Трис-буфер, 0,133 моль/л, рН 9,0: 1,61 г трис растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в 50–60 мл воды, устанавливают рН буфера 0,1 моль/л раствором НСl и доводят водой до метки.

13. Раствор эйконогена: 15,36 г пиросернистокислого натрия, 0,512 г сернистокислого натрия и 0,128 г эйконогена растворяют в 70–80 мл воды, взбалтывают, доводят объем водой в мерной колбе до 100 мл и дважды фильтруют (через 2 ч и через сутки после приготовления). Раствор следует беречь от яркого света; в случае выпадения осадка вновь фильтруют. Стабилен в течение 1 месяца при хранении в холодильнике.

14. Основная смесь реактивов, содержащая 0,02 моль/л сульфата магния, 0,033 моль/л креатина и 0,0067 моль/л АТФ: 0,4920 г сульфата магния, 0,4326 г креатина и 0,3692 г АТФ растворяют в 70–80 мл трис-буфера (для полного растворения креатина смесь нагревают в течение 5–10 мин на водяной бане при температуре 40–45 °С). Затем объем основной смеси реактивов доводят трис-буфером в мерной колбе до 100 мл.

15. Трихлоруксусная кислота, 4,9 моль/л: 80 г ТХУ растворяют в 50–60 мл воды и объем раствора доводят в мерной колбе до 100 мл.

16. Смесь растворов для проведения кислотного гидролиза креатинфосфата. Смесь готовят перед употреблением, учитывая, что на одну пробу расходуют 2 мл. Смесь состоит из 0,25 мл раствора молибденовокислого аммония, 0,25 мл раствора серной кислоты и 1,5 мл воды (соотношение 1 : 1 : 6).

17. Калия фосфат однозамещенный безводный (для приготовления калибровочного раствора): 0,0169 г КН₂РО₄ растворяют в воде и объем раствора доводят в мерной колбе до 100 мл.

Специальное оборудование

Фотоэлектроколориметр.

Ход определения

Предварительно все растворы реактивов прогревают в течение 5 мин при температуре 37 °С. Опытная проба: в пробирку вносят 1,5 мл основной смеси реактивов, 0,1 мл раствора цистеина и 0,4 мл сыворотки крови.

Содержимое пробирки осторожно перемешивают и ставят в термостат при температуре 37 °С на 30 мин. Затем прибавляют 0,2 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют при скорости 3000 об./мин в течение 10 мин. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после прибавления раствора трихлоруксусной кислоты. Из опытной и холостой проб забирают по 1 мл надосадочной жидкости и переносят в химические пробирки (маркированные соответствующим образом), в которых содержится по 2 мл смеси растворов для проведения специфического гидролиза креатинфосфата. Полученную смесь растворов перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин (время гидролиза креатинфосфата). После этого в пробы добавляют с интервалом в 1 минуту по 0,25 мл раствора эйконогена и точно через 15 мин опытную пробу измеряют против холостой пробы при длине волны 600–700 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 0,5 см.

Расчет производят по калибровочному графику. Построение калибровочного графика; готовят калибровочные пробы так, как указано в таблице 18.

Таблица 18

Исследование активности креатинкиназы

Из каждого калибровочного раствора берут по 0,4 мл и обрабатывают так, как опытные пробы. В холостую пробу вместо калибровочных растворов берут по 0,4 мл воды.

Примечание

Если активность КК превышает 500 нмоль/(с×л), то время инкубации сокращают до 15 или 10 мин; полученные величины активности умножают соответственно на 2 или 3. Разбавлять сыворотку не рекомендуется, так как активность фермента при разведении сыворотки изменяется непропорционально.

Клинико-диагностическое значение

Активность общей креатинкиназы повышается при многих заболеваниях: инфаркте миокарда, сахарном диабете, гипотиреозе, мышечных травмах, а также после внутримышечных инъекций, больших физических нагрузок, при дигитализации, хирургических вмешательствах, при мышечных дистрофиях всех типов, инфекционных болезнях, дефибрилляции, застойной сердечной недостаточности, тахикардии, эмболии легочной артерии, генерализованных судорогах, обширном инфаркте мозга, беременности, опухолях предстательной железы, мочевого пузыря, желудочно-кишечного тракта, отеке легкого, остром психозе, травмах головы, инфарктах желудочно-кишечного тракта.

Среди пациентов кардиологического отделения подъем активности КК имеет чувствительность 97%, специфичность 67% для инфаркта миокарда.

Лактатдегидрогеназа – гликолитический фермент, обратимо катализирующий окисление L-лактата в пировиноградную кислоту. Для лактатдегидрогеназы в качестве промежуточного акцептора водорода требуется НАД.

Реакция, катализируемая лактатдегидрогеназой, может быть представлена в следующем виде:

L-лактат + НАД ↔ пируват + НАД Н + Н⁺.

Фермент широко распространен в организме человека. По степени убывания активности энзима органы и ткани могут быть расположены в следующем порядке: почки, сердце, скелетные мышцы, поджелудочная железа, селезенка, печень, легкие, сыворотка крови. В последней обнаружено несколько различных белков (изоэнзимов), обладающих каталитическими свойствами этого фермента.

Изменения в строении белковой части изофермента обусловливают их различные физико-химические свойства, что, в частности, сказывается в неодинаковой электрофоретической подвижности разновидностей этого фермента в агаровом, крахмальном, полиакриламидном и других гелях. В сыворотке крови обнаружены 5 изоэнзимов лактатдегидрогеназы: ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4, ЛДГ5, располагающихся в геле в порядке убывания их электрофоретической подвижности.

Установлено, что фракция ЛДГ1 происходит в основном из ткани сердца, ЛДГ5 – из печени.

В отличие от последней ЛДГ1 обладают большей устойчивостью к действию мочевины.

Лактатдегидрогеназа содержится не только в сыворотке, но и в значительном количестве в эритроцитах, поэтому сыворотка, используемая для анализа, должна быть свежей, лишенной следов гемолиза.

Исследование общей активности фермента характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов организма, а определение активности отдельных изоэнзимов ЛДГ способствует диагностике некоторых заболеваний сердца, печени и других органов.

Принцип метода

Лактатдегидрогеназа (L-лактат; НАД-оксидоредуктаза) катализирует превращение лактата в пируват при одновременном восстановлении НАД в НАД(Н), который далее восстанавливает в присутствии N-метилфеназонийметилсульфата йоднитротетразолиевый фиолетовый в красный формазан.

Одновременно с определением общей каталитической активности лактатдегидрогеназы можно определять и долю фермента, устойчивого к действию мочевины, что характерно главным образом для изофермента сердечной фракции.

Пределы активности:

1) ЛДГ при температуре 37 °С – 0,66–2,66 мккат/л;

2) доля фермента, устойчивая к действию мочевины (%), – 60–80.

Необходимые реактивы

1. Молочная кислота 80%-ная.

2. Натрия гидроокись, растворы 2 моль/л; 0,4 моль/л.

3. 0,45 моль/л раствор лактата натрия. В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 5 мл 80%-ной молочной кислоты, добавляют 2 моль/л раствора едкого натра до получения рН 7,5 и доводят объем водой до метки. Хранят в посуде из темного стекла в холодильнике.

4. Натрия пирофосфат (Na₄P₂O₇ × 10 Н₂О).

5. НСl 1 моль/л.

6. Натрия пирофосфат 0,03 моль/л, рН 8,8: 6,69 г натрия пирофосфата растворяют в небольшом количестве воды, добавляют 1 моль/л раствор НСl до получения рН 8,8 и доводят объем водой до 500 мл. Стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике.

7. НАД-окисленная форма. Готовят из Расчета 3 мг НАД на 1 мл воды. Раствор стабилен в течение 4 недель при хранении в холодильнике.

8. Раствор 2,4-динитрофенилгидразина: 19,8 мг 2,4-динитрофенилгидразина растворяют в небольшом количестве 1 моль/л раствора НСl при нагревании на водяной бане. После охлаждения доводят объем 1 моль/л раствором НСl до 100 мл. На следующий день реактив фильтруют. Раствор хранят в посуде из темного стекла. Стабилен в течение 1 года.

9. Пируват натрия (для построения калибровочной кривой): 11 мг кристаллического пирувата натрия растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой объем раствора до метки; 1 мл раствора содержит 88 мкг пировиноградной кислоты. Рабочий раствор готовят разведением основного раствора в 10 раз бидистиллированной водой; 1 мл рабочего раствора содержит 8,8 мкг пировиноградной кислоты.

Ход определения

Опытная проба: 0,1 мл сыворотки, разведенной 1 : 2, смешивают с 0,3 мл раствора НАД, прогревают 5 мин при температуре 37 °С. Затем добавляют 0,8 мл 0,03 моль/л раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл 0,45 моль/л раствора лактата натрия, предварительно прогретых при температуре 37 °С, и инкубируют смесь при температуре 37 °С в течение 15 мин. Тотчас после инкубации добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина, выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл 0,4 моль/л раствора едкого натра, перемешивают и через 10 мин измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.

Расчет активности производят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика: из рабочего калибровочного раствора пирувата натрия готовят ряд разведений, как указано в таблице 19.

Таблица 19

Исследование активности лактатдегидрогеназы

Затем в пробирки приливают по 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Далее калибровочные пробы обрабатывают и измеряют так же, как опытные. Холостую пробу ставят так же, как калибровочную, но вместо калибровочного раствора добавляют воду. Линейная зависимость между концентрацией пировиноградной кислоты и оптической плотностью сохраняется от 0 до 3000 нмоль/(с × л).

Клинико-диагностическое значение

Активность лактатдегидрогеназы в сыворотке крови возрастает при повреждении миокарда, лейкозах, почечных заболеваниях, гемолитической, серповидно-клеточной анемиях, тромбоцитопениях, инфекционных мононуклеозах, а также прогрессивной мышечной дистрофии. Все заболевания, протекающие с некрозом тканей (инфаркт миокарда, некротические поражения почек, гепатиты, панкреатиты, опухоли), как правило, сопровождаются резким повышением активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови. При остром гепатите активность лактатдегидрогеназы в сыворотке крови повышена в первые недели желтушного периода, при легкой и среднетяжелой формах заболевания активность фермента возвращается к нормальному уровню довольно быстро. При заболеваниях печени процент мочевиностабильной фракции ЛДГ падает (< 20).

У больных инфарктом миокарда повышение активности фермента в сыворотке крови отмечается через 8–10 ч после начала приступа, достигая максимума через 24–28 ч. Активность остается повышенной на протяжении первой недели заболевания. К 8–9-му дню активность ЛДГ нормализуется. Активность сывороточной лактатдегидрогеназы при инфаркте миокарда дольше сохраняется повышенной, чем активность других ферментов. Ценность определения данного фермента особенно велика в неясных случаях заболевания, при нетипичной клинической и электрокардиографической картине. При стенокардии активность лактатдегидрогеназы в сыворотке крови не увеличивается. Инфаркт миокарда сопровождается возрастанием (> 40%) мочевиностабильной фракции ЛДГ.

ЩФ – фосфогидролаза моноэфиров ортофосфорной кислоты, присутствует в каждом органе, больше всего вырабатывается в печени, костях, кишечнике, эндометрии (плаценте), легких. Активность фермента возрастает у детей в периоде быстрого роста, у женщин – в последнем триместре беременности, после менопаузы.

Располагается ЩФ на поверхности цитоплазматических мембран; наличие изоформ ЩФ в сыворотке крови связано с тем, что в организме человека биосинтез фермента кодируют 3 гена: печеночный, костный и почечный.

Принцип метода

Щелочная фосфатаза (щелочная фосфогидролипаза моноэстеров ортофосфорной кислоты) расщепляет в N-метил-D-глюкаминовом буфере 4-нитрофенилфосфат с образованием 4-нитрофенола и фосфата. Щелочная фосфатаза (ЩФ) активирована хлоридом натрия. Мерой каталитической концентрации фермента является количество освобожденного 4-нитрофенола, который определяют фотометрически, либо кинетическим методом, либо методом постоянного времени после остановки ферментативной реакции ингибитором ЩФ, который блокирует активный центр фермента.

Кинетическим методом можно без разведения анализировать сыворотки до каталитической концентрации ЩФ 30 мккат/л. Методом константного времени можно без разведения анализировать пробы до 7 мккат/л. При каталитической концентрации ЩФ, превышающей эти величины, пробы следует развести физиологическим раствором и анализ произвести повторно (результат умножить на разведение). Объемы отдельных растворов и пробы можно модифицировать при условии соблюдения взаимных соотношений объемов, указанных в описании хода инкубационной смеси.

Пределы активности ЩФ при температуре 37 °С (мккат/л):

1) мужчины – 0,90–2,29;

2) женщины – 0,74–2,10;

3) дети до 12 лет – 1,20–6,30.

Необходимые реактивы

1. п-нитрофениловый эфир фосфорной кислоты, динатриевая соль.

2. Соляная кислота, 0,001 моль/л.

3. п-нитрофенилфосфат натрия, 4 г/л раствор в 0,001 моль/л раствора НСl: 0,4 г п-нитрофенилфосфата помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают до метки 0,001 моль/ л раствором НСl. В связи с тем, что в продаже чаще имеется бариевая соль п-нитрофенилфосфата, то перевод ее в натриевую соль осуществляется следующим способом: к навеске п-нитрофенилфосфата бария, соответствующей получению 9 г/л раствора и помещенной в фарфоровую ступку, добавляют небольшими количествами 0,001 моль/л раствор НСl в процессе растирания соли в ступке в течение 10 мин. Добавлением насыщенного раствора сульфата натрия (1 мл на 100 мл раствора) бариевую соль переводят в натриевую.

Через 5 мин полученный раствор п-нитрофенилфосфата натрия фильтруют в делительную воронку, где затем взбалтывают с равным объемом водонасыщенного бутилового спирта. После разделения слоев жидкости в делительной воронке (вверху – бутанол, внизу – постепенно обесцвечивающийся субстратный раствор) бутанол выливают, а субстратный раствор подвергают описанной выше процедуре очистки еще 2–3 раза, пока он не станет совершенно бесцветным. После бутанола производят экстракцию водонасыщенным эфиром 1–2 раза. Реактив не должен содержать свободного п-нитрофенола, отсутствие которого в субстратном растворе проверяется следующей пробой: к 1 мл субстратного раствора прибавляют 10 мл 0,02 моль/л раствора едкого натра и измеряют на ФЭКе при длине волны 400–420 нм (фиолетовый светофильтр). Экстинкция должна быть меньше 0,08; если экстинкция больше 0,08, необходимо удалить свободный п-нитрофенол. Для этого реактив экстрагируют 2 или 3 раза равными объемами бутилового спирта и один раз – эфиром. Затем удаляют следы эфира выдерживанием на воздухе. Бутиловый спирт и эфир должны иметь нейтральную реакцию. Если реактив не выдерживает указанный выше тест, то экстрагирование повторяют. Хранят раствор в холодильнике в замороженном состоянии в течение 2–3 недель.

4. Аминоуксусная кислота (гликокол, глицин).

5. Магния хлорид 6-водный.

6. Натр едкий; растворы 0,1 моль/л, 0,02 моль/л, не содержащие углекислого газа.

7. Буферный раствор – 0,05 моль/л глициновый буфер с добавлением катализатора хлорида магния – 95 мг/л: 375 мг глицина и 10 мг MgCl₂ × 6Н₂О растворяют в 42 мл 0,1 моль/л раствора едкого натра и доводят объем водой до 100 мл.

8. Субстратно-буферный раствор готовят смешиванием равных частей растворов 3 и 7, рН раствора 10,5. При смешивании 2 мл раствора с 10 мл 0,02 моль/л раствора едкого натра реактив не должен давать экстинкцию на ФЭКе более 0,1 (толщина слоя – 1 см, длина волны – 400–420 нм). В противном случае раствор не годится или подлежит реэкстрагированию бутанолом или эфиром. После экстракции необходимо снова установить рН. Хранят в холодильнике в течение 2–3 дней.

9. п-нитрофенол – калибровочный раствор 5 × 10–5 моль/ л: 696 мг п-нитрофенола растворяют в 0,02 моль/л растворе едкого натра и доводят этим же раствором объем до 1 л; 1 мл раствора содержит 5 мкмолей п-нитрофенола.

Ход определения

Опытная проба: в пробирки вносят по 1 мл субстратно-буферного раствора, прогревают при температуре 37 °С в течение 5 мин, затем добавляют по 0,1 мл сыворотки. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют в течение 30 мин при температуре 37 °С. После инкубации пробирки переносят в водяную баню со льдом, а затем добавляют по 10 мл 0,02 моль/л раствора едкого натра и тщательно перемешивают. Через 5 мин пробы измеряют на ФЭК при длине волны 400–420 нм (фиолетовый светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 1 см против холостой пробы. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.

Расчет производят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика

Из рабочего калибровочного раствора готовят ряд разведений, как указано в таблице 20, и измеряют оптическую плотность растворов при условиях, аналогичных опытным, против 0,02 моль/л раствора едкого натра.

Таблица 20

Исследование активности щелочной фосфатазы

Клинико-диагностическое значение

Увеличение активности встречается при повышенном метаболизме в костной ткани: при заживлении переломов, при первичном и вторичном гиперпаратиреодизме (с явным вовлечением скелета), остеомаляции, недостатке витамина D в пище, заболеваниях костей.

Основные показатели биохимических исследований в состоянии нормы

В настоящее время действует форма справки на биохимический анализ крови № 228/у, утвержденная Минздравом СССР 04.10.1980 года. В нее включено 40 показателей крови. В большинстве случаев ограничиваются меньшим количеством показателей. Наиболее часто используемые на практике показатели приведены в таблице. Следует иметь в виду, что показатель нормы может варьироваться в зависимости от применяемого лабораторного метода.

Таблица 21

Основные показатели биохимического анализа