Текст книги "Возможно ли преодолеть старение? Сегодня и завтра клеточной терапии"

Процедура клеточной терапии

Процедуру введения клеток пациенту проводят методом туннельных инъекций для крупных морщин или обкалыванием мелких морщин. Количество клеток в препаратах варьирует в зависимости от процедуры, объем введенного препарата составляет в среднем 1—3 мл на процедуру. Количество вводимых клеток составляет в среднем от 1 до 10 млн.

Метод введения клеток показан на рис. 9а и 9б. Клетки вводятся с помощью инсулинового шприца в дермальный (средний) слой кожи (Згурский, 2004). Игла инсулинового шприца очень тонкая, поэтому процедура вызывает минимально неприятные ощущения.

Поверхность кожи, в которую вводятся клетки, обрабатывается стерилизующими растворами перед выполнением процедур, а все манипуляции исполнитель делает строго в стерильных резиновых перчатках и в марлевой повязке, закрывающей дыхательные органы.

Результаты применения аутогенных
фибробластов

По мнению одного из ведущих специалистов в области применения аутогенных фибробластов кандидата биологических наук А. А. Згурского (Згурский, 2004) процедура имеет несколько привлекательных моментов для косметолога и, соответственно, для пациента:

— используются собственные клетки пациента;

— обычно проводится однократное взятие биопсии;

— имеется небольшой дискомфорт в процессе применения процедур для пациента;

— эффект сохраняется длительное время;

— простота применения;

— проводится небольшое число процедур, необходимое для получения эффекта;

— отсутствуют осложнения и побочные эффекты.

Аутогенные фибробласты применяют для коррекции морщин, атрофических рубцов, атрофических участков кожи, нарушений структуры кожи (Boss et. al., 2000).

В результате применения:

– замедляется старение кожи;

– улучшается цвет кожного покрова;

– разглаживаются глубокие и исчезают мелкие морщины;

– повышается упругость и эластичность соединительной ткани кожи;

– имеется значительный эффект при коррекции рубцов и носогубных складок через 7 и 12 мес.

В первые часы после введения клеток наблюдаются местные эффекты в виде гиперемии (местное увеличение притока крови) и небольшого отека, которые исчезают через 2—3 ч. после процедуры. Положительный эффект начинает проявляться через 6—8 ч. после процедуры, что выражается в увеличении тургора (упругости) и эластичности кожи, ее кровоснабжения. Отмечен положительный эффект, заключающийся в исчезновении мелких и уменьшении крупных морщин (Крихели и др., 2004). Улучшение кожи происходит в течение нескольких месяцев. Сохранение положительного эффекта прослеживается на протяжении 12 мес. Пример применения аутогенных фибробластов для лечения носогубных складок показан на рис. 10а и 10б. На рис. 11а и 11б приведен пример улучшения поверхности кожи около глаз: рис. 11а – область глаза до процедур, рис 11б – через несколько месяцев после применения терапии. Видно, что количество и глубина морщин после процедур заметно уменьшилось. На рис. 12а и 12б показан результат лечения лобных морщин.

Некоторые специалисты пришли к заключению, что лечение морщин с помощью аутологичных фибробластов является наименее трудоемким и наиболее эффективным методом коррекции морщин в клинической практике. Этот метод представляется единственным, эффективно убирающим рубцовые изменения после угревой сыпи (Рис. 13а и 13б). По данным доктора Арнольда Клейна (США) эффективность метода достигает 95%.

Основные свойства фибробластов сохраняются при культивировании их вне организма. Эти клетки:

– сохраняют диплоидный кариотип в течение жизни;

– имеют ограниченную продолжительность жизни;

– обладают свойством контактного торможения делений и требуют прикрепления к субстрату (дну культурального флакона) для пролиферации;

– у клеток отсутствует онкогенная потенция, т.е. имеется безопасность применения аутологичных фибробластов (Келлер и др., 2000),

– отсутствуют опухоли у бестимусных мышей через 2 мес. после введения 40 млн. клеток;

– имеют нормальную сократительную способность в отношении коллагена;

– сохраняют активный синтез коллагена I типа после культивирования in vitro в течение 6 пассажей.

В одной из фирм США утверждается, что ими выполнены уже тысячи подобных процедур, пролечены тысячи пациентов. С помощью подобных методик в косметологии исправляют возрастные изменения кожи лица, морщины, рубцы кожи. Применение собственных клеток оправдано тем, что отсутствует реакция отторжения, часто возникающая при использовании клеток других людей, как эмбриональных, так и тем более полученных от взрослых доноров. Кроме того, нет этических проблем, возникающих при использовании эмбриональных клеток.

Примеры применения методик показаны также на других рисунках. Так, на рис. 14а, 14б и 14в показан вид лица пациентки с носогубной складкой (морщина) до процедуры применения аутогенных фибробластов (Рис. 14а), во время клеточной терапии (Рис. 14б) и спустя 6 месяцев после (Рис. 14в). Хорошо видно, что морщина значительно уменьшилась (разгладилась) и практически исчезла. Это произошло за счет того, что введенные аутогенные фибробласты прижились и начали вырабатывать новый, молодой коллаген и эластин.

На других рисунках (Рис. 15а и 15б) можно видеть часть участка лица пациентки до процедуры введения аутогенных фибробластов (Рис. 15а) и спустя 4—6 месяцев после выполнения терапии (Рис. 15б). Стрелкой показан дефект кожи до терапии и после. Дефект – рубцовая поверхность на щеке после удаления бородавки (Watson et al., 1999).

Возможны исправления иных подобных старческих изменений кожи (Weiss et al., 2007).

КРИОХРАНИЛИЩЕ

После применения клеточной терапии часть клеток может оказаться неиспользованной. Эти клетки следует сохранить для того, чтобы повторять процедуры в отдаленном будущем.

Для сохранения собственных клеток необходимо поместить их в специальное криохранилище. Оно представляет собой дюралюминиевую или стальную емкость, выполненную по типу термоса, с двойными стенками, между которыми создается вакуум. В неё заливается жидкий азот, имеющий температуру минус 196⁰С (Рис. 16а и 16б).

Перед замораживанием клетки отмывают от ростовой среды и выдерживают в защитном растворе, который предотвращает их от повреждения при низкой температуре. Затем суспензию клеток заливают в специальные стерильные пластмассовые ампулы, закрывающиеся герметично. Эти ампулы с клетками внутри вначале подвергаются постепенному плавному охлаждению до минус 70—80⁰С, после чего погружаются в жидкий азот в криохранилище, где они сохраняются долгие годы и десятилетия. Каждой криопробирке присваивается свой индивидуальный идентификационный номер, который заносится в компьютерную базу. Этот номер строго соответствует тому человеку, у которого взяли клетки. В базе содержатся следующие данные: имя, отчество и фамилия человека, дата рождения, характеристика крови, сведения о наследственных заболеваниях, дата взятия биопсии, некоторые другие сведения.

Компьютерная база существует не только в самом компьютере, но информация также дублируется на компакт диски или на USB-флэш-накопители (флэшки), которые хранятся в специально выделенном месте. Это исключает потерю информации. Само криохранилище постоянно находится под присмотром дежурного персонала, к нему исключен доступ посторонних лиц, а все манипуляции с контейнерами производит только тщательно обученный персонал, несущий личную ответственность за сохранность клеточного материала.

В таком криохранилище фибробласты или другие клетки могут храниться неограниченное время, а при необходимости часть их можно извлечь, разморозить, размножить и применить для клеточной терапии кожи, органов или других целей в будущем.

ДАЛЬНЕЙШИЕ ПЕРСПЕКТИВЫ

Кожа – это очень важная ткань человека, которая несёт значительные функции организма: защищает от проникновения микроорганизмов, предотвращает высыхание мышечной ткани, регулирует температурный баланс путем потоотделения. Однако, у человека имеются другие не менее важные ткани и органы. Все они также подвергаются старению.

Мы уверены, что метод клеточной терапии сможет в ближайшем будущем применяться и для восстановления других состарившихся или больных тканей или органов, например, таких как мышцы, печень, почки, сердце и др. (Прохоров, 2004).

Следует заметить, что практически весь более чем 2-кратный прирост средней продолжительности жизни (СПЖ) за последнее столетие, начиная с конца 19-го – начала 20-го века и до наших дней произошел благодаря успехам медицины. Весь прирост СПЖ произошел из-за улучшения лечения инфекционных болезней, болезней сердечно-сосудистой системы, онкологических заболеваний. Это дало возможность увеличить СПЖ человека в развитых странах с 30—40 лет в конце 19 века до 70—80 лет (мужчины и женщины) в конце 20 века в развитых странах. О том, как увеличилась максимальная продолжительность жизни (МПЖ) говорить трудно, т.к. зачастую нет уверенности в дате рождения того или иного долгожителя, родившегося ранее 20 века. Все-таки, с некоторой долей осторожности, можно сказать, что МПЖ, в отличие от СПЖ, за последнее столетие увеличилась несущественно и сейчас составляет 116 лет для мужчин и 122 года для женщин. Эти значения считаются достоверными и зарегистрированы в книге рекордов Гиннеса (The Guinnes Book …, 2020). Считается, что в верхнем палеолите (30 000—12 000 лет тому назад) МПЖ человека уже была 95 лет (Дильман, 1986).

Однако, сейчас прирост СПЖ в развитых странах замедлился, т.к. успехи медицины привели к тому, что СПЖ человека постепенно приближается (сегодня СПЖ более 80 лет у женщин) к своему естественному видовому пределу, близкому к МПЖ, и для существенного, радикального ее увеличения необходимы прорывные идеи и решения. Развитие науки подошло к рубежу, когда возможен существенный прорыв в увеличении СПЖ и МПЖ в 1,5; 2; 3 и более раз. Необходимо также иметь в виду, что важны не только СПЖ или МПЖ, но и так называемая предстоящая продолжительность жизни (ППЖ). ППЖ характеризует теоретическую или предсказываемую продолжительность жизни с некоторого возраста организма. Это может быть, к примеру, возраст с которого применяется то или иное воздействие на организм. Такой параметр нужен еще и потому, что много предполагаемых геропротекторных (направленных против старения) воздействий в экспериментах на животных применяется в зрелом возрасте или в конце жизни, а по отношению к человеку это, практически, является правилом. Однако надо иметь ввиду возможность переоценки действенности того или иного средства, исследуемого по влиянию на этот параметр. Если, например, после воздействия в конце жизни у людей ППЖ увеличилась на 100% (в 2 раза) по сравнению с контролем, скажем, с 70 до 80 лет – при воздействии и с 70 до 75 лет – без него ((80—70) / (75—70) =2 раза или 100%), то СПЖ увеличилась под воздействием препарата в этом случае всего на 6,7% (100% х (80—75 лет) /75).

Рассмотрим наиболее реальные, выполнимые и достоверно действующие способы увеличения СПЖ и МПЖ, а также наиболее перспективные по перечисленным признакам.

Все методы по характеру воздействия можно разделить на две группы.

К одной группе относятся методы, которые могут только замедлить старение и увеличить СПЖ и МПЖ в 1,5—2 раза).

К другой группе относятся методы радикального решения проблемы старения (увеличение СПЖ и МПЖ более чем в 1,5—2 раза).

Замедление старения (потенциальное увеличение средней и максимальной продолжительности жизни в 1,5 —2 раза)

Если проанализировать все имеющиеся данные о способах увеличения продолжительности жизни (ПЖ), то можно прийти к выводу, что многие из них совершенно разнородные и действуют на различные системы организма.

Как следует из анализа литературных данных, есть много различных факторов, увеличивающих ПЖ животных. Это, например, голодание, понижение температуры тела, увеличение двигательной активности, антиоксиданты, ингибиторы биосинтеза белка, биологически активные вещества, энтеросорбенты, ионизирующая радиация, витамины, этанол, ЭДТА, геровитал и т. д. (Никитин, 1984; Обухова, Эмануэль, 1984; Равин, 1984; Фролькис, Мурадян, 1988; Parsons, Spence, 1981). Поскольку природа этих воздействий чрезвычайно различна, а результат один – увеличение ПЖ, то логично предположить, что все они оказывают влияние на какой-то один механизм. После углубленного анализа всех имеющихся в нашем распоряжении данных, своих и взятых из литературы, мы пришли к заключению, что все перечисленные факторы, увеличивающие ПЖ организмов, влияют на уровень обмена веществ в этих организмах, иначе говоря, на уровень или на скорость метаболизма (могут уменьшать). Причем, одним из следствий уменьшения уровня метаболизма является уменьшение средней скорости пролиферации (деления клеток).

Проведенное изучение действия факторов, увеличивающих ПЖ организмов, показало, что у тех экспериментальных объектов, в которых оценивали уровень метаболизма при их применении, уменьшается скорость протекания биологических процессов, т.е. метаболизм, а также скорость деления клеток.

В результате теоретических и экспериментальных исследований мы сформулировали следующую гипотезу. Предполагается, что увеличение ПЖ организма, имеющего в своем жизненном цикле старение, может происходить в результате уменьшения средней скорости пролиферации (деления) составляющих организм клеток и замедления общего метаболизма в период его роста, а также из-за уменьшения общего метаболизма в период после окончания роста (Прохоров, 2000).

В пользу этой гипотезы может говорить, например, наличие корреляционной связи скорости метаболизма и ПЖ животных разных видов. Было установлено, что ПЖ млекопитающих разных видов обратно пропорциональна энергетическому обмену, выраженному как число потребляемых калорий в сутки на грамм веса тела животного (Cutler, 1984), или скорости метаболизма, оцененному по скорости потребления кислорода, выраженной в миллилитрах на грамм веса тела в час (Biology Data Book, 1973). Т.е. чем меньше скорость (уровень) метаболизма, тем больше ПЖ.

W.A. Calder (Calder, 1985) также пришел к выводу, что МПЖ млекопитающих отрицательно коррелирует с интенсивностью метаболизма. Некоторые исследователи отводят ведущую роль в старении накоплению повреждений, зависимых от скорости метаболизма (Segal, 1988).

Уровень метаболизма определяет скорость деления клеток в организме. Соответственно скорость деления клеток отражает скорость обмена веществ. Поэтому, зная скорость деления (пролиферации) клеток в организме, можно оценивать и уровень общего метаболизма.

Эта логика прослеживается в наших работах, которые также свидетельствуют в пользу выдвинутой гипотезы. Нами показано, что МПЖ рыб, земноводных, пресмыкающихся, птиц и млекопитающих прямо пропорциональна числу удвоений (среднему числу делений) составляющих организм клеток и обратно пропорциональна скорости удвоения (средней скорости деления) этих клеток в эмбриональный период и за все время роста от зиготы до завершения формирования организма (Прохоров, 1999а,б; Прохоров, 2002б). Иначе говоря, чем меньше скорость деления клеток в период роста организма в эмбриональный период и от рождения до окончания роста, значит меньше скорость обмена веществ – общего метаболизма, и тем больше его ПЖ.

Таким образом, проведенные эксперименты на животных (Фролькис, 1988) и на культурах клеток (Прохоров, 1999б,в; 2002а) позволяют предполагать, что снижение метаболизма и скорости пролиферации может увеличить СПЖ и МПЖ животных. Как видно из полученных результатов экспериментов, в которых выявляли увеличение ПЖ животных, связанное с уменьшением уровня общего метаболизма и скорости деления клеток, увеличение СПЖ составляет не более 1,5—2 раз.

Это ограничение связано с тем, что при повышении степени воздействия на организм или культуру клеток выше некоторого оптимального значения (большое увеличение концентрации препарата, значительное уменьшение температуры и др.) начинают проявляться отрицательные характеристики факторов, например, они начинают уменьшать размеры животного при голодании (Никитин, 1984) или насыщающую плотность в культурах клеток животных (Прохоров, 2000). На культурах это хорошо видно на примере воздействия антиоксиданта дибунола. На рис. 17а хорошо видно, что при концентрации 30 мкг/мл в ростовой среде ПЖ культуры трансформированных клеток китайского хомячка примерно в 2 раза больше, чем в контроле (30 и 14 д., соответственно), а насыщающая плотность почти не отличается от насыщающей плотности контрольной культуры (за ПЖ культуры принимали время от посева до ее гибели, а за гибель – момент, когда число живых клеток в культуре станет меньше 10% от их числа при насыщающей плотности). При больших концентрациях дибунола насыщающая плотность значительно уменьшена. На рис. 17а и 17б видно, что при концентрации дибунола 50 мкг/мл ПЖ культур больше примерно в 3.1 и 4.2 раза (в разных экспериментах), чем в контроле, но насыщающие плотности культур с препаратом ниже примерно в 2,5 раза, по сравнению с контрольными культурами. Это значит, что клетки делятся меньшее число раз и не достигают плотности контрольных культур. При концентрации 100 мкг/мл ПЖ экспериментальной культуры по сравнению с контрольной может быть еще больше – более чем в 5 раз (Рис. 17б), но культура растет гораздо хуже и насыщающая плотность почти в 8 раз ниже плотности контрольной культуры.

Такая ситуация in vivo (уменьшение числа делений клеток в организме от появления зиготы до окончания роста) приведет к замедлению развития, и главное к тому, что организм не достигнет нормального роста, а это недопустимо, особенно для человека.

Радикальное решение проблемы старения (потенциальное увеличение средней и максимальной продолжительности жизни более чем в 1,5 —2 раза)

Вероятнее всего, у сложных многоклеточных организмов полностью устранить старение невозможно, но вот периодически омолаживать организм, видимо, реально. Что необходимо сделать для реализации этой идеи?

Любой организм состоит в основном из клеток. Старение почти одновременно захватывает все органы и системы организма. Если рассмотреть отдельно каждый стареющий орган (печень, почку, сердце и т.д.) или систему организма (нервная, лимфатическая, иммунная, кровообращения), то все они, как правило, состоят из тех или иных клеток, которые образуют соответствующие структуры. Хорошо известно, что при старении в органах уменьшается число здоровых, жизнедеятельных клеток, увеличивается число мертвых клеток, часть из которых замещается соединительной тканью (Стрелер, 1964). Как показали исследования, это происходит практически во всех органах.

Из этого следует вывод: для решения проблемы старения необходимо, чтобы клетки любого органа всегда состояли из живых молодых клеток, способных «вечно» выполнять «возложенные» на них функции.

Однако ясно, что на самом деле не существует негибнущих, «вечных» клеток, независимо от того, делятся они или нет. Даже в культурах трансформированных или раковых клеток, в которых клетки могут делиться неограниченное число раз, последние постоянно гибнут. Место погибших клеток занимают молодые дочерние клетки и поэтому такая популяция живет неограниченное время при условии постоянства среды обитания и достаточности питания. Поэтому нужно говорить не о «вечных» отдельных клетках, а о «вечных» популяциях клеток.

Такие «вечные» популяции клеток существуют и они хорошо известны – это культуры трансформированных клеток разного происхождения, разных животных, например, трансформированные клетки китайского хомячка, а также культуры раковых клеток животных и человека, например, раковые клетки человека линии HeLa.

Правда, даже такие «вечные» популяции могут погибнуть, если у них не будет места для размножения и, соответственно, возможности делиться. Это очень важное замечание, как будет показано ниже, и без решения этой проблемы нельзя будет достичь цели – неограниченно увеличить ПЖ животных и человека.

Возвращаясь к вопросу: «Можно ли остановить старение?» следует признать очевидным, что для этого нужно сделать «вечно» жизнеспособной популяцию клеток, составляющую тот или иной орган.

Еще в 1984 г. автором книги был сделан доклад в Московском обществе испытателей природы (МОИП, секция геронтологии) при Московском государственном университете им. М.В Ломоносова, который (доклад) в то время некоторыми специалистами был воспринят как научно-фантастический (Прохоров, 1984). Сейчас то, о чем говорилось в докладе приближается к реальности и многие исследователи этим практически начинают заниматься. Что же вызвало такую недоверчивую реакцию у слушателей?

Суть доклада состояла в том, что для решения проблемы старения необходимо сделать клетки в органах «вечно» молодыми и способными к неограниченному числу делений. То есть, необходимо сделать нормальные клетки, например, фибробласты кожи, похожими на раковые (трансформированные) по их свойству неограниченно делиться, но так, чтобы их деление было всегда подконтрольным, в отличие от поведения обычных раковых клеток. Именно это вызвало недоверие слушателей и послужило основанием для того, чтобы признать идеи автора невыполнимыми.

Действительно, в то время так это и обстояло на самом деле, т.е. реализовать предложенные автором идеи в тот период времени не было технической возможности. Но, как оказалось позже, со временем, развитие науки и технологий привело к тому, что часть идей, которые были высказаны ранее автором, стали возможными для реализации уже в настоящее время. Другие идеи реализовать пока не удалось, но думаю, что научный прогресс обеспечит воплощение их в реальность уже в обозримом будущем.

Возвращаясь к описанию высказанных автором идей в докладе, следует задуматься о том, как можно получить такие неограниченно делящиеся клетки и каким образом их контролировать, а точнее, как контролировать деление этих клеток? Было предположено, что в клетках организма существуют определенные вещества (факторы активаторы и факторы репрессоры – ФАР, такое название предложил автор – Л. Ю. Прохоров в 1984 г.), ответственные за активацию и подавление генетического аппарата, который в свою очередь, регулирует пролиферативную способность клеток и может обеспечить им неограниченное деление.

Если сделать все клетки организма «вечными», т.е. с бесконечным потенциалом деления, то органы из таких клеток будут «молодыми» и организм из таких «молодых» (омоложенных) органов будет также «молодым». Необходимым условием является управляемость деления этих клеток, при этом они должны оставаться нормальными. Предполагалось на роль регуляторов деления клеток отвести выше названные факторы активаторы и репрессоры генетического аппарата.

В то время такие факторы-активаторы и репрессоры не были известны, что и породило у слушателей доклада скептицизм по поводу предложенной идеи.

Но, как оказалось позже, подобное вещество, которое способно расширить пролиферативный потенциал нормальных клеток все-таки существует и этим веществом оказался фермент теломераза.

Открытие этого фермента было предворено теоретическими исследованиями нашего соотечественника Алексея Матвеевича Оловникова в начале 70-х годов 20 века (Оловников, 1983, 1988; Olovnikov, 1973). Он предсказал причину того, почему диплоидные фибробласты делятся в культуре только ограниченное число раз. При каждом делении концевая часть ДНК сокращается и после нескольких десятков делений ДНК укорачивается настолько, что это вызывает остановку деления клеток. Напрашивался вывод, что для устранения блока деления клеток необходимо предотвратить укорочение ДНК. Как оказалось, эту роль в клетке выполняет фермент теломераза. Выяснилось, что в раковых клетках теломераза присутствует, а в нормальных клетках ее нет. В конце 90-х годов прошлого столетия американские исследователи (Bodnar et al., 1998), а несколько лет позже в начале 2000-х годов и российские ученые (Егоров и др., 2003) показали, что если в нормальные клетки человека (фибробласты), которые в норме совершают в культуре только примерно 50 удвоений после чего перестают делиться, ввести ген, постоянно продуцирующий фермент теломеразу, то такие клетки приобретают способность делиться неограниченное число раз. Эти клетки в эксперименте совершили больше двухсот удвоений (Егоров и др., 2003), а контрольные (без гена теломеразы) – смогли сделать только максимум 60 делений.

Таким образом, идея, высказанная автором в 1984 г., может обрести реальные очертания. Поэтому следующим перспективным шагом является применение методов, увеличивающих, так называемый, пролиферативный потенциал клеток, применяемых для клеточной терапии.

Основываясь на вышеописанном открытии, можно повторить высказанное ранее предположение на другом уровне оптимизма. Органы, состоящие из «вечно» молодых клеток (с геном теломеразы), будут всегда «молодыми» и организм из таких омоложенных органов станет «вечно» молодым. Как будет описано ниже для реализации такого проекта необходимо выполнить еще одно открытие автора, которое заключается в том, чтобы принудительно устранять из органа старые плохо работающие клетки и ткани, мешающие функционированию молодых, полноценных клеток (Прохоров, 1999в, 2002а, 2004, 2015а, 2016а; 2019).