Текст книги "Самая главная молекула. От структуры ДНК к биомедицине XXI века"

Расчлененные гены

Но не будем торопиться. Если окажется верной гипотеза, выдвинутая У. Гилбертом (это тот самый Гилберт, который участвовал в разработке химического метода чтения ДНКовых текстов, за что был удостоен Нобелевской премии по химии вместе с Сэнгером в 1980 году), то далеко отправляться на поиски нам не придется. И нового названия тоже не потребуется. «Геногены» это не что иное, как эукариоты. Если яснее не стало, то, пожалуйста, это мы с вами! К эукариотам принадлежим не только мы с вами. К ним относятся вообще все высшие организмы: и животные, и растения, и даже некоторые простейшие. Так что если предположение Гилберта справедливо, то недостатка в фабриках генов нет и быть не может, пока есть жизнь на Земле.

Следует признать, что упомянутая гипотеза возникла не от хорошей жизни. Она потребовалась для того, чтобы объяснить совершенно неожиданные факты, обнаруженные после того, как были определены первые же последовательности ДНК, выделенные из высших.

Совершенно естественно, что поскольку аминокислотная последовательность в белках непрерывна, то непрерывной считалась и последовательность нуклеотидов в генах. Многочисленные исследования на бактериях и бактериофагах показали, что это действительно так.

Исследовать детальную структуру генов у высших и их вирусов стало возможным лишь с появлением генной инженерии и после разработки методов чтения ДНКовых текстов. Каково же было изумление и замешательство ученых, когда в 1977 году выяснилось, что гены у высших организмов не непрерывны, а состоят из отдельных кусков, разделенных какими-то другими последовательностями нуклеотидов! ДНК вдруг предстала этаким винегретом из генов, порубленных на части. Когда Ричард Робертс (работавший в то время в возглавлявшейся Уотсоном Колд-Спринг-Харборской лаборатории в окрестностях Нью-Йорка, на Лонг-Айленде) и Филип Шарп (Массачусетский технологический институт) независимо пришли к такому выводу, изучая геном одного из вирусов, вызывающих обычную простуду (аденовирус), это было воспринято в качестве курьеза. Однако затем выяснилось, что так же устроены и глобиновый ген у кролика, и овальбуминовый ген у цыпленка, и гены рибосомальной РНК у плодовой мушки дрозофилы. Короче, так оказались устроены почти все гены высших организмов. За открытие расчлененных генов Робертс и Шарп были в 1993 году удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине.

Промежутки между кусками генов бывают разными – от десятков до многих тысяч пар оснований. Как же на таких расчлененных генах синтезируются единые молекулы мРНК, по которым далее идет синтез единых молекул белков? Оказалось, что с участка ДНК, по которому разбросаны куски данного гена, включая и промежутки, снимается копия в виде очень длинной молекулы РНК. Эта молекула-предшественник или, как говорят, про-мРНК. Из про-мРНК сложным путем нарезания и последующего сшивания (этот процесс иногда называют «созреванием») получаются «зрелые» молекулы мРНК, которые уже могут выполнять свои прямые обязанности. Таким образом, сам факт расчлененности генов заставляет высшие организмы заботиться о «созревании» мРНКовых копий. Отметим, что в зачаточном (или, наоборот, в рудиментарном) виде механизм созревания РНК есть и у бактерий, но там дело ограничивается отрезанием «лишних» концов у молекул.

Как в деталях идет процесс созревания? Конечно, существуют специальные ферменты, разрезающие молекулу про-мРНК и сшивающие полученные фрагменты друг с другом. Но что указывает ферменту, как правильно нарезать молекулу и как правильно сшить получившиеся куски мРНК? И как выбрасываются промежуточные участки? Кухня такой рубки-сборки совсем не проста: ведь если фермент просто разрежет мРНК на куски, то эти куски разбегутся в разные стороны из-за броуновского движения – и пойди собери их!

Как удалось установить, в процессе «созревания» или, как его принято называть, сплайсинга мРНК участвуют специальные коротенькие молекулы РНК. Они «склеивают» про-мРНК так, чтобы специальным ферментам было ее удобно нарезать на куски и вновь сшить, выбросив лишнее. С легкой руки Гилберта те участки ДНК, слепок с которых сохраняется в ходе сплайсинга, называют экзонами, а выбрасываемые в ходе сплайсинга участки – интронами.

Какие же преимущества дает высшим организмам такой запутанный механизм производства мРНК? Ведь он не только очень сложен, но и таит в себе возможности очень грубых ошибок?

В самом деле, физико-химические данные свидетельствуют, что пространственная структура РНК не жесткая, она колеблется между различными состояниями, сильно различающимися по тому, какие участки образуют шпильки или другие элементы пространственной структуры. Это значит, что в одном состоянии про-мРНК будет нарезана на куски одним способом, а в другом – иным. Соответственно, разными окажутся выброшенные участки, и «зрелые» молекулы мРНК будут очень сильно отличаться друг от друга. Кроме того, накопление небольшого числа (или даже одной) точечных мутаций в про-мРНК может существенно нарушить соотношение пространственных структур, которые образует эта молекула.

Гилберт первым обратил внимание на то, что эти недостатки в организации генов эукариот, из-за которых они, по всей видимости, должны сильно уступать прокариотам в точности белкового синтеза, могут обернуться огромными преимуществами в эволюции. Судите сами: большая чувствительность к малым изменениям в ДНК и возможность одновременного синтеза зрелых мРНК с совершенно различными последовательностями нуклеотидов – все это может обеспечить искомое. А именно: испытание самых разных новых вариантов без полного отказа от старого. Это значило бы, что высшие организмы обладают тем механизмом изменчивости и отбора, которого так не хватало для примирения генетики и теории эволюции.

Считают, что экзон-интронное устройство генов сохранилось у эукариот от общего с прокариотами предка, гипотетического прародителя всего живого на Земле, «прогенота». У прокариот в ходе эволюции произошло сокращение управленческого аппарата, и они утратили способность к сплайсингу.

В ходе изучения сплайсинга мРНК Томас Чек (Колорадский университет, США) сделал открытие, оказавшее столь же ошеломляющий эффект, как в свое время открытие синтеза ДНК на РНК. Он обнаружил, что сплайсинг может идти и без участия белков! Сама РНК, без всякой посторонней помощи, разрезает себя на куски, выбрасывает интроны и сшивает экзоны. Конечно, такой «самосплайсинг» наблюдается лишь в редких случаях, для некоторых экзотических РНК, но принципиальное значение имеет сама возможность того, что РНК ведет себя подобно ферменту. До открытия Чека все были абсолютно убеждены, что нуклеиновые кислоты сами по себе, без помощи белков, ни на что не способны. Молекулы РНК, работающие как ферменты, назвали рибозимами.

Способность РНК к ферментативной активности неожиданно проливает свет на одну из центральных проблем предбиологической эволюции. Уже на заре молекулярной биологии стало ясно, что биологической, дарвиновской эволюции должна была предшествовать эволюция молекул. Но какому из двух основных классов биополимеров, белкам или нуклеиновым кислотам, отдать предпочтение, кто из них возник раньше в ходе предбиологической эволюции? Это напоминает вопрос о том, что появилось раньше – курица или яйцо, так как сегодня в клетке белки не могут появиться без ДНК и РНК, а ДНК и РНК ничего не могут без белков. Все же те, кто пытался представить себе, как было дело, склонялись к тому, что сначала были белки, которые как-то могли воспроизводить самих себя.

Открытие рибозимов радикально изменило ситуацию. Теперь кажется наиболее вероятным, что прародительницей всего живого на Земле была молекула РНК. То, что РНК может играть роль вещества наследственности, известно давно, со времени открытия РНК-содержащих вирусов. Теперь мы знаем, что РНК может играть роль ферментов и, наверное, она могла катализировать необходимые для воспроизведения самой себя реакции. Лишь впоследствии, в ходе дальнейшей эволюции, на стадии образования прогенота, РНК передала функции хранения генетической информации ДНК, которая больше подходит для этой цели, а каталитические функции передала молекулам белка, которые обладают уникальной способностью катализировать практически любые реакции.

В современной клетке РНК отведена достаточно скромная роль вспомогательной молекулы. Но следы ее былого величия видны повсюду. По существу, ни один важный, глубинный процесс в клетке не идет без участия РНК, даже тогда, когда, казалось бы, без нее вполне можно было бы обойтись. Например, для репликации ДНК нужна «затравка» (праймер). Роль праймера в клетке всегда играет коротенькая РНК (подробнее об этом мы поговорим в главе 7). А сколько молекул РНК участвует в синтезе белка? Ведь, казалось бы, можно обойтись и без мРНК, и без тРНК, и уж подавно без рибосомальных РНК. Но не тут-то было. К всеобщему изумлению выяснилось, что присоединение следующей аминокислоты к растущей белковой цепи на рибосоме происходит без участия белков, а катализируется рибосомной РНК. Таким образом, одна из самых важных реакций в современной клетке все еще катализируется не белковым ферментом, а рибозимом!

Для нашей прародительницы РНК сплайсинг не был чем-то особенным, так как РНК его легко делает сама. Так что, похоже, прав Гилберт – экзон-интронное устройство генов отражает очень древний принцип организации генетического материала. Оно сохранилось с того допотопного времени (его называют РНКовым миром), когда самой главной молекулой жизни была не ДНК, а РНК.

Прыгающие гены

С наступлением новой эры в изучении генов высших организмов, связанной с появлением генной инженерии и методов чтения ДНКовых текстов, рухнуло не только представление о генах как о непрерывных участках ДНК. Не устояло и другое положение генетики, казавшееся столь же незыблемым и утверждавшее, что все клетки организма имеют одинаковый набор генов. Справедливость его, казалось бы, была раз и навсегда доказана опытами Дж. Гёрдона по выращиванию лягушек-двойников и недавними успехами по клонированию разных животных, о которых мы рассказывали в начале главы 3. Но выяснилось, что и для этого правила есть свои, очень существенные исключения.

Правда, надо сразу оговорить, что если «лоскутное» устройство генов – это правило для высших, что изменению в ходе развития организма подвергаются лишь немногие гены в очень специальных клетках, – это исключение из правила. Важно, однако, что это исключение распространяется на гены и клетки, имеющие для организма особое значение. Это гены и клетки, отвечающие за иммунитет.

Способность к иммунному ответу на вторжение извне – важнейшее свойство нашего организма, позволяющее ему сохранить индивидуальность, бороться против инородных клеток и вирусов. Можно утверждать, что, не будь у людей этой способности, они не могли бы жить так скученно, как живут сейчас. Средневековые хроники полны ужасающих рассказов об эпидемиях, опустошавших целые города, а иногда и обширные территории. Почему же этого не происходит теперь? Конечно, многое дало применение санитарно-гигиенических мер. Но все же главное – это вакцины, т. е. прививки.

Прививка – это как бы заблаговременное предупреждение организма о грозящей ему опасности. Она включает иммунную систему, в результате возводится неприступная стена против потенциального агрессора (бактерии или вируса) заранее, еще до того, как он совершит нападение. Массовые прививки привели к тому, что страшные в прошлом враги человеческого рода, возбудители чумы, холеры, оспы и т. д., не могут теперь найти место, где они могли бы размножаться, их численность практически сведена к нулю. Это один из немногих случаев, когда исчезновение с лица Земли некоторых ее обитателей не беспокоит даже наиболее ярых поборников охраны окружающей среды.

Что же позволяет иммунной системе успешно бороться с разнообразными возбудителями болезней? Роль орудия борьбы играют клетки крови, лимфоциты (белые кровяные шарики) и особые белковые молекулы, иммуноглобулины, называемые также антителами. Лимфоциты образуют не одну, а две линии обороны организма от внешнего нашествия. Первыми распознают и встречают врага (это может быть бактерия, вирус, чужеродный белок или еще какое-нибудь химическое соединение, одним словом, какой-то антиген) Т-лимфоциты, а уже потом вступают в бой В-лимфоциты. Т-лимфоциты несут на своей оболочке белки-рецепторы, которые распознают антиген. В-лимфоциты вырабатывают антитела к вторгшимся антигенам. Рецепторы Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и иммуноглобулины – очень похожие белки.

Иммунная система каждого организма способна вырабатывать невероятно большой набор разных рецепторов и иммуноглобулинов. Точнее, молекулы эти почти одинаковы, они построены по одному и тому же общему плану, но в них есть участки, называемые вариабельными частями, которые отличаются друг от друга своей аминокислотной последовательностью. Лимфоциты – строго специализированные клетки. Каждый Т-лимфоцит несет свой рецептор, узнающий строго определенный антиген. Каждый В-лимфоцит несет свой рецептор и способен вырабатывать только строго определенный иммуноглобулин, связывающийся только с данным антигеном.

Итак, в организме заранее имеются лимфоциты, способные узнать практически любой антиген, даже тот, который ни разу до того не попадал в этот организм. Если, скажем, вирус впервые проник в организм, то найдется Т-лимфоцит, рецептор которого узнает белок оболочки вируса. Связывание антигена с рецептором запускает очень длинную цепь событий, в результате чего, во-первых, образуются так называемые Т-киллеры, клетки-убийцы, которые уничтожают зараженные вирусом клетки. Во-вторых, одна из В-клеток, та самая, которая способна производить антитело против узнанного рецептором антигена, начинает размножаться и вырабатывать иммуноглобулины, связывающиеся с вирусными частицами и в конечном счете выводящие их из организма.

Однако, чтобы все это случилось, нужно время. Если нападение происходит внезапно, то, прежде чем сработает иммунная система, вирус успеет наделать много бед, а то и вообще погубить организм. Другое дело, если вирус уже до этого, скажем, в неинфекционной форме, побывал когда-то в этом организме. Будучи однажды включенной, иммунная система многие годы, а иногда и всю жизнь, сохраняет способность в случае повторного появления антигена быстро нарабатывать Т-киллеры и антитела против него. Они не дадут вирусу как следует развернуться.

Основной вопрос, на который очень долго не удавалось получить ответ, состоит в следующем. Что обеспечивает реакцию организма на самые разные антигены? Ведь каждый организм готов к выработке антител в ответ практически на любой чужеродный белок. В то же время иммуноглобулины и рецепторы Т-лимфоцитов очень специфичны – одна молекула, как правило, узнает только вполне определенный антиген и теряет способность узнавать, если в молекулу антигена внести минимальные изменения. Чтобы обеспечить одновременно и огромную специфичность и разнообразие иммунных реакций, организм держит наготове громадный репертуар различных лимфоцитов, способных распознать практически любой антиген. Их в каждом организме многие миллиарды.

Так что же, существует много миллиардов генов, каждый из которых кодирует свой рецептор и свой иммуноглобулин? И откуда они берутся, эти гены? Они есть уже в зиготе, т. е. достались от родителей? Что за дурацкие вопросы! Конечно! Как же может быть иначе, если химическое строение рецепторов и иммуноглобулинов определяется последовательностью ДНК (а чем еще может определяться строение белков?!).

Но постойте, как такое может быть?! Наш геном состоит из 3 млрд нуклеотидов. Так что, если даже весь геном кодирует только аминокислоты и ничего больше, а это точно не так, он может закодировать миллиард аминокислот, но в геноме никак не найдется места закодировать много миллиардов белков-иммуноглобулинов. Тут концы с концами не сходятся на много порядков. Это во-первых. А во-вторых, если гены рецепторов и иммуноглобулинов переходят к нам от наших родителей вместе с генами других белков, то почему внутри нас иммуноглобулины мамы не атакуют белки папы, и наоборот?

Наши родители, как и все люди (за исключением идентичных, или однояйцовых близнецов, получившихся из одной зиготы), иммунологически несовместимы. Иммунная система одного человека атакует белки другого человека. Отсюда столько проблем при пересадке органов (почек, сердца и т. д.). Но факт есть факт. В каждом из нас вырабатываются и белки, унаследованные от папы, и белки, унаследованные от мамы, а вот ничего ужасного не происходит. Страшно подумать, что было бы, если бы у человека вырабатывались антитела к собственным белкам. К счастью, если это и случается, то очень редко. Но парадокс состоит в том, что объяснять надо не то, что такая болезнь бывает, а то, что она не поражает всех нас!

В 1960-х годах те, кто пытался объяснить иммунитет на генетическом уровне, ясно понимали, что само существование иммунной системы явно противоречило молекулярной биологии того времени. Было ясно, что здесь кроется какая-то загадка, разгадка которой может произвести переворот в наших представлениях.

Поэтому, как только появилась возможность выяснить детальное строение генов высших организмов, в первые объекты изучения попали гены иммуноглобулинов. Наибольший вклад в решение проблемы методами генной инженерии внес иммуногенетик японского происхождения Судзуми Тонегава, который был удостоен за эти его работы Нобелевской премии по физиологии и медицине за 1987 год.

Изучая гены иммуноглобулинов в Институте иммунологии в Базеле, Швейцария (с тех пор он уже давно перебрался в Бостон и работает в Массачусетском технологическом институте), Тонегава впервые в 1976 году обнаружил расчлененные гены. Оказалось, что между участками ДНК, на которых записана информация о вариабельной и постоянной частях иммуноглобулинов, есть участок, где не записано никакой белковой последовательности. А в готовой молекуле иммуноглобулина вариабельная и постоянная части образуют единую полиаминокислотную цепь. Эта новость мгновенно облетела весь научный мир, и буквально через несколько месяцев стало ясно, что «лоскутное» устройство – типичная картина для любых генов высших организмов.

Но не успели привыкнуть к этой новости, как Тонегава сообщил уж совсем потрясающую вещь. Он сравнил ДНК, выделенную из лимфоцитов взрослой мыши, с ДНК из мышиного эмбриона. Оказалось, что у эмбриона вариабельная часть гена состоит не из одного, как у лимфоцитов взрослой мыши, а из двух кусков, которые были обозначены J и V. Меньшая часть, J, всегда находится на месте, а более длинная часть, V, отстоит от J так далеко, что Тонегаве даже не удалось определить расстояние до нее вдоль ДНК.

У эмбриона, как и во всех обычных клетках (не лимфоцитах) взрослого организма, гены иммуноглобулинов устроены так, как показано на рис. 21 вверху. Насчитывается около 300 V-генов, четыре J-гена и один С-ген. Скопление V-генов отделено от скопления J-генов большим промежутком. Между J-генами и С-геном также имеется промежуток, но гораздо меньше. Клетки, имеющие устроенную таким образом ДНК, не способны вырабатывать антитела. Поэтому у эмбриона, и даже у новорожденного, собственные антитела отсутствуют – есть только антитела матери, поступившие в его кровь до рождения.

Рис. 21. Перегруппировка генов иммуноглобулинов. Стадия I происходит в процессе созревания лимфоцитов. Стадия II отвечает синтезу иммуноглобулина и рецептора в лимфоцитах

Вскоре после рождения начинает пробуждаться собственная иммунная система – образуются лимфоциты. В каждом лимфоците происходит следующее. Из ДНК вырезается протяженный участок, начинающийся на конце одного из V-генов и оканчивающийся строго в начале одного из J-генов. В результате данный лимфоцит содержит ДНК, имеющую строение, как показано на рис. 21 (средняя строка). Далее со всего получившегося участка, начиная с гена V и кончая геном С, снимается РНКовая копия. Эта РНК подвергается сплайсингу в принципе так же, как это происходит с любыми расчлененными генами у высших. При этом из РНК удаляется всё, кроме реплики с образовавшегося на предыдущей стадии единого гена VJ, а также гена С. Все три реплики образуют единую непрерывную РНКовую цепь (нижняя строка рис. 21), которая считывается рибосомой, давая белковую цепь иммуноглобулина.

Конечно, самое интересное происходит на стадии I, т. е. тогда, когда образуется лимфоцит данного типа. Чем определяется то, какая именно пара генов V и J состыкуется, окажется рядом при вырезании участка ДНК? Это центральный вопрос, так как от этого целиком зависит строение вырабатываемого лимфоцитом иммуноглобулина.

Кардинальный факт состоит в том, что при этом перебираются все (или почти все) комбинации генов V и J. Это – первый шаг к созданию на базе сравнительно скромного набора исходных генов несметного разнообразия иммуноглобулинов. Ведь, если имеется n генов V и m генов J, то различных пар из них может получиться пт. Таким образом, если, как упоминалось выше, п = 300, а т = 4, то число разных антител оказывается около тысячи.

Но этого мало. Молекула иммуноглобулина состоит не из одной, а из четырех полиаминокислотных цепей, двух легких и двух тяжелых (рис. 22). Обе легкие цепи идентичны друг другу, как и обе тяжелые. Но тяжелые и легкие цепи синтезируются совершенно независимо, и для каждой из них происходит вся та перетасовка, о которой говорилось выше. Поэтому цифру тысяча нужно возвести в квадрат. Так получается миллион.

Но и это еще не все. Оказалось, что в какой-то момент включается механизм, природа которого оставалась до недавнего времени загадкой, благодаря которому возникают мутации, причем только в V-генах. Окружающие V-гены участки ДНК не меняются, а в V-генах происходят случайные замены нуклеотидов. Это еще многократно повышает разнообразие иммуноглобулинов.

Мы рассмотрели события, происходящие в В-лимфоцитах. Точно такие же процессы происходят в Т-лимфоцитах, в результате чего образуется множество рецепторов.

Вот какой хитроумный механизм придуман природой, чтобы снабдить нас с вами лимфоцитами и вырабатываемыми ими антителами на любой мыслимый случай. Загадка, мучившая несколько поколений медиков и биологов, была решена быстро и однозначно, как только за нее взялись специалисты, вооруженные умением манипулировать молекулой ДНК.

Рис. 22. Так устроена молекула иммуноглобулина (схема)

И надо сказать, открывшаяся картина просто ошеломила даже привыкших к сенсациям молекулярных биологов. Шутка ли сказать, оказывается, в организме каждого человека, каждого млекопитающего (и еще шире – позвоночного) происходит перетасовка генов, образуются миллионы новых, причем это еще сопровождается интенсивным мутационным процессом.

А мы-то думали, мы были абсолютно убеждены, что весь план строения организма готов раз и навсегда, как только образовалась зигота. Мы думали, что этот план совершенно одинаков во всех клетках, просто одни клетки «читают» одну часть плана, другие – другую. Конечно, возможность мутаций в генах при развитии организма никем никогда не отрицалась, но к этому относились как к случайным помехам, ошибкам в ходе планомерного развития организма. А оказывается, каждый организм в ходе развития вырабатывает свой, совершенно уникальный набор генов рецепторов и иммуноглобулинов и, соответственно, уникальный набор лимфоцитов. Собственно, это и есть один из тех факторов, которые определяют индивидуальность, свое «я» каждого позвоночного.

А как же решается вопрос о том, чтобы иммунная система не набрасывалась на свои белки? Это осуществляется путем отбраковки тех лимфоцитов, которые узнают свои белки. Гигантская проблема – поиск связи между иммунитетом и раком. Ведь эта болезнь так же, как и иммунитет, – удел позвоночных. Несомненно, между этими двумя важнейшими для жизни всех людей явлениями существует очень тесная связь. Эту связь изучают на всех уровнях, включая уровень ДНК. Мы вернемся к этим вопросам в главе 11, чтобы обсудить, как в самое последнее время удалось научиться направлять иммунную систему на борьбу с раком.