Текст книги "Временнáя структура биосистем и биологическое время"

3.2. Циркадианные осцилляторы

Белки, поддерживающие redox-статус цитоплазмы, в настоящее время рассматриваются как циркадианные осцилляторы, не связанные с транскрипционными процессами в ядре, взаимодействующие с метаболическими осцилляторами в цитоплазме и активные у прокариот и в безъядерных клетках крови (O’Neill, Reddy, 2011; Hoyle, O’Neil, 2015; Rey, Reddy, 2015, и др.). Среди них наиболее «действенными» и филогенетически древними оказались недавно открытые белки-антиоксиданты пероксиредоксины (PRX).

Пероксиредоксины. Окислительно-восстановительные 24-часовые циклы белков пероксиредоксинов (PRX) возникли в начале протерозоя при значительном увеличении кислорода в атмосфере Земли как защита от повреждающего воздействия анион радикала кислорода и его активных метаболитов и ко-эволюционировали с ними (O’Neill et al., 2011; Edgar e.a., 2012). Околосуточные ритмы изменения уровня активных кислородных метаболитов, растущего под влиянием ультрафиолетовой части солнечного спектра, считаются одним из факторов циркадианной ритмики PRX-осциллятора (рис. 3). Подчеркивается важность этого обстоятельства, поскольку на Земле лишь гипертермофильные археи Methanopyri, живущие в метановой среде и имеющие метан-зависимый метаболизм, не зависят от кислорода и не имеют циркадианного ритма активности (Edgar e.a., 2012).

Рис. 3. Циркадианные ритмы содержания окисленных форм пероксиредоксинов (PRX-SO2/3 нормированное относительное содержание веществ) у архей через три цикла LD 12:12 (12 час света: 12 темноты) и последующего LL при постоянной температуре (по: Edgar et al., 2012, с изменениями).

Пероксиредоксины являются ферментами, пероксидазами, и имеют в каталитическом центре характерную консервативную последовательность Pxxx(T/S)xxCP, где один или два цистеина окружены остатками аминокислот пролина и треонина (или серина у архей). Образующиеся под влиянием ультрафиолета (максимум утром) активные кислородные метаболиты, гидроперекись или радикал гидроксила, активируют PRX через окисление тиоловой группы цистеина (PRX-SH) до PRX-SO2/3 с последующим образованием гомо– или гетеродимеров. Показано, что в филогенезе роль основных редокс-мишеней в cтруктуре многих ферментов и транскрипционных факторов также принадлежит цистеиновым остаткам (Janssen-Heininger et al., 2008). Переокисление тиоловой группы Сys в пероксиредоксинах подавляет пероксидазную активность PRX. Для поддержания точности подстройки циркадианного ритма в PRX-осцилляторе, как и в других, cуществует обратная связь, направленная на восстановление (рециклирование) PRX, однако ее реализация может различаться для PRX I–V типов и представителей разных групп про– и эукариот (Edgar et al., 2012, и др.). У насекомых и позвоночных в рециклировании PRX участвуют тиоредоксины ((тиолредуктазы, TRX), восстанавливающие окисленный PRX-SO2/3 до PRX-SH (Rey, Reddy, 2013, 2015; Huang et al., 2013), или у дрожжей – сульфиредоксины, аналогично снимающие блок переокисления PRX в присутствии АТФ (Jönsson, Lowther, 2007). У растений и грибов (Granshaw et al., 2003; Dunlap, Loros, 2006, и др.) описаны циркадианные системы, использующие разные белки, но также связанные с регуляцией редокс-статуса (табл.2).

У животных антиоксидантная активность PRX осуществляется в пероксисомах клетки в комплексе с каталазой (PRXI/PRXV/каталаза), что, по-видимому, может усиливать ее обычно низкую чувствительность и эффективность в отношении гидроперекиси. Показано, что эти органеллы участвуют в регуляции окислительно-восстановительного статуса цитоплазмы также благодаря способности накапливать значительные количества ионов кальция, известного буфера ацидоза в клетке (Lasorsa et al., 2008).

Таблица 2. Белки циркадианных осцилляторов, образующие позитивные (ПП) и негативные (НП) петли (по: Eckel-Mahan, Sassone-Corsi, 2013, с изменениями)

Следует подчеркнуть, что PRX-осциллятор сохраняется на протяжении всего филогенеза и действует в цитоплазме одновременно и во взаимодействии с другими осцилляторами, в том числе, метаболическими, обеспечивающими ритмы энергетического потенциала клетки(и рН): NADH/NAD+, ATP/ADP,

КaiA/B/C. Циркадианный осциллятор КaiA/B/C был впервые описан у цианобактерий, а затем у архей и пребактерий (Dvornyk et al., 2003, и др.). Его открытие было связано с наблюдением околосуточного ритма азотфиксирующей активности у пресноводных одноклеточных цианобактерий Synechoccus sp. RF-1 в условиях постоянной температуры, дня и ночи или при постоянном освещении. При этом частота делений составляла 5–6 часов, т. е. два временных процесса, метаболический околосуточный ритм и клеточный цикл, осуществлялись параллельно и относительно независимо (Mori, Johnson, 2001). Циркадианный осциллятор КaiA/B/C существует у цианобактерий наряду с PRX-осциллятором и состоит из трех белков КaiA, КaiB и КaiC, обеспечивая не только стабильность амплитуды и фазы околосуточного ритма, но и возможность учитывать информацию о соотношении АТФ/АДФ и температуре для адаптации ритма к уровню энергетического обмена (Akiyama, 2012). Это связано с особенностями двух доменов центрального белка осциллятора Кai C: протеинкиназный домен С-терминала его молекулы активируется в соответствии с ростом АТФ и фосфорилирует на N-терминале другой домен, обладающий свойствами медленной ATФaзы (Mutoh et al., 2013). Степень фосфорилирования доменов белка Кai C является маркером его циркадианной активности. Замедление активности АТФазного домена необходимо для образования тормозных комплексов КaiB/КaiC и формирования задержки в обратной связи, дающей возможность для подстройки фазы ритма (Phong et al., 2013). В условиях постоянного освещения (свободного бега ритма) у цианобактерий (Synechoccus elоngatus) для каждого из осцилляторов сохраняется период 24 часа, но ритмы PRX-осциллятора и КaiА/B/C протекают в противофазе, что указывает на их относительную независимость (Edgar et al., 2012). Интересно, что акрофаза ритма PRX-осциллятора приходится на темное время, по мере нарастания концентрации окислителей, т. е. демонстрируя гомеостатическую регуляцию редокс-состояния по типу «отклонения», тогда как ритм КaiА/B/C – по опережающему типу, аналогичного описанным выше (глава II) реакциям ранней фазы ответа на гипоксическое прекондиционирование (Самойлов и др., 2012).

У эукариот включение в формирование циркадианного осциллятора белков часовых генов, прямо регулирующих энергетический обмен в митохондриях и redox-cтатус клетки, оказалось одним из механизмов, обеспечивших бóльшую стабильность циркадианного ритма и расширивших возможности его коррекции благодаря многочисленным прямым и опосредованным обратным связям, а также разнообразным процессам пост-транскрипционной и пост-трансляционной модификации clock-белков. На участие clock-белков в ответе на повышение уровня активных кислородных метаболитов указывает сдвиг фазы циркадианного ритма clock-осциллятора при оксидативном стрессе с последующей активацией защитных механизмов (Tamaru et al., 2013).

Рис. 4. Нормированное содержание Prx-SO2/3 в эмбриональных фибробластах мышей дикого типа (внизу) и двойных нокаутов по cry1/2. (по: О’Neilly, Reddy, 2011, с изменениями).

Для clock-осциллятора эукариот, сформированного белками часовых генов, наиболее подробно исследована связь генерации циркадианных ритмов с уровнем освещенности и метаболизмом как источниками соответственно экзо– и эндогенной энергии.

А. Характеристика сlock-осциллятора

У млекопитающих белки часовых генов (сlock-белки) синтезируются в большинстве клеток организма. При этом во всех структурах центральный элемент clock-осциллятора представлен схожим набором основных белков. В их число включены: семейства белков, кодируемых генами period (белки Per1, Per2, Per3), cryptochrome (белки Cry1, Cry2), clock (белок Clock – Circadian Locomotor Output Cycles Kaput, и его функциональный дублер белок Npas2, он же Mop4), bmal1 (белок Bmal1 – Вrain and Muscle Arnt-like protein 1, он же Arnt1 или Mop3) и менее эффективный белок Bmal2. Все сlock-белки относятся к семейству транскрипционных факторов, содержащих домен basic-helix-loop-helix (bHLH), связывающий белок с ДНК, и PAS домен с мотивом Per-Arnt-Sim (наименование в соответствии с названиями первых белков, в которых домен был описан). Домен PAS активируется светом и может связывать железо-содержащий гем, О2, СО или NO. Следовательно, PAS-содержащие белки могут реагировать не только на изменение уровня освещенности и параметров магнитного поля, но и газового состава внешней или внутренней сред, что важно для гомеостатической регуляции процессов окисления. Информационно значимыми сигналами для PAS-доменов clock-белков являются и эндогенные факторы энергетического обмена, изменения мембранного потенциала, а также воздействия стероидных и пептидных гормонов (Gilles-Gonzalez, Gonzalez, 2004, и др.). Полагают (McIntosh e.a., 2010, и др.), что разнообразие чувствительности этих белков определяют разные типы их PAS доменов: тип PAS А преобладает в транскрипционных факторах, тогда как в белках ионных каналов, фосфодиэстеразах и PAS-содержащих протеинкиназах – тип PAS В. Основной эффекторный белок clock-осциллятора – Bmal1 имеет оба типа домена. При активации PAS домена изменяется структура белка, домен сближается с «партнерным» эффекторным доменам этого же белка и передает ему информационно значимый сигнал. Эффекторный домен clock-белка обладает ферментативной активностью гистидинкиназы или фосфо-диэстеразы (у прокариот), а у млекопитающих PAS активирует ДНК – связывающий домен bHLH. Последний фактически интегрирует сигналы об уровне экзо– и/или эндогенной энергии от PAS-домена и информационные сигналы о влиянии лигандов (в том числе, гормонов), опосредуемые через внутриклеточные системы посредников (Gilles-Gonzalez, Gonzalez, 2004). Кроме белков clock-осциллятора, PAS домен имеют многие белки, важные для поддержания энергетического гомеостазиса, например, HIF1α и HIF1β (транскрипционные факторы, индуцированные гипоксией), а также PASK (PAS-содержащая киназа). Этот фермент поддерживает базальный уровень секреции инсулина, ключевого гормона-регулятора метаболизма (Semplici et al., 2011, и др.).

Через PAS домены сlock-белки взаимодействуют между собой с образованием гетеродимерных комплексов Per1/Cry1, Per2/Cry2, объединенных в тетрамер, и Clock или NPAS2 с Bmal1 (Albrecht, 2012). Гетеродимер Clock/Bmal1 представляет эффекторное звено clock-осциллятора, а Per1/Cry1-Per2/Cry2 – регуляторное, определяющее длительность задержки в звене обратной связи для подстройки к 24-часовому ритму. Комплекс Clock/Bmal1 транслоцируется в ядро, ре-моделирует хроматин и активирует транскрипцию генов, имеющих в промоторе один или несколько сайтов Е-box (Enhanсer-box) cis-регуляторных c канонической последовательностью нуклеотидов CACGTG. Аффинность Е-box к гетеродимеру зависит от его локализации, определяя степень влияния Clock/Bmal1 на контролируемые ими гены (Nakahata et al., 2008; Bellet, Sassone-Corsi, 2010). Среди последних гены транскрипционных факторов per, cry, ror, rev-erb α, ppar α, ppar γ, продукты которых регулируют транскрипцию или активность Clock/Bmal1. Они действуют через другие участки промоторов, а также комплекс генов ключевых ферментов и гормонов-регуляторов углеводного, липидного и энергетического метаболизма. По мере экспрессии и накопления гетеротетрамеров Per1/Cry1/Рer2/Cry2 они транспортируются в ядро, где связывают белки Clock и Bmal1 и подавляют их транскрипционную активность (рис. 5).

Возможно и прямое подавление ими по отрицательной обратной связи в clock-осциллляторе транскрипции собственных генов per и cry после привлечения других молекул и образования PER-комплекса У млекопитающих PER-комплексы имеют сложный состав и включают РНК-геликазы DDX5 и DHX9, большую субъединицу активной РНК полимеразы II, пре-мРНК Per и Cry, а также геликазу SETX. Последовательное взаимодействие компонентов PER-комплекса способствует терминации транскрипции генов рer и сry и препятствует ее ре-инициации (Padmanabhan et al., 2012), т. е. ограничивает длительность транскрипции как временного процесса. Кроме того, участие в PER-комплексе геликаз, РНК полимеразы II и пре-мРНК указывает на возможность его влияния на процессы пост-транскрипционной модификации и созревания мРНК (Koijima et al., 2011, и др.).

При подавлении транскрипционной активности Bmal1, молекула которого содержит PAS A и PAS В, репрессоры связываются с разными доменами: Per2 с PAS A и частично с соседним доменом, осуществляющим связь с ДНК, – bHLH, тогда как белки Cry1 и Cry2 – с PAS B (Langmesser et al., 2008). Это определяет попеременное доминирование функций Per/Cry и Clock/Bmal1 в течение суток. Однако исследования показывают более сложную картину. Показано, что в клетках печени частота связывания с ДНК была наибольшей для белков Bmal1, Clock и Npas2 в утренние часы (6-10 час), для Per1, Per2, Cry2 максимум активности приходился на 16 час, тогда как для Cry1 – на 24–01 час (Koike et al., 2012). Показано (Ukai-Tadenuma et al., 2011, что. Cry1 участвует в контроле собственной транскрипции в зависимости от ультрадианных фаз околосуточного ритма: он может воздействовать на связывание соответствующих транскрипционных факторов c разными последовательностями ДНК: «утренними» (Clock/Bmal1– с Е/Е’box в промоторе гена cry1), «дневными» (DBP – c D-box в составе проксимального промотора гена cry1) и «ночными» (Rev-erb α или ROR α с RRE – Rev-erbα, ROR-responsive Еlement в составе интрона энхансерной области гена cry1).

Рис. 5. Схема взаимодействий между белками clock-осциллятора (По: Golombek, Rosenstein, 2010, Albrecht, 2012, с изменениями). Обозначения: гетеродимер Clock/Bmal1 через Е-box элементы промоторов активирует транскрипцию генов других белков осциллятора per, cry, rev-erbα, rorα и иных clock-контролируемых генов. Толстая стрелка – репрессорное воздействие, тонкие – активирующее. Белок Per2 может быть ко-репрессором Bmal-1 в комплексе с Rev-erb α или ко-активатором – с ROR α.

Последовательности Е– и D-box, RRE, а также цАМФ-респонсивный элемент CRE, связывающий транскрипционный фактор СREB (CRE-Binding protein), представляют основные локусы ДНК, с которыми взаимодействуют сlock-белки (Ueda et al., 2005). У «прозрачной» рыбки Danio rerio в органах in vivo и культуре клеток сайт D-box промотора гена per2 может прямо активироваться видимым светом (Mracek et al., 2012). Очевидно, что максимум связывания с ДНК обусловлен, в первую очередь, концентрацией в нуклеоплазме определенных сlock-белков, зависящей от соотношения интенсивности процессов транскрипции генов, посттранскрип-ционной модификации мРНК, синтеза clock-белков и их пост-трансляционной модификации, а также скорости убиквитин-зависимой деградации сlock-белков в протеасомах. В частности, показано, что по мере роста в цитоплазме концентрации белков Per они фосфорилируются казеинкиназами 1 дельта и 1 эпсилон (СК1δ/ε) (Lee et al., 2009), а Per2 дополнительно фосфорилируется киназой 3β гликогенсинтазы (GSK3β) и ацетилируется, что приводит к убиквитин-зависимой протеасомной деградации этих белков (Bellet, Sassone-Corsi, 2010).

Полагают, что оба фермента, СК1δ/ε и GSK3β, возникли в эволюции вместе с PRX-осциллятором (Edgar et al., 2012). Для убиквитирования и протеолиза белка Cry необходимо его фосфорилирование по двум сайтам аденозинмонофосфат-зависимой протеин-киназой (АМРК) и GSK3β (Мohawk et al., 2012). По мере снижения в ядре содержания Per и Cry транскрипционная активность Clock/Bmal1 выходит из-под их репрессорного воздействия. Это послужило основанием для представления о том, что реализуемая белками Per и Cry петля отрицательной обратной связи (так называемая транскрипционно-трансляционная петля обратной связи) как «задержка транскрипционной активности Clock/Bmal1» лежит в основе ритмической активности циркадианного осциллятора, тогда как скорость протеасомного протеолиза белков Per и Cry определяет длительность «субъективного» дня (DiTacchio et al., 2011; Sassone-Corsi, 2012). На других фазах циркадианного ритма возможна протеасомная деградация Clock после его фосфорилирования и гиперфосфорилирования по Ser 38, Ser 42 и Ser 427 и последующего снижения способности гетеродимера Clock/Bmal1 связываться с сайтом Е-box промоторов разных генов (Yoshitane et al., 2009). Для сдвига фазы транскрипции определенного гена сlock-осциллятора имеют значение число копий Е-box в промоторе (показано для per1) или сочетание канонических и неканонических элементов Е-box и D-box (доказано для per2) (Yoo et a., 2005, и др.).

Большую роль в формировании ритма многие авторы отводят посттрансляционной модификации сlock-белков. Участвующие в этих процессах ферменты активируются в процессах метаболизма и/или в результате связывания лигандов с мембранными рецепторами и активации ферментов сигнальных путей (подробнее см обзор Чернышева, 2013). Особенно важным является изменение в цирка-дианном ритме цАМФ, что рассматривается как одно из основных звеньев циркадианного clock-осциллятора (O’Neill et al., 2008). Действительно, гены многих гормонов и медиаторов, рецепторы которых активируют Gs-белки, относятся к clock-контролируемым, а цАМФ-зависимая протеинкиназа (РКА) участвует в фосфорили-ровании clock-белков в процессах посттрансляционной модификации, а также фактора CREB, активирующего транскрипцию clock-генов.

Свой вклад в формирование циркадианного ритма, генерируемого clock-осциллятором, вносят и процессы посттранскрип-ционной модификации мРНК clock-генов благодаря связывающимися с ней в некодируемых 5-’или 3’– областях белкам или микроРНК. Последующая трансляция или деградация РНК определяется комплексом трансактивирующих факторов и временем их взаимодействия (Keene, 2010; Kojima et al., 2011, и др.). Среди белков, связывающихся с 3’– областью мРНК, вызывая ее нестабильность и способствуя деградации, особый интерес представляет ряд гетерогенных ядерных рибонуклеопротеинов (heterogeneous nuclear ribonucleoproteins, hnRNPs), – hnRNP I, hnRNP D и hnRNP Q (Chaudhury et al., 2010). Их содержание в цитоплазме изменяется в циркадианном ритме, снижаясь ночью и повышаясь днем, в противофазу с clock-белками PER2 и CRY1 (hnRNP I и hnRNP D, соответственно), а также с REV-ERBα (hnRNP I) (Woo et al., 2010). Следовательно, к концу дня снижение содержания в клетках PER/CRY является результатом двух аддитивно действующих процессов: деградации соответствующих мРНК в результате их пост-транскрипционного изменения и протеасомного протеолиза белков как итог их посттрансляционной модификации. Это «гарантирует» стабильность параметров циркадианного ритма и, с другой стороны, дает возможность их изменения в процессах адаптации. Интересно участие hnRNP Q в контроле «дублирующего» механизма регуляции ночной и дневной активности clock-осциллятора через изменение синтеза мелатонина. Известно, что синтез из триптофана гормона мелатонина, растущий в темное время суток и года, регламентируется двумя ключевыми ферментами. Экспрессию одного из них, серотонин N-ацетилтрансферазы (или арилалкиламин N-ацетилтрансферазы, AANAT), контролирует hnRNP Q, который связывается с консервативным сайтом IRES в 5′ – нетранслируемой области мРНК соответствующего гена с образованием «шпильки», к ней привлекается рибосомальный комплекс с последующим синтезом AANAT (Kim et al., 2007). Содержание hnRNP Q высоко также ночью. Фосфорилирование белка AANAT цАМФ-зависимой протеинкиназой А предотвращает его деградацию в протеасоме, что определяет возможность участия фермента в синтезе мелатонина. Одновременно hnRNP Q (в комплексе с hnRNP L и hnRNP R) связывается с 3′-нетранслируемой областью мРНК AANAT и способствует деградации мРНК, ограничивая таким образом длительность экспрессии фермента и образования мелатонина. В течение дня уровень мРНК AANAT и цитоплазматического hnRNP Q низок, что обусловливает значительное снижение экспрессии фермента и синтеза мелатонина (Kim et al., 2005). Заметим, что причины циркадианного ритма экспрессии белков hnRNP не выяснены. У животных в циркадианном ритме осуществляется контроль и других посттранскрипционных процессов, связанных с созреванием мРНК (сплайсинга, полиаденилирования, деаденилирования) (Bartok et al., 2013), хотя многие детали взаимодействия их с clock-осциллятором остаются не ясными.

Б. Функции белков часовых генов

Функции белков часовых генов отражают наличие свойств, необходимых для генератора временных процессов. Условно их можно разделить на сенсорные – по отношению к прямому или опосредованному действию субстанционального времени и изменениям временной структуры организма, и эффекторные, направленные в целом на поддержание и адаптацию временной структуры организма к воздействиям окружающей среды («факторам нестабильности»).

Принятая нами парадигма информационно-энергетической природы биологического времени позволяет предположить, что способность clock-белков интегрировать информационные сигналы разной модальности и энергетической природы отражает их способность воспринимать поток субстанционального времени и биологическое время, генерируемое временной структурой организма. Оговоримся, что, хотя вопрос о доказательствах прямого воздействия субстанционального времени на биосистемы пока открыт, можно с уверенностью говорить о его опосредованном влиянии через космические тела, в том числе, Солнце и Луну. По определению рецептором или сенсором называется структура, которая воспринимает входной сигнал, усиливает, преобразует и передает его на эффекторные структуры. Ему соответствуют наши космические соседи, которые, как и сама Земля, могут опосредовать с учетом названных критериев воздействия субстанционального времени на биоcистемы и белки clock-осцилляторов. Подобная сенсорная функция clock-белков, подразумевающая усиление входного сигнала темпоральной природы и его преобразование в генерируемые временные процессы является необходимым условием для участия clock-осцилляторов в поддержании гомеостазиса эндогенного времени (Чернышева, 2009).

Эффекторные функции clock-белков включают: регуляцию обмена веществ и энергии и формирование циркадианных ритмов метаболизма; формирование циркадианного ритма двигательной активности, сна и бодрствования; взаимодействие с другими клеточно-молекулярными осцилляторами циркадианного ритма; участие в регуляции и запуске других типов ритмов (ультрадианных, лунных, цирканнуальных); регуляцию на клеточном уровне других типов временных процессов: направленного времени (через апоптоз) и клеточных циклов. Рассмотрим некоторые из этих групп функций clock-белков подробнее.

Регуляция метаболизма.

Установлено, что белки сlock-осциллятора прямо или через активацию транскрипции генов ключевых ферментов участвуют в регуляции метаболизма углеводов и липидов, основных источников энергии (Doi et al., 2008; Yang et al., 2009; Mazzoccoli et al., 2012, и др.). Например, в гепатоцитах мышей дикого типа, в отличие от мутантов с двойной делецией генов clock-/ – и bmal1-/-, в циркадианном ритме активируется транскрипция генов ферментов фосфофрукто-киназы, фруктозо-1,6-бифосфатазы, гликогенсинтазы, гликогенфо-сфорилазы, фосфоенолпируват карбоксилазы 1, глюкозо-6-фосфатазы, а также транспортера и сенсора уровня глюкозы Glut 2 (Rudic et al., 2004, и др.). Влияние белков ClOCK/BMAL1 на экспрессию этих ферментов может быть опосредовано действием ключевой гистоновой метилтрансферазы MML3, транскрипция гена которой контролируется белками clock-осциллятора (Valekynja et al., 2012). Показано, что белок ClOCK, обладающий свойствами гистоновой ацетил-трансферазы(, кроме гистона Н3, также ацетилирует и активирует ряд митохондриальных белков, включенных в метаболизм аминокислот и жирных кислот, цикл трикарбоновых кислот, гликолиз и глюко-неогенез (Mastri et al., 2013).

Как упоминалось ранее, цикл трикарбоновых кислот, протекающий у эукариот в митохондриях, относится к циклическим саморегулирующимся метаболическим временным процессам, переключающим катаболические реакции метаболизма на энергетический обмен через NADH/NAD+ с выходом на синтез АТФ и другие процессы синтеза. Кроме того, белки Clock/Bmal1 через Е-box промотора контролируют транскрипцию гена ко-фермента никотинамид фосфорибозилтрансферазы (NAMPT), которая при снижении уровня энергетического обмена катализирует окислительно-восстановительные реакции (Ramsey et al., 2009; Mastri et al., 2012; Sassone-Corsi P. 2012). Увеличение содержания и активности NAMPT на определенной фазе циркадианного ритма приводит к росту уровня NAD+ и активации NAD+-зависимой гистоновой деацетилазы SIRT-1 (silent information regulator 1, sirtuin 1) в цитоплазме и SIRT-3 и -4 в митохондриях, а также NAD+-ADP-рибозил трансферазы 1 (или PARP-1, Poly[ADP ribose]polymerase 1) (Imai, 2010; Li, 2013, и др.). Clock-осциллятор через изменение в циркадианном ритме NAD+, а также SIRT-3 и SIRT-4, деацетилирующих и активирующих ферменты митохондрий, обусловливает когерентные вариации уровня окислительных процессов (Peek et al., 2013). SIRT1 в цитоплазме деацетилирует белки ClOCK, BMAL1, PER2 и PGC-1α (ко-активатор PPARγ – γ-рецептора, активируемого пролифератором пероксисом,). Это приводит к ослаблению свойств гистоновой ацетилтрансферазы у белка ClOCK (Sassone-Corsi, 2012) и, следовательно, взаимодействия белков в димере ClOCK/BMAL1 с последующим снижением сродства BMAL1 к E-box. Однако деацетилированный PGC-1α активируется и совместно с RORα, метаболическим сенсором и транскрипционным фактором, активирует транскрипцию гена bmal1 (Albreht, 2012). Кроме того, PER2, деацетилированный SIRT-1, подвергается убиквитированию и протеасомному протеолизу, что уменьшает его репрессорное воздействие на транскрипционную активность ClOCK/BMAL1 (Asher et al., 2008). Однако сам PER2, вне его функций в осцилляторе, регулирует уровень гликогена в печени при голодании и возвратном питании (Repperger, Albrecht, 2012; Zani et al., 2013). Кроме того, при снижении температуры PER2 в митохондриях активирует транскрипционные процессы, важные для энергетического гомеостазиса (Сhappius et al., 2013). Использование фармакологических активаторов SIRT1 вызывало в промоторах часовых генов уменьшение содержания гистонов, ацетилированных по Lys9 и Lys14, и усиливало репрессию их транскрипции в зависимости от фазы циркадианного ритма в различных тканях (Sahar, Sassone-Corsi, 2012). Важным следствием SIRT1-зависимого деацетилирования в печени является активация в циркадианном ритме метаболизма холестерола (Li et al., 2007) и глюконеогенеза (Schwer, Verdin, 2008, и др.), причем, в последнем случае SIRT1 действует в комплексе с PGC-1α (Rogers et al., 2005).

Известно, что при ограничении пищи, снижении уровня АТФ и росте аденозинмонофосфата увеличивается активность АМФ-зависимой протеинкиназы (АМРК), для которой, как и для белков часовых генов, одной из мишеней является NAMPT (Srivastava et al., 2012). Кроме того, АМРК регулирует энергетический статус клетки через изменение метаболизма NAD+ и активности SIRT-1. Вместе с тем, цАМФ и РКА могут прямо активировать SIRT-1, независимо от NAD+ (Li, 2013). Это позволило рассматривать белки СLOCK, BMAL1, NAMPT, SIRT-1 и AMPK в качестве «аддитивного сенсора энергетического обмена» (Nogueiras et al., 2012), что подтверждает функцию сенсора времени для сlock-белков (Чернышева, 2008б), наряду с известными функциями генератора и регулятора временных процессов.

Зависимость от уровня АТФ активности циркадианного пероксиредоксинового осциллятора и экспрессии белков сlock-осциллятора обусловливают и ритмичность активности АМРК (Lamia et al., 2009; Um et al., 2011). В свою очередь, AMPK через фосфорилирование CRY1 (Lamia et al., 2009) и казеин киназы 1ε, фосфорилирующей белок PER, обусловливает протеасомный протеолиз этих репрессорных транскрипционных факторов и, соответственно, поддерживает циркадианный ритм сlock-осциллятора.

Функции сlock-белков в метаболизме могут опосредоваться и через активацию транскрипции ряда гормонов и/или их рецепторов, принимающих участие в регуляции аппетита и жажды, пищевого и питьевого поведения, углеводного, липидного и белкового обмена веществ. Установлено, что циркадианная ритмика характерна для секреции и эффектов гормонов, важных для обмена веществ и энергии. Среди них вазопрессин, вазоактивный интестинальный гормонов, холеоцистокинин, нейропептид Y, адипонектины, кортико-либерин, кортикотропин и глюкокортикостероиды, андрогены и эстрадиол, лептин и грелин, гормон роста и инсулин, Агути-подобный пептид, CART, меланотропин (Bass, Takahashi, 2012; Mohawk et al., 2012; Sahar, Sassone-Corsi, 2012; Bellet et al., 2013, и др;). По обратным связям эти гормоны могут участвовать в транскрипции clock-белков и в процессах их посттрансляционой модификации, способствуя формированию и поддержанию ритмов.

Контроль функций физиологических систем.

В основе формирования циркадианного ритма двигательной активности, сна и бодрствования лежат синаптические связи между СХЯ и соответствующими нервными центрами (Ковальзон, 2012; Mohawk et al., 2012; Morin, 2013), а также околосуточные метаболические ритмы в нервной, гормональной и иммунной системах (Bass, Takahashi,2010; Bellet, Sassone-Corsi, 2012). Экспрессия clock-генов в нейронах структур всех отделов ЦНС усиливает локально сигналы от СХЯ как циркадианного «мастер-clock». Синаптические связи его с висцеральными центрами гипоталамуса и ствола, спинного мозга и симпатическими и парасимпатическими ганглиями (Bartness, 2001, и др.) и входы к нему с периферии от интерорецепторов (Филиппова, Ноздрачев, 2012) обеспечивают подстройку ритмов висцеральных функций к околосуточным ритмам света и возможность синхронизации с ритмами обмена веществ и энергии. Важную роль локальных усилителей влияний СХЯ играет экспрессия белков clock-осциллятора в клетках скелетных и сердечной мышцы, в гладкомышечных клетках сосудов, пищеварительного тракта и различных протоков, в фибробластах кожи и соединительнотканных оболочек, в иммунокомпетентных клетках и клетках крупных висцеральных органов и желез. Недостаточно исследован вопрос взаимодействия clock-осциллятора с другими клеточно-молекулярными осцилляторами циркадианного ритма. У грибов и млекопитающих в СХЯ ритмы clock– и PRX– осцилляторов сдвинуты относительно друг друга и работают независимо, в противофазе, тогда как в печени мыши они синфазны (Edgar et al., 2012). Подобная тканевая специфичность, по-видимому, в первую очередь, связана с особенностями восприятия ритм-задающего источника энергии: света в СХЯ и пищи / метаболизма в печени и жировой клетчатке.