Текст книги "Вирусы. Драйверы эволюции. Друзья или враги?"

Эпидемия гриппа: одежда по сезону

Грипп чаще встречается в виде сезонных эпидемий, в зимние месяцы, в регионах с умеренным климатом в Северном и Южном полушариях. Факторы, управляющие этой сезонностью, неизвестны. Высказывалось предположение, что такие погодные условия благоприятствуют передаче вируса между хозяевами – возможно, благодаря более тесному контакту между людьми, проводящими в зимние месяцы больше времени в закрытых помещениях. Другие ученые считают причиной сезонное ослабление иммунитета или дефицит витамина D в связи с укорочением светлого времени суток. Некоторые или все эти факторы могут играть большую или меньшую роль. Выяснено, что эпидемии гриппа среди птиц возникают во время, предшествующее миграции, когда птицы сбиваются в группы после рождения восприимчивых к гриппу птенцов, поэтому весьма вероятно, что поведенческие факторы, влияющие на передачу вирусов, являются основными в определении сезонности инфекции (Nelson, Holmes, 2007). Было установлено, что тиглем человеческого гриппа являются субтропические области Восточной и Юго-Восточной Азии. В этих областях эпидемии не следуют сезонным циклам, и вирус может быть выделен в любое время года. Представляется вероятным, что линии вирусов гриппа постоянно циркулируют в этом регионе и сеют семена эпидемий, распространяющихся в зоны с умеренным климатом.

Эволюция генотипов и фенотипов вируса гриппа, происходящая во время эпидемий, является главной проблемой в их безграничной возможности вызывать эпидемии у людей. Мы принимаем как догму, что постоянство ежегодных эпидемий стало возможным благодаря способности вирусов избегать воздействия иммунитета хозяев путем образования новых штаммов. Геном циркулирующего во время эпидемии вируса гриппа находится в организме хозяина под сильным давлением отбора. Это давление является орудием гонки вооружений: если у хозяина сохранена иммунологическая память об инфицировании тем же или близкородственным вирусом, находящиеся на страже антитела быстро нейтрализуют вирус сразу после инфицирования. Поэтому на вирусы действует сильное диверсифицирующее давление, которое благоприятствует вирусам с измененными антигенами. Такие вирусы не распознаются иммунной системой хозяина и становятся объектами положительного отбора. Только те вирусы и содержащаяся в них генетическая информация, которые избегнут нейтрализации, смогут обеспечить непрерывность передачи в популяции жертв. Вирус создает необходимое генетическое разнообразие в форме мутаций поверхностных гликопротеинов ГА и НА. Доминантные эпитопы белка нейраминидазы обнаруживаются в наиболее далеко выступающем участке белка ГА, называемом HA1. Эта часть вирусной частицы наиболее важна в определении ее антигенности, именно она распознается и связывается защитными антителами. Исторически HA1 всегда был самым исследованным белком вируса гриппа, как с точки зрения филогенеза, так и с точки зрения иммунологии. Каждый год собирались и исследовались нуклеотидные последовательности для выяснения генетической эволюции циркулирующего вируса гриппа. Внимательному изучению подверглись и защитные антитела, распознающие HA1; на этом белке были выявлены пять главных эпитопов, частей белка, на которые предпочтительно нацелены антитела. Именно здесь разыгрывается первая стадия гонки вооружений.

Принято считать, что это давление отбора вызывает изменение антигенного состава капсида в результате постепенных мутационных изменений в эпитопах HA1. Результатом является такое же постепенное ослабление иммунного ответа хозяина, что служит главным источником конкурентного преимущества, которое движет эволюцию эпидемических штаммов вируса гриппа. Дрейф антигенов вместе с ослаблением иммунологической памяти в популяции хозяев и доступность новых хозяев – фундаментальная необходимость для сохранения и распространения эпидемических линий вируса гриппа. При отсутствии эволюции антигенов и ускользании от действия иммунитета вирус столкнется с уменьшением восприимчивости популяции хозяев к инфекции. В такой ситуации может повыситься групповой иммунитет и доля хозяев, восприимчивых к инфекции, станет ниже критического порогового уровня. Возможно, это противоречит здравому смыслу, но для того, чтобы популяция выжила в борьбе с хищничеством возбудителя инфекции, совершенно необязательно, чтобы все индивиды в популяции имели иммунитет к инфекции. Если к инфекции устойчива просто значительная доля индивидов, то прервется цепь передачи инфекции в популяции в связи с малым числом восприимчивых хозяев, и эпидемия самопроизвольно угаснет. Патоген может существовать в этих условиях, время от времени вызывая эпидемии, если находит восприимчивую к инфекции популяцию, которая может поддержать распространение вируса. С другой стороны, некоторые патогены – и вирус гриппа A входит в их число – обладают способностью поддерживать эпидемическую вспышку, изменяя в ее ходе свои свойства с такой живостью, что всегда находятся восприимчивые индивиды, за счет которых и продолжается эпидемия. Как еще может грипп находить восприимчивых жертв, если он успешно поражает (и делает иммунными) значительную долю населения мира ежегодно? Каждый год мы страдаем от нескольких «простуд», возникающих от инфицирования генетически различными вирусами, в отношении которых мы не обладаем иммунитетом. Однако каждый год в сезонных эпидемиях гриппа преобладают только один или два штамма, при исключении всех других. Таким образом, эпидемии гриппа представлены распространением и эволюцией индивидуальных генетических линий.

Вирус гриппа A идеально оснащен для того, чтобы сохранять потенциал для эпидемического распространения. Для этого он прежде всего должен находить восприимчивых жертв. Для того чтобы это стало возможно, вирус гриппа использует две стратегии. Первая заключается в использовании быстрых мутаций и селекции в условиях давления, оказываемого иммунным ответом в популяции хозяев. Постепенная, но неуклонная эволюция, производимая антигенным дрейфом, сочетается с сезонными эпидемиями вирусов определенных штаммов. Второй эволюционный механизм, антигенный сдвиг, включает в себя резкие и массивные изменения патогенности и антигенных свойств путем блочного обмена генетической информацией между разными линиями вируса. Генетический дрейф в первую очередь порождает появление антигенно разнородных штаммов вируса, которые ежегодно запускают эпидемии гриппа. Они в достаточной степени отличаются от своих предковых эпидемических штаммов, чтобы избежать воздействия иммунного ответа, но представляется, что популяция хозяев все же получает некоторую пользу от того, что уже «видела» похожий штамм в предыдущем году. Антигенный сдвиг в штаммах вируса гриппа представляет собой радикальное изменение, в ходе которого вирус в антигенном отношении становится совершенно непохожим на вирус-предшественник. Эти вирусы вызывают пандемии и являются источником больших проблем для общественного здравоохранения.

Квазивиды, кластеры последовательностей и пристрастия кодонов

За последние годы генетическая структура циркулирующих штаммов вируса гриппа была подвергнута интенсивному изучению, так как теперь доступны технологии, позволяющие быстро определять нуклеотидную последовательность множества вирусных разновидностей и анализировать ее с помощью быстродействующих компьютерных программ. Наибольшее внимание было уделено вирусу эпидемического гриппа H3N2, который появился в 1968 году и продолжает циркулировать в наши дни. В двух исследованиях, опубликованных в Proceedings of the National Academy of Sciences (Plotkin, Dushof, Levin, 2002; Plotkin, Dushof, 2003), выполненных учеными Принстонского университета, были представлены результаты изучения эволюции генетических последовательностей гена гемагглютинина вируса H3N2 из базы данных более 500 вирусных последовательностей, собранных за два десятилетия ВОЗ, наблюдавшей за эпидемиями гриппа. В исследовании были разработаны две концепции, позволяющие подвести фундамент под эволюцию эпидемического вируса гриппа. В первом исследовании вместо того, чтобы ограничить анализ филогенетическими отношениями между белками гемагглютинина, ученые начали изучать их хронологически. Они выполнили попарное сравнение аминокислотных кодонов во всех генных последовательностях, кодирующих ГА, определив «расстояние» между каждой последовательностью, и распределили их по времени. В результате анализа было выяснено, что HA1– последовательности распадаются на близкородственные кластеры, которые изменяются во времени, притом что один кластер последовательностей заменяется другим каждые два-пять лет. Существование и циркуляция вирусных генных последовательностей в виде кластеров родственных последовательностей, словно эхо, повторяет возникновение вирусных квазивидов или групп родственных последовательностей, синтезируемых вирусной РНК-полимеразой. На самом деле, каждый элемент базы данных является записью одного члена преобладающего квазивида в организме данного хозяина. Следовательно, эпидемический вирус гриппа существует в виде ансамбля родственных кластеров последовательностей (каждый из которых является квазивидом), которые проявляют метастабильность, периодически сменяясь конкурирующими группами. Эти наблюдения согласуются с результатами теоретического математического моделирования в приложении к антигенному многообразию инфекционных агентов (Gupta, Ferguson, Andererson, 1998), где было показано, что в условиях сильного давления отбора популяции будут разделяться на дискретные штаммы, но при среднем уровне давления эти различные штаммы могут варьировать либо циклично, либо хаотично. Является ли это основой такой вариабельности гриппозных кластеров? В любом случае возникновение и сохранение квазивидового представления кластеров должно быть выгодно с точки зрения эволюции для популяции вирусов гриппа, так как представляет базис для быстрой генетической и антигенной эволюции в ответ на давление окружающей среды.

Вторая статья (Plotkin, Dushof, 2003) представляет собой в некотором роде веху в понимании эволюции и антигенной пластичности белка гемагглютинина эпидемического вируса гриппа. Было установлено, что ген гемагглютинина развился ради способности к эволюционному развитию. На первый взгляд, это абсолютно еретическое утверждение: как может дарвиновский отбор действовать на фенотип, который еще даже не существует? В этом исследовании ученые тоже использовали большие базы данных относительно последовательностей гемагглютинина, но в данном случае усилия были сосредоточены на отношении изменений последовательностей нуклеотидов в гене гемагглютинина к изменениям последовательностей аминокислот в самом гемагглютинине. Вспомним, что мутации в кодирующих белки генах могут быть синонимическими и несинонимическими, и гены, находящиеся под давлением положительного естественного отбора, накапливают непропорционально большее число несинонимических мутаций, которые изменяют аминокислотную последовательность в белке. Эти ученые распространили свое наблюдение на ГА1 кодирующие последовательности штамма H3N2, собранные за период в двадцать лет. В исследовании было показано, что в пяти дискретных участках белка HA1, образующих места связывания с антителами, происходит существенно больше несинонимических нуклеотидных мутаций, чем в других частях гена. Это наблюдение согласуется с предположением о том, что эпитопы HA1 находятся под сильным диверсифицирующим давлением положительного отбора. В других участках белка (а на самом деле, и в других белках вируса) везде преобладают синонимические нуклеотидные мутации. Эти участки подвергаются более низкому давлению иммунологического отбора и являются потенциальными объектами давления очищающего отбора благодаря своим более сложным функциям или хрупкости в отношении мутационных изменений. Эти участки могут оставаться неизменными с течением времени, не вредя жизнеспособности вирусной линии.

Авторы углубленно исследовали результаты этого наблюдения в надежде понять механизмы, обеспечивающие высокую скорость эволюции и иммунологическую пластичность вирусного ГА. Они детально исследовали состав кодонов, используемых вирусом для кодирования белка HA1. Авторы различали кодоны на основе их волатильности. Каждый, состоящий из трех нуклеотидов кодон по единичным нуклеотидным изменениям отнесен к одному из девяти «мутационных соседей». Из этих девяти мутаций какая-то часть превращает кодон в синонимический, а какая-то часть – в несинонимический, который вставляет в синтезируемый белок другую аминокислоту. Более волатильными являются те кодоны, в которых большая часть из возможных девяти мутаций является несинонимической, то есть приводит к вставке в белок другой аминокислоты. Использование определенных кодонов в гене с большей частотой, непропорциональной их средней встречаемости при кодировании определенной аминокислоты, названо пристрастием кодона. Такие пристрастия встречаются нередко и подвержены влиянию многих факторов, но в данном случае авторы обнаружили убедительные свидетельства того, что пристрастия кодонов были характерны для определенных аминокислот, составляющих эпитопы HA1, и ограничивались ими. Примечательно, что вирус гриппа, как оказалось, использует непропорционально большое число волатильных кодонов для кодирования последовательностей эпитопов. Пристрастие выражалось в том, что использовались кодоны, имевшие наименьшее число синонимических мутационных соседей. Другими словами, вирусный белок HA1 нашел оптимальную скорость, с какой он может изменять аминокислотный состав эпитопов. Изменения аминокислотного состава, таким образом, могут происходить при меньшем числе мутационных событий. Участки, связывающие антитела, оптимально используют кодоны, обладающие наибольшей вероятностью претерпевать несинонимические единичные нуклеотидные замены, то есть они оптимально подходят для быстрой эволюции.

Авторы хорошо сознавали, что такое утверждение не слишком хорошо согласуется с принятыми взглядами на дарвиновскую эволюцию, потому что оно нарушает «закон причинности». Эволюция не предусматривает будущих преимуществ от мутации в положении данной аминокислоты в белке. Волатильный кодон оказывается выгодным только после того, как удаляется из последовательности в результате мутации, и, таким образом, не может быть объектом естественного отбора. Агентом отбора может быть только фенотипическое преимущество новой аминокислоты. Были предложены два аргумента для объяснения того, как такие пристрастия кодонов сохраняются в кодирующих HA1 последовательностях. Первое объяснение ретроспективное: пристрастие кодона является отпечатком, оставленным предыдущим отбором, зависящим от частоты мутаций. Вирус инфицирует в течение года значительную долю человеческой популяции, и относительно длительно действующий иммунитет, развивающийся после инфицирования, является активным движителем частотно-зависимого отбора антигенных вариантов. Такой отбор требует, чтобы такое селективное давление на аллели подчинялось частоте их появления в популяции: аллели с низкой частотой получают преимущество и подвергаются действию положительного отбора, а преобладающие аллели подвергаются отбору отрицательному. В контексте антигенной вариабельности это означает, что эпитопы с низкой частотой появления будут плохо распознаваться иммунной системой хозяина (являясь, таким образом, ускользающими от иммунного ответа), в то время как преобладающие эпитопы представляют собой мишени иммунитета и являются невыгодными. Можно ожидать, следовательно, что давление отбора на какой-то определенный эпитоп будет изменяться со временем и в контексте особенностей каждой эпидемии. Ученые сделали предположение, что мутационный процесс в пристрастных кодонах является симметричным во времени, то есть каждая мутация может подвергнуться обратной мутации. Если допустить, что волатильные кодоны имеют большую долю соседей с единичными нуклеотидными заменами, то, опираясь на статистику, можно заключить, что кодируемая аминокислота, вероятно, и сама возникла в результате единичной нуклеотидной замены. Больше того, можно также утверждать, что существует высокая вероятность того, что следующая мутация в кодоне тоже вызовет замену аминокислоты. Отсюда, если допустить, что здесь действует частотно-зависимый отбор, то на положении нуклеотида отразится пристрастие кодона.

Первое объяснение не предполагает, что пристрастие кодона выбирается на основании его адаптивной полезности, но второй перспективный аргумент подразумевает, что такая возможность существует. Проще говоря, этот аргумент основан на наблюдении, согласно которому существует корреляция между волатильностью кодона и средней волатильностью родственных ему кодонов, отличающихся на единичную нуклеотидную мутацию. Так как в среднем волатильность порождает волатильность, можно утверждать, что волатильность может быть наследуемым признаком в эволюционных линиях. Это чудесный аргумент – как говорили в старину, «неопределенный, но тонко уравновешенный». В любом случае эти исследования HA1 являются эмпирическими наблюдениями, описывающими систему такой, «какова она есть», независимо от ее специфической этиологии. Пристрастность кодона является чрезвычайно полезным инструментом, которым располагает вирус гриппа для ускорения своей адаптивной эволюции и успешной конкуренции в гонке вооружений с человеческой иммунной системой. Несмотря на отсутствие подобной информации о других вирусах, мы можем все же предположить, что этот феномен можно наблюдать и у других вирусов, которые полагаются на антигенную пластичность и уход от воздействия иммунного ответа для сохранения генетических линий в эпидемиях или при хронических вирусных инфекциях.

Сопоставление генетической и антигенной эволюции

В 2004 году Дерек Смит из Кембриджского университета и его коллеги из Нидерландов и Соединенных Штатов опубликовали еще одну революционную статью, закрыв брешь в наших представлениях об антигенной эволюции эпидемических штаммов вируса гриппа (Smith et al., 2004). Было и до этого понятно, что изменения последовательности аминокислот в эпитопе белка HA1 транслируются в антигенные изменения, необходимые для иммунного избегания вируса. Тем не менее отсутствовали знания об истинных отношениях аминокислотных последовательностей с адаптивностью вируса и, следовательно, с фенотипом, обусловленным данной аминокислотной последовательностью. Были определены аминокислотные последовательности белковых кластеров ГА, но не было данных о взаимодействии каждого из этих вариантов с иммунной системой человека. В конце концов, самое важное – это вирусный фенотип, образующийся в результате взаимодействия вируса и хозяина. Иммунная система человека видит антигенную структуру HA1, а не просто последовательность аминокислот, на которую действует естественный отбор. Иммунная система хозяина видит антигенную структуру ГА глазами антител, которые специфично направлены против определенных эпитопов. Мы можем с полным основанием предполагать, что антитела будут по-разному видеть разные аминокислотные последовательности, но степень, в которой замены индивидуальных аминокислот изменяют способность антител хозяина связываться с HA1, остается загадочной. Изменение в структурной и физико-химической форме антигенного сайта, проявляющееся заменой определенной аминокислоты, может оказывать более или менее сильное воздействие на его распознавание циркулирующими антителами. Относительная способность антитела распознавать аффинный эпитоп, и именно она, определяет фенотип генотипа и адаптивность вируса перед лицом преобладающего антитела.

Работа Смита и его коллег позволила перебросить мост через эту брешь. Группа изучила данные об антигенах белков вируса H3N2, который циркулировал в человеческой популяции тридцать пять лет – с 1968 по 2003 год. Авторы создали количественный метод, позволяющий сравнивать антигенную эволюцию (истинную меру фенотипа) непосредственно с генетической эволюцией. Эти количественные методы были важны для того, чтобы измерить и проанализировать с помощью компьютерной программы эволюцию HA1. Метод позволил измерить перекрестную реактивность антигенов вирусных штаммов с реагирующими антителами. В отличие от изолированных вирусных штаммов и последовательностей, которые были в избытке доступны в базах данных, были недоступными реагирующие антитела больных, инфицированных соответствующими штаммами вируса. В экспериментальном рыцарском турнире авторы воспроизвели антитела, заражая хорьков выбранными штаммами вируса гриппа. Была получена сыворотка семидесяти девяти хорьков, которую исследовали на перекрестную реактивность с 273 изолированными штаммами вируса, после чего была составлена карта антигенного состава H3N2 и его изменения с течением времени. Антигенная карта показала, что вместо постепенного антигенного дрейфа на протяжении тридцати пяти лет антигенность изменялась скачкообразно и ее изменения составили группы из несоприкасающихся антигенных кластеров. Вирусы гриппа периодически испытывают скачки по мере того, как последовательные кластеры становятся доминантными, а затем исчезают с периодичностью приблизительно трех лет. Это напоминает о кластерах генетических последовательностей, описанных ранее Плоткиным и его коллегами.

Теперь ученые могли непосредственно сравнить антигенную и генетическую эволюцию вируса штамма H3N2. Результат был поразительным. Существует универсальное соответствие антигенных кластеров и генетических карт, но генетические изменения, то есть эволюция нуклеотидных последовательностей, происходит постепенно и градуально, а антигенная эволюция происходит точечными скачками. Внутри каждого антигенного кластера может произойти существенная эволюция последовательностей, которая остается немой на уровне антигенов. Таким образом, эволюция последовательностей происходит равномерно и непрерывно, но сопровождается едва заметными фенотипическими изменениями. С другой стороны, некоторые антигенные кластеры отличаются друг от друга единичной мутацией, которая произвела глубокий фенотипический эффект. Скорость эволюции между кластерами оказалась выше, чем внутри каждого кластера; быстрее всего антигенная эволюция осуществляется при переходе от одного кластера к другому.

После того как была опубликована эта пионерская работа, были проведены и другие исследования эволюции H3N2 в годы эпидемий и в промежутках между ними, но также в контексте географических и эпидемиологических данных (Holmes et al., 2005; Nelson et al., 2006). Анализ H3N2, циркулирующего во время локальных эпидемий, позволил обнаружить, что множество групп последовательностей обычно циркулирует во время каждого эпидемического сезона. Еще одна сложность проявляется в том, что эти совместно циркулирующие группы обычно обмениваются между собой генетической информацией, что создает основу для генетического разнообразия внутри циркулирующей популяции вирусов гриппа. Этот феномен, когда включается перемещение информации между разными подтипами вируса, отвечает за антигенный сдвиг и порождает пандемические штаммы вируса. Теперь стало понятно, что это весьма распространенный феномен, способствующий эволюции сезонных вирусов гриппа во время эпидемии. Такое внутритипическое перемещение сочетается с повышением скорости замен аминокислот в продуктах вирусных генов (Holmes et al., 2005; Neverov et al., 2014). Точный геномный фон каждого сегментного гена вируса гриппа влияет на его приспособленность. Генные сегменты одного вируса находятся под давлением отбора, который приводит к эволюционной коадаптации для достижения оптимальной приспособленности вируса. Нарушение хорошо адаптированного геномного состава путем блочного перемещения информации, таким образом, создает мощное давление, приводящее к коадаптации и ускорению эволюционных изменений. Это хорошо видно в передаче генетической информации между подтипами, которая является ключевым фактором быстрой эволюции, наблюдающейся в геномах возникающих пандемических штаммов вируса гриппа.