Текст книги "Цитология"

Хромосомы

Общая схема организации хромосом характерна для всех эукариот. Чаще всего это палочкообразные структуры, имеющие размеры от 0,5 мкм (микрохромосомы многих видов животных и растений) до 20 мкм (у сумчатых и однопроходных млекопитающих). Средний размер хромосом человека 7 мкм.

Хромосомы выявляются только в делящихся клетках во время митоза или мейоза. Они представляют собой максимально конденсированное (компактизированное) состояние хроматина, в котором отсутствуют синтетические процессы. Главная функция хромосом – перенос генетической информации из материнской клетки в две дочерние таким образом, чтобы те получили идентичную, одинаковую наследственную информацию.

Процесс компактизации хромосом происходит постепенно в течение 30–60 минут. Наиболее плотно упакованные хромосомы, имеющие минимальную длину, можно увидеть в метафазе митоза (рис. 4.4). В это время хромосомы состоят из двух сестринских хроматид, которые соединены друг с другом в самом тонком месте хромосомы, в районе центромеры, или первичной перетяжки.

Рис. 4.4. Двенадцатая хромосома человека, ×50 000. На фотографии видны две сестринские хроматиды, расположение центромеры (перетяжки), фибриллы хроматина, из которого состоит сама хромосома, теломеры, концевые участки хромосомы (по Ролан, Селоши, Селоши, 1978).

Принято считать, что в составе каждой хроматиды имеется одна упакованная двуспиральная молекула ДНК. Две сестринские хроматиды одной хромосомы содержат две одинаковые молекулы ДНК, т. к. они образуются из исходной материнской молекулы в процессе репликации в S-периоде интерфазы.

В последние годы терминология понятия «хромосома» меняется. Хромосомой называют структуру, содержащую одну двуспиральную молекулу ДНК. В этом случае метафазную хромосому описывают как структуру, состоящую из двух сестринских хромосом.

Согласно классическим представлениям, центромера делит хроматиду каждой хромосомы на два плеча. Плечи могут быть равными, тогда такую хромосому называют метацентрической. Если одно плечо короче другого, то хромосома именуется субметацентрической. Нередко встречаются хромосомы, у которых одно плечо значительно короче другого, они носят название акроцентрические.

Центромеры выполняют в хромосоме очень важные функции. Одна из них уже указана: центромера соединяет две сестринские хроматиды. Другая функция связана с образованием кинетохора, особой белковой структуры в виде диска или полусферы в непосредственном контакте с центромерой. В состав кинетохора входит несколько типов разнообразных белков, которые имеют сродство к микротрубочкам веретена деления и активно связываются с ними. Наличие кинетохоров обеспечивает прикрепление нескольких десятков микротрубочек к хромосоме в прометафазе митоза. У дрожжей кинетохоры отсутствуют, и к центромере прикрепляется только одна микротрубочка. Если хромосомы достаточно большие, то одна микротрубочка не обеспечит надежного движения хромосом.

Очень важным моментом в прохождении митоза является синхронность одновременного разделения всех хромосом на две хроматиды. Считается, что ведущая роль в регуляции этого процесса также принадлежит центромерам и кинетохорам.

Рассматривая морфологию хромосом, нельзя обойти вниманием их концевые участки, называемые теломерами. Основной функцией теломерных районов является их участие в делении клеток. После окончания деления формируются новые дочерние клеточные ядра, в которых хромосомы прикрепляются к внутренней ядерной мембране с помощью теломер, что способствует расположению в ядре хромосом в строго определенной зоне (рис. 4.5). Помимо этого, теломерные районы предотвращают слипание разных хромосом своими концами и препятствуют образованию хромосом с двумя центромерами, наличие которых свидетельствует о патологии митоза. Теломеры стабилизируют хромосомы, защищая их от разрушения клеточными нуклеазами – ферментами, катализирующими гидролиз всех незащищенных ДНК. В последние годы стало известно еще одно назначение теломерных концов: благодаря им происходит полное завершение репликации ДНК при подготовке клетки к делению. Особую роль здесь играет фермент теломераза – она помогает завершить репликацию ДНК на отстающей цепи.

Рис. 4.5. Схематическое изображение расположения хромосомы в интерфазном ядре в G₁-периоде. Т – теломеры; Ц – центромера; Г – участки гетерохроматина; Э – участки эухроматина; М – внутренняя мембрана ядерной оболочки.

Теломерные районы, ограничивающие хроматиды с двух концов, содержат определенную последовательность нуклеотидов ТТАГГ, которая повторяется многократно – от 250 до 1500 раз. При помощи таких повторов учитывается количество делений, совершенных клеткой. Известно, что бесконечное количество делений могут совершать только трансформированные опухолевые клетки.

Каждая молекула ДНК в хроматиде гетерогенна по своему составу. В ней имеются участки с уникальной последовательностью азотистых оснований, которые несут информацию о большинстве белков клетки. В то же время в ней встречаются последовательности нуклеотидов, многократно повторяющиеся в геноме в составе этой же или других молекул ДНК. По количеству повторов в хромосомах такие последовательности подразделяют на два класса: умеренные и частые повторы. Первый класс – умеренно повторяющиеся последовательности с числом повторов от 100 до 10 000. На их долю приходится примерно четверть ДНК, и они могут представлять собой как блоки истинных генов, как например гены гистонов, так и структурные районы ДНК. К структурным районам, состоящим из умеренных повторов, относятся короткие последовательности, которые не кодируют белки. Они разбросаны по всем хромосомам, а их длина соответствует примерно 300 нуклеотидных пар. Второй класс – часто повторяющиеся последовательности, или сателлитные ДНК, число повторов которых на клетку превышает миллион раз. Это тоже нетранскрибируемые участки ДНК, на которых не идет образование РНК.

В работах разных авторов показано, что обычно лишь несколько процентов длины молекулы ДНК представлено уникальными последовательностями, представляющими структурные гены. В основном они распределены в составе длинных молекул ДНК между короткими умеренно повторяющимися последовательностями, длина которых не превышает 300 пар нуклеотидов. Многие из таких умеренных повторов имеют сходное строение. Вероятно, они выполняют структурные и регуляторные функции в составе генов. Умеренные повторы, представляющие гены, встречаются в каждой клетке, где есть ядро. Они содержат гены, необходимые всем клеткам в каждой фазе индивидуального развития. Это гены рибосомной РНК, гистонов и транспортной РНК.

Гены рибосомной РНК являются частью района ядрышкового организатора на хромосомах. Они кодируют рибосомные РНК, которые синтезируются в ядрышке. Образование рРНК – сложный процесс: из одной гигантской новосинтезированной молекулы образуются три разные молекулы рРНК меньшего размера, а избыточные последовательности удаляются. Зрелые рРНК участвуют в сборке субъединиц рибосом. Таким образом, ядрышко – это место ядра, где функционируют рибосомные гены, оно содержит совокупность всех рибосомных РНК, находящихся на разных стадиях образования, здесь происходит процесс формирования субъединиц рибосом. У человека район ядрышкового организатора расположен в коротких плечах акроцентрических пар хромосом с номерами 13, 14, 15, 21 и 22 (рис. 4.6). В формировании ядрышка могут принимать участие сразу несколько хромосом. Среднее число копий рибосомных генов в клетках человека, по данным разных авторов, – 416–443 на клетку, так что в районе ядрышкового организатора одной хроматиды расположены друг за другом одни и те же гены, повторяясь десятки раз. Такое расположение генов называется кластерным.

Рис. 4.6. Гаплоидный набор хромосом человека, где выделены районы организаторов ядрышка (по Албертс, Брей, Льюис и др., 1994).

К классу умеренно повторяющихся последовательностей у человека можно отнести также семейство многочисленных генов вариабельных участков иммуноглобулинов, играющих ключевую роль в иммунитете. Умеренные повторы обнаружены во всех хромосомах человека, где они локализованы по всей длине плеч.

Часто повторяющиеся последовательности занимают примерно десятую часть генома. Участки ДНК с такими повторами выявлены в определенных местах хромосом: это, прежде всего, околоцентромерные и теломерные районы. На дифференцированно окрашенных хромосомах они выявляются в виде конститутивного гетерохроматина, в котором не происходит транскрипция. Более того, конститутивный гетерохроматин может влиять на близко расположенные гены, подавляя их активность.

Часто повторяющиеся последовательности ДНК иначе называют сателлитной ДНК. У человека выделены и охарактеризованы индивидуальные сателлитные ДНК, расположенные в разных хромосомах. Так, известны несколько типов сателлитной ДНК из Y-хромосомы, 1-й, 9-й и 16-й хромосом. Функции сателлитной ДНК во многом остаются неизвестными. Предполагается, например, что сателлитная ДНК участвует в распознавании гомологичных хромосом во время конъюгации в мейозе, также рассматривается возможность регуляторного участия сателлитной ДНК в функционировании генов.

Таким образом, в составе одной молекулы ДНК, упакованной в одной хроматиде, вдоль ее длины встречаются уникальные гены, повторяющиеся гены и разнообразные структурные участки, не содержащие генов, повторяющиеся десятки и тысячи раз.

Вопросы

1. Что такое хромосомы? Какова их роль в митозе?

2. Что такое центромера? Каково ее значение в хромосоме?

3. Что такое теломеры? Какова их роль в хромосоме?

4. Что такое сестринские хроматиды и плечи хромосомы?

5. Сколько молекул ДНК содержит одна хроматида?

6. Различаются ли молекулы ДНК в двух сестринских хроматидах? Ответ следует обосновать.

7. Какую долю в последовательностях ДНК хромосом составляют уникальные гены?

8. Что вы знаете о последовательностях ДНК, называемых умеренными повторами?

9. Что такое сателлитная ДНК? Велика ли доля таких последовательностей в хромосомах? Какова их функция?

10. Что такое район ядрышкового организатора в хромосомах?

Кариотип

Каждому биологическому виду соответствует индивидуальный набор хромосом, который характеризуется числом, размерами и формой. Такой индивидуальный набор хромосом, характерный для конкретного биологического вида, называется кариотипом. Кариотип – это постоянный видовой признак, постоянство которого поддерживается закономерностями митоза и мейоза.

Описание кариотипа обычно проводится в метафазе митоза, когда хромосомы максимально спирализованы. Используя морфологические и морфометрические методы, с помощью компьютера описывается количество хромосом, каждой хромосоме подбирается пара, рассчитывается количественное соотношение размеров плеч хромосомы. Парные хромосомы располагаются друг за другом по мере уменьшения их размера. Однотипные по морфологии хромосомы объединяются в группы метацентрических, субметацентрических и акроцентрических хромосом.

Таким образом проанализированы кариотипы многих тысяч растений, животных и человека. Сравнительный анализ кариотипов используется в систематике, антропологии, судебной медицине.

В соматических клетках кариотип представлен диплоидным набором хромосом, то есть у каждой хромосомы есть пара. Такие парные хромосомы называются гомологичными. В гомологичных хромосомах в одних и тех же локусах расположены однотипные гены. Парность гомологичных хромосом связана с процессом оплодотворения, когда ядра половых клеток сливаются, и в каждой паре гомологичных хромосом одна хромосома имеет материнское происхождение, а другая – отцовское. Такое представление о диплоидном наборе хромосом и понятии «гомологичные хромосомы» соответствует хромосомной теории Т. Моргана.

В половой клетке, как и в любой клетке, образовавшейся в результате мейоза, содержится гаплоидный набор хромосом, по одной хромосоме из каждой пары.

Диплоидный набор хромосом обозначается 2n, гаплоидный – 1n. Например, диплоидный набор хромосом человека 46 (2n), гаплоидный – 23 (1n), по одной хромосоме из каждых 23 пар.

Анализ кариотипов мужских и женских особей большинства живых организмов показал, что их кариотипы различаются по одной паре хромосом. Такие хромосомы называются половыми. Набор хромосом, одинаковый для мужских и женских особей одного биологического вида, называется аутосомным набором, или просто аутосомами. Например, у человека 22 пары хромосом являются аутосомами, а одна пара хромосом – половыми хромосомами. У женщин половые хромосомы принято обозначать латинскими буквами XX, они достаточно крупные, метацентрические. У мужчин половые хромосомы ХY. Х-хромосома такая же, как и у женщин, то гда ка к Y – хромосома небольшая, акроцентрическая. Тем не менее Х и Y – хромосомы гомологичны между собой, у них есть гомологичные участки, которые содержат однотипные гены, определяющие не половые, а обычные соматические признаки.

Далее рассмотрим подробнее понятие «кариотип» на примере кариотипа человека.

Вопросы

1. Что такое кариотип?

2. Как вы думаете, будут ли отличаться кариотипы людей, проживающих в Африке и на севере Европы?

3. По каким параметрам характеризуется кариотип?

4. Что такое диплоидный набор хромосом? В каких клетках он встречается?

5. Что такое гаплоидный набор хромосом?

6. Что такое половые хромосомы?

7. Что такое гомологичные хромосомы?

Кариотип человека

Впервые митотические хромосомы человека были описаны в работах Дж. Арнольда (1879) и В. Флемминга (1882). В последующие годы различные оценки их количества давали результаты от 47 до 49 хромосом, причем у мужчин и женщин находили разное их число. Эти первые исследования проводились на гистологических срезах тестикул или яичников. В то время техника получения срезов была такова, что митозы в готовых препаратах были, как правило, разрушены, хромосомы накладывались одна на другую, образуя плохо поддающиеся анализу конфигурации. Эти трудности удалось преодолеть только к 50-м гг. XX в., когда для получения препаратов хромосом стали использовать суспензии клеток, выращенных в клеточных культурах. Так, первые препараты хромосом человека с хорошим разрешением были получены из клеток фибробластов эмбриона легкого, выращенных в клеточной культуре. Суспензии клеток промывали гипотоническим раствором, в результате чего клетки набухали и лопались, а хромосомы свободно распределялись на стекле. Позже этот способ был усовершенствован. Перед гипотоническим шоком на клетки воздействовали колхицином – веществом, которое, разрушая нити веретена деления, останавливает митоз на стадии метафазы, когда хромосомы наиболее легко идентифицировать. Этот прием позволил получить большое число клеток в метафазе митоза, а приготовленные таким образом препараты наиболее удобны для подсчета хромосом. Пользуясь подобным методическим подходом, в 1955 г. А. Леван и Дж. Тио, изучив 261 метафазную пластинку, пришли к выводу, что количество хромосом в клетках человека равно 46, причем как в мужских, так и в женских клетках. Эти результаты ознаменовали возникновение новой отрасли исследований – клинической цитогенетики. В настоящее время цитогенетика человека достигла высокого уровня и находится на переднем крае фундаментальной цитогенетики.

Препараты хромосом человека можно приготовить из любых тканей и клеточных суспензий, но лишь если в них содержатся делящиеся клетки, т. к. вне процесса деления (во время интерфазы) хромосомы деспирализуются и переходят в состояние хроматина. Чаще всего препараты готовят из клеток костного мозга, кратковременной культуры клеток крови или из перевиваемой культуры фибробластов. Наиболее прост и доступен метод культивирования клеток крови – лейкоцитов и лимфоцитов. Митозы в таких культурах стимулируют искусственно. Чтобы остановить жизненный цикл клеток в прометафазе, в них подавляют образование веретена деления при помощи веществ с колхициноподобными свойствами. Для свободного распределения хромосом на стекле клетки обрабатывают гипотоническим раствором, вызывая гипотонический шок. Затем препарат фиксируют смесью этанола и уксусной кислоты, высушивают и окрашивают.

Рис. 4.7. Кариотип человека, ×2500. 22 пары аутосом и половые хромосомы. Женщина имеет две идентичные хромосомы XX, у мужчин – две разные хромосомы XY.

Применяя стандартные методы, хромосомы окрашивают целиком, равномерно и интенсивно, после чего их систематизируют, нумеруя пары от 1 до 23, согласно Денверской классификации, принятой в 1960 г.

В кариотипе человека различают метацентрические, субметацентрические и акроцентрические хромосомы, размеры которых варьируют от 11 до 2,5 мкм. Учитывая относительную длину плеч, положение центромеры и центромерный индекс, который отражает процентное сооотношение длин короткого плеча и всей хромосомы, 23 пары хромосом человека подразделяют на 7 групп (рис. 4.7). В группу А (№ 1–3) входят пары наиболее крупных метацентрических аутосом. Группа В (№ 4–5) объединяет две пары субметацентрических хромосом, неразличимых между собой. Группа С (№ 6–12) содержит семь пар аутосом среднего размера. Размеры и форма этих хромосом неодинаковы, однако стандартные методы окрашивания не позволяют их идентифицировать. В группу D (№ 13–15) объединены три пары акроцентрических хромосом среднего размера, морфологически сходных между собой. Все хромосомы группы D содержат спутник, удлиненное тельце, отделенное от основной части хромосомы тонкой хроматиновой нитью. Спутник не всегда выявляется, может быть очень большим, а иногда и двойным. Длина короткого плеча этих хромосом также изменчива. К группе Е (№ 16–18) относятся три пары почти метацентрических хромосом, из которых в 16-й паре центромера наиболее близка к середине, а две другие пары неотличимы друг от друга. Группа F содержит мелкие метацентрические аутосомы (№ 19–20), группа G – мелкие акроцентрические (№ 21–22). Внутри групп F и G пары хромосом неразличимы. Длина коротких плеч у них изменчива, как и у хромосом группы D. Короткие плечи хромосом групп D и G содержат районы ядрышкового организатора. Перечисленные 22 пары хромосом относятся к аутосомам, одинаковым у мужчин и женщин.

Половые хромосомы составляют 23-ю пару. У женщин это две Х-хромосомы. У мужчин – Х– и Y-хромосомы. Половая Х-хромосома неотличима от аутосом группы С. При стандартном окрашивании она включается в состав этой группы: № 6–12 и Х. Мужская половая Y-хромосома является акроцентриче ской, сходна по морфологии с хромосомами группы G, но ее легко отличить по морфологическим критериям. Длина короткого плеча Y-хромосомы изменчива и индивидуальна, причем варианты длины плеча наследуются от отца к сыну. Y-хромосома, в отличие от хромосом последней группы, не имеет спутников. В интерфазных ядрах концевой участок длинного плеча Y-хромосомы можно обнаружить в составе хроматина, пользуясь специфическим окрашиванием акрихин-ипритом: в результате этот участок выявляется как яркое пятно диаметром 0,3–1,0 мкм.

Во многих хромосомах человека обнаружены ломкие (фрагильные) участки, подверженные хромосомным и хроматидным разрывам. Такие разрывы легко получить в клеточных культурах, удаляя фолиевую кислоту из питательной среды культивируемых клеток. В настоящее время показано, что одна из форм умственной отсталости человека связана с наличием определенного фрагильного участка в концевом районе длинного плеча Х-хромосомы.

Длина одной и той же хромосомы в разных фазах митоза различна, поскольку конденсация хромосом продолжается до конца метафазы. Кроме того, их конденсация значительно усиливается в присутствии применяемого для приготовления препаратов колхицина.

Современные цитогенетические методики позволяют идентифицировать по морфологии все пары хромосом на препарате, а в ряде случаев и хромосомы внутри одной пары. Суть этих методик состоит в дифференциальном окрашивании хромосом по длине, что обеспечивается сравнительно простыми температурно-солевыми воздействиями на фиксированные хромосомы или использованием специфических красителей. Дифференциальное окрашивание приводит к появлению линейного рисунка по длине хромосомы (рис. 4.8). В этом случае они выглядят состоящими из поперечно исчерченных, по-разному окрашенных сегментов. Каждой паре хромосом присущ индивидуальный рисунок исчерченности за счет неодинаковых размеров сегментов. В мелких хромосомах рисунок образуется единичными сегментами, в крупных хромосомах сегментов много. Общее для нормального хромосомного набора число окрашенных и неокрашенных сегментов в метафазе составляет около 400. В прометафазных хромосомах, которые не так сильно спирализованы, число сегментов больше – до 850 и более.

Разные типы сегментов получили обозначения G, Q, R, С, и T – по названиям методов, с помощью которых они выявляются. Так, С-сегменты связаны с выявлением конститутивного, или структурного, гетерохроматина. В разных хромосомах размер С-сегментов неодинаков, но они содержатся во всех хромосомах человека. Они находятся около центромер во всех хромосомах, а также в дистальной части длинного плеча Y-хромосомы, на длинных плечах 1, 9 и 16-й пар хромосом. Небольшие блоки структурного гетерохроматина выявляются в плечах 2-й пары и Х-хромосом. В акроцентрических хромосомах гетерохроматин С-сегментов расположен в коротких плечах. Накопленые сведения говорят, что в разных популяциях человека размеры сегментов гетерохроматина значительно различаются. Морфологические особенности сегментов наследуются по законам Менделя. Еще один тип сегментов – Т – выявляется также с помощью специфических методов окрашивания и присутствует в теломерных районах всех хромосом.

Рис. 4.8. Рисунок сегментации дифференциально окрашенных хромосом.

Индивидуальная совокупность разных сегментов, различающихся по ширине и интенсивности окрашивания, образует цитологическую карту каждой хромосомы. Основанные на дифференциальном окрашивании хромосом цитологические карты имеют исключительное значение для развития цитогенетики человека. С помощью этих карт стало реальным выяснить происхождение аномальных хромосом, вплоть до точного описания районов, вовлекаемых в ту или иную форму хромосомного нарушения. На международных совещаниях по номенклатуре в цитогенетике человека была разработана и введена в практику система обозначения сегментов нормальных хромосом и хромосом, подвергшихся тем или иным структурным перестройкам.

Дальнейшее совершенствование методов окрашивания хромосом позволило выявить до 1000 полос на всех 23-х хромосомах человека, характерных для гаплоидного набора. В среднем на хромосому при этом приходится 50 полос, хотя на некоторых хромосомах их можно обнаружить в несколько раз больше. Каждая полоса содержит в среднем от нескольких десятков до сотен генов.

Вопросы

1. Когда ученые описали кариотип человека? Какие методические подходы при этом использовались?

2. Что такое метацентрические, субметацентрические и акроцентрические хромосомы? Приведите примеры из кариотипа человека.

3. Дайте классификацию кариотипа человека согласно международным стандартам.

4. Что такое дифференциальное окрашивание хромосом? В чем его значение?