Текст книги "Физиология возбудимых тканей в опытах"

Вера Викторовна Грачева, Светлана Юрьевна Крыжановская, Андрей Федорович Якимовский
Физиология возбудимых тканей в опытах

© ООО «Издательство „СпецЛит“», 2016

Предисловие

Эксперимент – это важнейший способ изучения физиологии, он помогает осмыслению и запоминанию материала. Наиболее сложной, по мнению студентов, является физиология возбудимых тканей (нервной и мышечной). Трудно понять и без доказательств поверить, например, в то, что мембрана клетки является генератором электроэнергии.

На нашей кафедре студенты участвуют в постановке острых опытов на практическом занятии. Самостоятельно готовиться к их выполнению и сэкономить время занятий помогут содержащиеся в учебном пособии иллюстрированные фотографиями описания экспериментов. Кроме того, есть возможность наблюдать через систему дистанционного обучения эксперименты в снятых на кафедре видеофильмах (что важно в условиях сокращения аудиторных часов).

Однако студентам не всегда удается самостоятельно применить теоретические знания для объяснения полученных результатов. Часто возникают сложности с терминами, которые используются в описании классических опытов, таких как, например, «ток повреждения». Поэтому в учебное пособие включены ответы на наиболее часто встречающиеся вопросы и необходимые исторические аспекты. Пособие является дополнением к рекомендованному основному учебнику и уже изданным учебным пособиям по данной тематике.

Авторы пособия выражают благодарность за помощь в проведении съемок старшему лаборанту кафедры М. Н. Квет.

Опыт № 1, доказывающий существование мембранного потенциала (второй опыт Л. Гальвани)

Впервые опыт, который неопровержимо доказывает существование электричества в живых тканях, проведен итальянским врачом Луиджи Гальвани в конце XVIII в. Для проведения этого опыта из задней лапки лягушки подготавливают нервно-мышечный препарат, состоящий из икроножной мышцы, седалищного нерва и части позвоночника (рис. 1). На икроножной мышце делают надрез (рис. 2) и набрасывают на нее дистальный отрез седалищного нерва, при этом мышца сокращается. Нерв должен располагаться так, чтобы он касался и поврежденного, и неповрежденного участков мышцы (рис. 3). В опыте отсутствуют какие-либо источники тока, значит, живые ткани сами «производят» электричество.

Рис. 1. Препарат из задней лапки лягушки

Рис. 2. Надрез на мышце

Рис. 3. Нерв наброшен на мышцу (объяснение в тексте)

Этот опыт называют вторым опытом Гальвани, или опытом без металла, поскольку ему предшествовал первый вариант опыта, в котором сокращение происходит, когда лапки лягушки, подвешенные на медном крючке, прикасаются к железной пластинке. В этом случае цепь из разнородных металлов, разделенных раствором электролита, образует источник постоянного тока (гальванический элемент). Л. Гальвани потратил несколько лет, чтобы изменить опыт и доказать наличие «животного электричества». Естественно, научно объяснить это явление 200 лет назад было невозможно.

В 30-х гг. XIX в. Карло Маттеуччи повторил опыт своего учителя и с помощью гальванометра впервые определил, что поврежденный участок мембраны заряжен отрицательно, а неповрежденный – положи тельно (см. рис. 3), между ними возникает электрический ток, названный «током повреждения», или «током покоя». Тогда существовало ошибочное представление, что электричество в буквальном смысле «перетекает» с мышцы на нерв подобно току крови в сосудах.

Термины «возбуждение» и «возбудимость» были введены немецким физиологом Э. Дюбуа-Реймоном в середине XIX в. Он выяснил, что под воздействием раздражителя происходит возбуждение, тогда «ток покоя» уменьшается и меняет свое направление – появляется «ток действия». «Ток повреждения», возникающий во втором опыте Гальвани, следовательно, служит для нерва раздражителем.

Э. Ф. Пфлюгер, ученик Дюбуа-Реймона, сформулировал полярный закон, согласно которому при воздействии постоянного тока на ткань возбуждение возникает только при замыкании цепи (под катодом) и при размыкании (под анодом). Действительно, лапка сокращается только дважды: первый раз в момент набрасывания нерва на поврежденный и неповрежденный участки мышцы (замыкание цепи), второй – при снятии нерва с мышцы (размыкание), в промежутке между этими событиями сокращений не происходит. Угнетение возбудимости длительным действием катода постоянного тока открыл русский физиолог Б. Ф. Вериго, назвав ее катодической депрессией.

В середине ХХ в. появилась возможность изучения электрических процессов в отдельной нервной клетке. Для этой цели использовали гигантские аксоны кальмара, диаметр которых достигает 1 мм, что в 100 раз больше, чем у позвоночных животных. Это позволяет вводить внутрь волокна микроэлектроды, не разрушая его. На основе таких исследований английские физиологи А. Ходжкин, Э. Хаксли и Б. Катц сформулировали мембранно-ионную теорию биоэлектрогенеза. А в 70-е гг. прошлого века Э. Неером и Б. Сакманом внедрен метод изучения ионных токов через отдельный мембранный канал. Оказалось, что мембранный потенциал обусловлен разной концентрацией ионов внутри и снаружи клетки. А ток ионов происходит сквозь мембрану, значит, направлен поперек волокна, а не вдоль него. Под воздействием раздражителя открываются дополнительные катионные каналы в мембране, число перемещающихся ионов резко возрастает, что приводит к изменению полярности. Возникший потенциал действия создает электрическое поле, вызывающее возбуждение соседних участков (т. е. открытие каналов).

С современной точки зрения второй опыт Гальвани можно объяснить так. Под влиянием отрицательно заряженной поверхности происходит деполяризация мембран нервных волокон до критического уровня, открытие потенциалзависимых натриевых каналов, усиление входящего тока натрия, развитие потенциала действия. Потенциал действия распространяется по аксонам мотонейронов и передается через синапсы мышечным волокнам. Затем возбудимость нерва снижается, поскольку сохраняется деполяризация, вызывающая инактивацию натриевых каналов.

Под влиянием положительно заряженной поверхности полярность мембраны увеличивается (гиперполяризация). Длительная гиперполяризация приводит к увеличению числа готовых к открытию натриевых каналов, то есть смещению критического уровня деполяризации (КУД) в сторону отрицательных значений. Заряд мембраны при размыкании цепи восстановится мгновенно, тогда как для изменения КУД требуется время. Если КУД по абсолютной величине (модулю) под воздействием внешнего электрического поля станет больше исходного потенциала покоя мембраны, то при снятии нерва с мышцы произойдет возбуждение.

Опыт № 2. Физиологический реоскоп

Препарат из задней лапки лягушки (см. рис. 1) можно использовать в качестве устройства для регистрации электрического тока. Нервные волокна обладают высокой возбудимостью, значит, мышца препарата будет сокращаться под воздействием даже небольшого напряжения с той частотой, с которой подается переменный ток. Препарат в таком случае называют «живым», или «физиологическим», реоскопом (от греч. rheo – теку и skopeo – наблюдаю).

Эта идея возникла в середине XIX в. Альберт фон Кёлликер и Генрих Мюллер с помощью такого реоскопа обнаружили электрическую активность работающего сердца.

Для проведения опыта готовят нервно-мышечный препарат из лапки лягушки. У другой лягушки разрушают головной и спинной мозг, вскрывают грудную клетку и обнажают сердце. Нерв препарата набрасывают на обнаженное сердце вдоль его оси – на предсердия и желудочек, икроножная мышца сокращается при каждом сокращении сердца (рис. 4).

Рис. 4. Опыт «физиологический реоскоп»

Сердце без воздействия раздражителя генерирует потенциалы действия в определенном ритме. Сначала возбуждение распространяется по предсердиям. Поверхность их клеток меняет знак заряда на противоположный. Клетки желудочка в это время остаются невозбужденными. Возникает разность потенциалов между возбужденными (отрицательно заряженными) и невозбужденными (положительно заряженными) участками сердца. Появившееся напряжение служит раздражителем для нерва и вызывает развитие потенциала действия. Возбуждение распространяется по нерву и передается икроножной мышце. Сердце и мышца сокращаются в одном ритме.

Опыт № 3. Влияние новокаина на проводимость нерва

Важной вехой в развитии экспериментальной физиологии было изобретение прибора с вращающимся барабаном – кимографа. Использование графической записи для регистрации физиологических процессов (например, сердечных сокращений, дыхания, артериального давления) позволяет объективно оценивать, анализировать и сравнивать результаты уже после окончания эксперимента.

В данном опыте используют кимограф для регистрации амплитуды сокращений икроножной мышцы лягушки. Для этого подготавливают нервно-мышечный препарат. Под ахиллово сухожилие подводят нить, перевязывают и отрезают сухожилие дистальнее места перевязки. Бедренную кость фиксируют (винт 1 на рис. 5), нерв укладывают на электроды (2) влажной камеры, закрепленной на штативе (см. рис. 5). Нить, фиксирующую сухожилие, привязывают к миографу – рычагу, свободный конец которого оставляет чернильный след на барабане (рис. 6). При каждом сокращении мышцы миограф поднимается, при расслаблении – опускается, оставляя след на вращающемся барабане. Поскольку прибор с вращающимся барабаном называется кимографом, то полученную кривую можно назвать кимограммой. Ее называют также механограммой, поскольку график регистрирует механический процесс – изменение длины мышцы. Подключают электростимулятор (рис. 7), устанавливают частоту 1 импульс в секунду (1 Гц) и налаживают запись одиночных сокращений мышцы (рис. 8). Находят силу раздражения, необходимую для возбуждения максимального числа двигательных единиц, в этом случае амплитуда одиночных сокращений мышцы будет наибольшей.

Рис. 5. Бедренная кость фиксирована, нерв уложен на электроды

Рис. 6. Установка для записи сокращений

Рис. 7. Электростимулятор

Рис. 8. Запись одиночных сокращений мышцы

В канавку влажной камеры помещают ватный шарик, смоченный 2 % раствором новокаина. Через каждые 15 с после начала новокаинизации наносят одиночные стимулы на нерв, записывая сокращения мышцы. Амплитуда сокращений постепенно уменьшается (рис. 9). Механизм действия новокаина связан с блокированием потенциалзависимых натриевых каналов, что делает возбуждение невозможным (рис. 10).

Поскольку нервные волокна имеют разную толщину и плотность каналов в перехватах Ранвье, то и «выключаются» они не одновременно: сначала более тонкие, имеющие более низкий порог возбудимости, затем более толстые. Число двигательных единиц, отвечающих на раздражитель, постепенно уменьшается, амплитуда сокращений снижается и исчезает совсем (см. рис. 9, а). Отмывают новокаин физиологическим раствором хлорида натрия в течение 3 мин. Амплитуда сокращения постепенно начинает восстанавливаться (см. рис. 9, б). Это означает, что нарушение проводимости под влиянием новокаина обратимо.

Рис. 9. Механограмма эксперимента: а – изменение амплитуды сокращений под влиянием новокаина; б – изменение амплитуды сокращений после отмывки

Рис. 10. Механизм действия новокаина на мембрану аксона [6]

Опыт № 4. Одиночное и суммированное сокращение скелетной мышцы. Запись сокращений икроножной мышцы лягушки

Подготавливают нервно-мышечный препарат и установку для записи механограммы сокращений икроножной мышцы лягушки, как описано в предыдущем опыте. Подключают электростимулятор и налаживают запись одиночных сокращений мышцы (см. рис. 8). Одиночное сокращение возникает, когда каждый новый раздражитель подается после полного расслабления мышцы (рис. 11), то есть при одиночной или низкочастотной стимуляции нерва.

При увеличении частоты стимуляции произойдет суммация сокращений (тетанус). Каждое следующее сокращение в этом случае будет начинаться до окончания фазы расслабления мышцы (рис. 12). Кимограмма такого сокращения имеет «зубцы», поэтому тетанус называют зубчатым. Последовательно повышают частоту стимуляции нерва до 200 Гц. С повышением частоты стимуляции «зубцы» на графике уменьшаются и исчезают совсем, т. е. получается «гладкий» тетанус: каждый следующий стимул попадает на фазу укорочения мышцы (рис. 13).

Рис. 11. Кимограмма одиночных сокращений скелетной мышцы: фазы укорочения (а) и расслабления (б)

Рис. 12. Одиночные и суммированное сокращения скелетной мышцы

Рис. 13. Увеличение амплитуды тетануса

Рис. 14. Кимограмма сокращений икроножной мышцы лягушки при разной частоте стимуляции

С увеличением частоты стимуляции растет амплитуда тетануса. Это связано с одновременной работой всех мышечных волокон и длительным нахождением ионов кальция в саркоплазме, что позволяет инертным эластическим компонентам мышцы (соединительнотканным оболочкам, сухожилиям) полностью растянуться, а мышце стать значительно короче и выше поднять рычаг миографа. Максимальная амплитуда сокращения в данном опыте наблюдается при частоте 100 Гц (рис. 14). Такая частота называется оптимальной (оптимум). При частоте стимуляции 200 Гц амплитуда сокращения снижается (пессимум). При возвращении к оптимальной частоте амплитуда тетануса вновь растет, следовательно, снижение амплитуды сокращения не связано с утомлением.

Впервые понятие «оптимум» и «пессимум» ввел русский физиолог Николай Евгеньевич Введенский в конце XIX в. Наибольшую частоту раздражения возбудимой ткани, которую она воспроизводит, он называл мерой лабильности (функциональной подвижности). Он показал, что если раздражать мышцу с частотой 200–250 Гц не через нерв, а напрямую (рис. 15), то снижения амплитуды сокращений не происходит. Это означает, что мышца воспроизводит 200 потенциалов действия в секунду, частота стимуляции не превышает лабильность. Сам нерв имеет еще более высокую лабильность – 500 Гц и более. Следовательно, снижение амплитуды тетануса в опыте связано с превышением лабильности нервно-мышечного синапса и нарушением передачи возбуждения с нерва на мышцу. Сравнительно небольшое число импульсов (около 100 в 1 с), которое проводит мионевральный синапс, обусловлено временем, затраченным на разрушение медиатора, восстановление чувствительности холинорецепторов и способности к открытию хемозависимых каналов на постсинаптической мембране.

Рис. 15. Схема расположения электродов для непрямой (1) и прямой (2) стимуляции икроножной мышцы

Опыт № 5. Особенности гладкой мышцы. Запись сокращений гладкой мышцы клоаки лягушки

Чтобы выяснить особенности гладкой мышцы, необходимо провести миографию и сравнить полученную механограмму с графиками из предыдущего опыта. Для этого у лягушки разрушают головной и спинной мозг, вскрывают брюшную полость, перевязывают клоаку нитью, концы нити закрепляют на миографе. Налаживают запись механограммы. Электростимулятор не используют. Гладкая мышца сокращается без воздействия раздражителя (рис. 16). Эта особенность связана со способностью к спонтанной деполяризации мембраны некоторых клеток, что приводит к самопроизвольному возбуждению.

Напомним, что скелетная мышца возбуждается и сокращается только в ответ на стимуляцию. На механограмме видно, что фазы сокращения и расслабления гладкой мышцы развиваются намного медленнее, чем скелетной. Если резко растянуть клоаку, гладкая мышца ответит сильным сокращением (рис. 17). Это можно объяснить открытием в ответ на растяжение механозависимых кальциевых каналов мембраны (это тоже важное отличие от скелетной мышцы). Вошедший в клетку кальций, во-первых, способствует деполяризации, во-вторых, связываясь с белком кальмодулином, запускает сокращение.

Рис. 16. Запись спонтанных сокращений гладкой мышцы

При нанесении раствора ацетилхолина на кишку, частота и сила сокращений увеличиваются (рис. 18). Механизм такого действия известен. Ацетилхолин взаимодействует с М-холинорецепторами на мембране гладких миоцитов и через G-белок активирует фосфолипазу С, которая катализирует распад фосфолипидов с образованием вторичного посредника инозитолтрифосфата. Последний вызывает открытие кальциевых каналов на мембране гладкой эндоплазматической сети и выход кальция в цитоплазму.

На кишку наносят раствор адреналина. Сокращения прекращаются (рис. 19). Внутриклеточные механизмы этого эффекта до конца не изучены. Вероятно, адреналин через адренорецепторы, G-белки и вторичные посредники приводит к снижению концентрации кальция в цитоплазме.

Таким образом, из опыта видно, что гладкая мышца имеет существенные особенности (в сравнении со скелетной мышцей). Она не нуждается в стимуляции для начала сокращения; она отвечает сокращением на растяжение; медиаторы оказывают корригирующее влияние на ее функцию.

Рис. 17. Сокращение гладкой мышцы на резкое растяжение

Рис. 18. Механограмма сокращений гладкой мышцы клоаки лягушки под влиянием ацетилхолина

Рис. 19. Влияние адреналина на сокращения гладкой мышцы (верхняя кривая)

Опыт № 6. Автоматия миокарда. Анализ создающей и проводящей Возбуждение системы сердца лягушки (лигатуры Станниуса)

В опыте «физиологический реоскоп» уже было показано, что сердце возбуждается и сокращается ритмично. Немецкий физиолог Г. Ф. Станниус в середине XIX в. с помощью наложения лигатур на изолированное сердце лягушки доказал наличие в нем участков, обладающих автоматией. Это позволяет сердечной мышце сокращаться самопроизвольно, без каких-либо раздражителей.

С помощью лигатур Станниуса можно также продемонстрировать направление распространения возбуждения в сердце. В эксперименте для регистрации сердечных сокращений используют кимограф.

Рис. 20. Отделы сердца лягушки

У лягушки разрушают головной и спинной мозг, вскрывают грудную клетку, обнажают сердце и захватывают его серфином (рис. 20). При внимательном наблюдении видно, что отделы сердца сокращаются последовательно: венозный синус, предсердия, желудочек. Налаживают запись механокардиограммы: при каждом сокращении сердца самописец поднимается, при расслаблении – опускается, оставляя след на вращающемся барабане (рис. 21).

По частоте и амплитуде зубцов можно судить о частоте и силе сокращений сердца. Накладывают первую лигатуру Станниуса: делают из концов нитки петлю, располагают ее точно на границе между венозным синусом и предсердием и постепенно туго ее затягивают (рис. 22).

Наложенная таким образом лигатура прекращает проведение возбуждения от синуса к пред сердиям. Предсердия и желудочек перестают сокращаться. Через 7—10 мин может произойти самостоятельное восстановление автоматической деятельности сердца, но в более редком ритме.

Можно заставить сердце восстановить свою автоматическую деятельность путем наложения второй лигатуры Станниуса (рис. 23).

Рис. 21. Запись механокардиограммы

Рис. 22. Схема эксперимента [9]

Рис. 23. Сердце лягушки с двумя лигатурами

Вторая лигатура накладывается строго по атриовентрикулярной линии (см. рис. 22, 23), механически раздражает атриовентрикулярный узел и побуждает его к автоматической деятельности, в силу чего желудочек начинает сокращаться (рис. 24).

Венозный синус сокращается в исходном (синусовом) ритме; желудочек сокращается в своем, более редком ритме (см. рис. 24). Таким образом, опыт показывает, что главный водитель ритма сердца лягушки расположен в венозном синусе. Отсюда возбуждение распространяется сначала по предсердиям, затем по желудочку. На границе предсердий и желудочка расположен еще один латентный водитель ритма, который способен генерировать потенциалы действия, но реже, чем синусный узел. В норме этот узел автоматию не проявляет, т. к. синусовый узел «навязывает» ему свой ритм.

Были и другие эксперименты, доказывающие наличие центров автоматии в миокарде. Так, примерно в то же время, что и Г. Ф. Станниус, английский физиолог В. Гаскелл показал, что охлаждение небольшой зоны в области устья полых вен приводит к остановке сердца. В 1902 г. русский физиолог Алексей Александрович Кулябко впервые в мире «оживил» сердце человека, извлеченное из трупа через 20 ч после смерти. Для этого он пропускал питательный раствор через сосуды изолированного сердца. Сокращения поддерживались более 1 ч.

Рис. 24. Механокардиограмма разных этапов опыта Станниуса

Опыт № 7. Рефрактерность миокарда. Получение экстрасистолы и компенсаторной паузы сердца лягушки

В настоящее время известно, что автоматией обладают разные участки проводящей системы сердца. В норме активность проявляет только синусовый узел, он является водителем ритма. В некоторых случаях импульсы могут возникать и в других участках проводящей системы (например, в ножках пучка Гиса). Возникает вопрос: что изменится в работе сердца, если будут одновременно активны несколько очагов возбуждения?

Это можно проверить в опыте. В качестве дополнительного источника импульсов используют электростимулятор. Концы электродов подводят к основанию желудочка сердца так, чтобы желудочек находился между электродами и касался их, как показано на рис. 20. Налаживают запись механокардиограммы. Раздражают сердце одиночными импульсами, нанося их в различные моменты систолы желудочка. Раздражение во время систолы не меняет нормальной сократительной деятельности сердца. В отличие от других видов мышечной ткани, сокращения сердца не суммируются, тетанус получить не удается (рис. 25). Объясняется такая особенность миокарда длительным рефрактерным периодом, который продолжается всю систолу. Натриевые каналы инактивированы, поэтому вызвать возбуждение в этот период нельзя.

В сердечной мышце рефрактерность продолжается около 300 мс, столько же длится и сокращение. В опыте 4 было показано, что в скелетной мышце тетанус возможен. Рефрактерный период у нее длится примерно 10 мс, что существенно меньше, чем сокращение (около 100 мс), поэтому скелетная мышца отвечает на стимулы, попадающие в фазу ее укорочения (см. рис. 12, 13). Следовательно, невозможность тетануса – это отличие сердечной мышечной ткани.

Раздражение сердца во время диастолы вызывает внеочередное сокращение – экстрасистолу (см. рис. 25, 26). После экстрасистолы диастола длится дольше обычного – наблюдается так называемая компенсаторная пауза. Ее происхождение предположительно можно объяснить так. Импульс, вызвавший экстрасистолу, не меняет работу синусового узла. Очередной потенциал действия, генерированный главным водителем ритма после начала экстрасистолы, не может вызвать возбуждения желудочка, т. к. его миокард невозбудим во время сокращения. Получается, очередная систола как будто «выпадает». После экстрасистолы желудочек «ждет» следующего импульса.

Рис. 25. Запись механокардиограммы (стрелка указывает на экстрасистолу) 24

Рис. 26. Механокардиограмма эксперимента: стрелками показаны экстрасистолы

Длительный период рефрактерности имеет важнейшее значение в работе сердца. Он препятствует повторному прохождению импульса по проводящей системе (циркуляции возбуждения). Кроме того, всегда сохраняется резерв времени, необходимый для расслабления и наполнения камер кровью.