Текст книги "Полный курс за 3 дня. Микробиология"

Тема 9. Генная инженерия и область ее применения в биотехнологии

1. Понятие и сущность генной инженерии

Основой биотехнологии является генная инженерия, которая по существу сводится к генетической рекомбинации (т. е. обмену генами между двумя хромосомами), приводящей к возникновению клеток или организмов с двумя и более наследственными детерминантами (генами), по которым родители различались между собой. Метод рекомбинации заключается в:

1) выделении ДНК из разных видов организмов или клеток;

2) получении гибридных молекул ДНК;

3) введении рекомбинантных (гибридных) молекул в живые клетки;

4) создании условий для экспрессии и секреции продуктов, кодируемых генами.

Гены, кодирующие те или иные структуры, выделяются из хромосом или плазмид, прицельно выщепляются из этих генетических образований с помощью ферментов рестрикции или синтезируются химически. Набор ферментов, способных резать ДНК по определенным связям, является важным инструментом генетической инженерии. В последнее время обнаружены ферменты, расщепляющие по определенным связям РНК наподобие рестрикции ДНК, поэтому их называют рибозимами, но их роль пока до конца не изучена.

С помощью химического синтеза могут быть получены сравнительно небольшие гены. Для этого вначале расшифровывают число и последовательность аминокислот в белковой молекуле вещества и по этим данным узнают очередность нуклеотидов в гене, так как каждой аминокислоте соответствуют три нуклеотида. С помощью синтезатора химическим путем создают ген, аналогичный природному гену.

Полученный таким образом целевой ген сшивают с другим геном с помощью ферментов лигаз. В дальнейшем он используется в качестве вектора для встраивания гибридного гена в клетку. В качестве вектора могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы человека, животных и растений.

Количество плазмид в бактериальной клетке может колебаться от одной до нескольких сотен и зависит от размера плазмиды: чем большие размеры она имеет, тем меньше ее копий в клетке. С помощью ампфликации генов (увеличения числа копий определенного гена в клетке) можно резко повысить производство кодируемого вещества клеткой.

Бактериофаг как вектор используется аналогично. Целевой ген встраивается в геном фага, реплицируется вместе с генами вируса при размножении последнего в бактериальной клетке. Чаще всего используется фаг ламбда, содержащий ДНК из 50 000 пар нуклеотидов. Его преимущество перед плазмидами заключается в том, что фаговый вектор позволяет клонировать большие фрагменты чужеродной ДНК.

В случае использования в качестве векторов вирусов человека, животных и растений чужеродный ген встраивают в ДНК вируса. Он реплицируется вместе с размножением последнего в клетке.

Применяют в качестве вектора и космиды – гибрид плазмиды с фагом, использующийся для клонирования больших фрагментов ДНК эукариот.

Для РНК-содержащих вирусов передача генетической информации возможна с помощью ревертазы, передающей информацию о структуре белка от РНК к ДНК, являющейся комплементарной РНК.

Получение рекомбинантных молекул ДНК и рекомбинантных бактерий сводится к тому, что экспрессируемый ген в виде рекомбинантной ДНК встраивается в бактериальную или животную клетку, приобретающую новое свойство – способность продуцировать несвойственное этой клетке вещество, кодируемое экспрессируемым геном. Для лучшего проникновения вектора через стенку бактерий иногда прибегают к воздействию на стенку (например, хлоридом кальция), чтобы увеличить ее проницаемость.

В качестве реципиентов экспрессируемого гена чаще всего используют Е. coli, В. subtilis, псевдомонады, дрожжи, вирусы с учетом возможности встройки чужеродного гена, а также уровня выраженности (экспрессии) синтеза вещества, кодируемого геном, возможности его секреции в окружающую среду, легкости и доступности массового культивирования, экологической безопасности. Некоторые штаммы рекомбинантных бактерий способны переключать на синтез чужеродного вещества, экспрессируемого геном, до 50 % своего синтетического потенциала, поэтому они нашли применение в биотехнологической промышленности и называются промышленными штаммами.

Некоторые штаммы микроорганизмов хорошо экспрессируют чужеродные гены, но плохо секретируют продукт в окружающую среду. В таких случаях применяют дезинтеграцию, или разрушение, клетки с целью высвобождения из нее синтезированного продукта.

В некоторых случаях, несмотря на наличие экспрессии и секреции, продукт не удается получить из-за разрушения в процессе синтеза или после него протеазами и другими ингибиторами.

С целью повышения уровня секреции целевого белка к гену целевого белка присоединяют ген белка, хорошо секретируемого клеткой рецепиента. В результате образованный химерный белок, хорошо секретируемый клеткой, собирают и от него отщепляют целевой белок. Также возможно присоединение гениндикатора к гену целевого белка, в результате чего получают химерный индикаторный белок, а из него – целевой белок.

2. Биологические препараты, полученные методом генной инженерии

Несмотря на то что методом генной инженерии получена не одна сотня препаратов, в практику внедрена только часть: интерфероны, интерлейкины, фактор VIII, инсулин, гормон роста, тканевый активатор плазминогена, вакцина против гепатита В, моноклональные антитела для предупреждения отторжения при пересадках почки, диагностические препараты для выявления ВИЧ и др. Это обусловлено несколькими факторами.

1. Невозможность управлять распространением экологически опасных рекомбинантных микроорганизмов, хотя в последнее время эти опасения отвергнуты;

2. Использование рекомбинантных штаммов продуцентов предусматривает разработку сложных технологических процессов по получению и выделению целевых продуктов, на которую уходит значительное количество времени, а также средств.

3. При получении препаратов методом геннной инженерии требуется проведение исследовательских работ, направленных на доказательство идентичности, а также иногда – решение дополнительных задач по приданию продукту природного характера.

Медицинскими препаратами, разрабатываемыми методами современной биотехнологии, являются антикоагулянты и тромболитики – тканевые активаторы плазминогена, фиксаторы VIII и IX; колониестимулирующие факторы – соматомедин С, гранулоцитный и макрофагальный колониестимулирующие факторы; иммуноцитокины – интерфероны, интерлейкины, фактор некроза опухолей, пептиды вилочковой железы и иные; гормоны – гормоны роста, инсулин, эритропоэтин; вакцины против ВИЧ-инфекции, малярии, гепатита В и иные; ферменты – липаза, протеазы; рецепторы – Т-4 лимфоцитов и др.; моноклональные антитела для иммунотерапии опухолей, предупреждения реакций отторжения; диагностикумы для выявления ВИЧ-инфекции, сифилиса, гепатита В и др.

Метод генной инженерии является одним из самых перспективных при получении многих белковых биологических веществ, представляющих ценность для медицины. В области создания биологически активных веществ медицинского назначения с помощью данного метода создаются препараты второго поколения, являющиеся аналогами природных веществ, обладающими большей эффективностью действия.

При определении целесообразности и экономичности методов генной инженерии для получения медицинских или других препаратов учитываются:

1) доступность;

2) экономичность;

3) качество получаемого препарата;

4) новизна;

5) безопасность проведения работ и др.

Положительные стороны метода генной инженерии перед остальными заключаются в следующем.

1. Природный микроорганизм или животные и растительные клетки не культивируются в промышленных условиях. С целью получения диагностических препаратов или вакцин прибегают к клонированию или синтезу генов протективных антигенов, их встраиванию в легко культивируемые бактерии. При выращивании этих рекомбинантных бактерий-рецепиентов получают нужные антигены, являющиеся основой для создания диагностического препарата или вакцины.

2. Микроорганизм высоко патогенен и опасен при промышленном производстве. Так, для получения ВИЧ-диагностических препаратов и вакцин необходимые антигены получают методом генной инженерии.

3. Исходное сырье для получения препарата традиционным способом является дефицитным или дорогостоящим.

4. Метод активно используется для получения принципиально новых продуктов и препаратов, не существующих в природе. Например, только с помощью генной инженерии можно получить рекомбинантные поливалентные живые вакцины, несущие антигены нескольких микроорганизмов.

5. Метод позволяет заменить многие методы, основанные на получении продуктов in vivo, на способы получения этих продуктов in vitro. Так, если ранее диагностические, лечебные и профилактические сыворотки получали из крови иммунизированных лошадей или вакцинированных людей-доноров, то в настоящее время предпочтение отдается гибридомной технике получения антител, основанной на получении клеток-гибридов путем слияния В-лимфоцитов, взятых от иммунизированных животных, и миеломных (раковых) клеток, способных быстро размножаться на искусственных питательных средах и продуцировать при этом антитела к антигену, использованному для иммунизации.

6. Метод позволяет получать многие фармакологические вещества путем выращивания в промышленных условиях культур клеток лекарственных растений.

Тема 10. Антибиотики и химиотерапия

1. Химиотерапевтические препараты

Химиотерапия – лечение инфекционных и опухолевых заболеваний химическими препаратами, не являющимися продуктами реакции организма на возбудителя.

Химиотерапевтические препараты – это лекарственные вещества, используемые для подавления жизнедеятельности и уничтожения микроорганизмов в тканях и средах больного, обладающие избирательным, этиотропным (действующим на причину) действием.

Химиопрепараты должны обладать такими качествами, как:

1) хорошее растворение в воде, что обеспечивает доставку лекарственного вещества во внутреннюю среду организма. Малорастворимые или нерастворимые вещества пригодны только для местного применения, для внутреннего применения используются их соответствующие производные;

2) достаточная стабильность во внутренней среде организма при отсутствии кумулятивного эффекта (способности накапливаться в макроорганизме);

3) безвредность. Хотя любой химиотерапевтический препарат в той или иной мере оказывает побочное действие на организм человека, оно должно быть по возможности минимальным, а способность вызывать образование отклонений в развитии мутации по возможности должны отсутствовать.

Безвредность оценивается химиотерапевтическим индексом – отношением минимальной терапевтической дозы препарата к максимально переносимой. Следовательно, чем меньше показатель, тем лучше препарат. Индекс препарата, приближающийся к 1, свидетельствует о том, что данное вещество не может быть использовано как средство химиотерапии.

По направленности действия химиотерапевтические препараты делят на:

1) противопротозойные;

2) противогрибковые;

3) противовирусные;

4) антибактериальные. При этом в связи с особенностями возбудителей среди антибактериальных препаратов отдельно выделяются противотуберкулезные (антимикобактериальные) и противосифилитические средства.

Химиотерапевтические препараты делятся по способности накапливаться в тех или иных органах. Например, цитостатики накапливаются в опухолевых клетках, тем самым подавляя их рост; уросептики накапливаются в моче, подавляя развитие возбудителей инфекций почек и мочевыводящих путей.

По химическому строению выделяют несколько групп химиотерапевтических препаратов:

1) сульфаниламидные препараты (сульфаниламиды) – производные сульфаниловой кислоты. Они нарушают процесс получения микробами необходимых для их жизни и развития ростовых факторов – фолиевой кислоты и других веществ. К этой группе относят стрептоцид, норсульфазол, сульфаметизол, сульфометаксазол и др.;

2) производные нитрофурана. Механизм действия состоит в блокировании нескольких ферментных систем микробной клетки. К ним относят фурациллин, фурагин, фуразолидон, нитрофуразон и др.;

3) хинолоны. Нарушают различные этапы синтеза ДНК микробной клетки. К ним относят налидиксовую кислоту, циноксацин, норфлоксацин, ципрофлоксацин;

4) азолы – производные имидазола. Обладают противогрибковой активностью. Ингибируют биосинтез стероидов, что приводит к повреждению наружной клеточной мембраны грибов и повышению ее проницаемости. К ним относят клортимазол, кетоконазол, флуконазол и др.;

5) диаминопиримидины. Нарушают метаболизм микробной клетки. К ним относят триметоприм, пириметамин;

6) антибиотики – это группа соединений природного происхождения или их синтетических аналогов.

Принципы классификации антибиотиков

I. По механизму действия:

1) нарушающие синтез микробной стенки (β-лактамные антибиотики; циклосерин; ванкомицин, тейкоплакин);

2) нарушающие функции цитоплазматической мембраны (циклические полипептиды, полиеновые антибиотики);

3) нарушающие синтез белков и нуклеиновых кислот (группа левомицетина, тетрациклина, макролиды, линкозамиды, аминогликозиды, фузидин, анзамицины).

II. По типу действия на микроорганизмы:

1) антибиотики с бактерицидным действием (влияющие на клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану);

2) антибиотики с бактериостатическим действием (влияющие на синтез макромолекул).

III. По спектру действия:

1) с преимущественным действием на грамположительные микроорганизмы (линкозамиды, биосинтетические пенициллины, ванкомицин);

2) с преимущественным действием на грамотрицательные микроорганизмы (монобактамы, циклические полипептиды);

3) широкого спектра действия (аминогликозиды, левомицетин, тетрациклины, цефалоспорины).

IV. По химическому строению:

1) β-лактамные антибиотики:

а) пенициллины, среди которых выделяют природные (аминипенициллин) и полусинтетические (оксациллин);

б) цефалоспорины (цепорин, цефазолин, цефотаксим);

в) монобактамы (примбактам);

г) карбапенемы (имипинем, меропинем);

2) аминогликозиды (канамицин, неомицин);

3) тетрациклины (тетрациклин, метациклин);

4) макролиды (эритромицин, азитромицин);

5) линкозамины (линкомицин, клиндамицин);

6) полиены (амфотерицин, нистатин);

7) гликопептиды (ванкомицин, тейкоплакин);

8) полипептиды (грамицидин, полимиксин М и В);

9) антрациклиновые антибиотики (к ним относятся противоопухолевые антибиотики – доксорубицин, карминомицин, рубомицин, акларубицин).

2. Основные осложнения химиотерапии

Все осложнения химиотерапии можно разделить на две группы: осложнения со стороны макроорганизма и со стороны микроорганизма.

Осложнения со стороны макроорганизма

Осложнения со стороны макроорганизма следующие.

1. Аллергические реакции наблюдаются в 10 % случаев и характеризуются появлением сыпи, зуда, крапивницы и др. Степень выраженности может быть различной – от легких форм до анафилактического шока. Наличие аллергии на один из препаратов группы является противопоказанием для использования и других препаратов этой группы, так как возможна перекрестная чувствительность.

2. Прямое токсическое действие зависит от свойств препарата, его дозы, способа введения и состояния больного. Наиболее частым побочным действием этой группы является поражение печени. Подобным действием обладают тетрациклины, при этом они нарушают формирование костной ткани и зубов. Прием аминогликозидов приводит к поражению печени и почек, что связано с их обезвреживающей и выделительной функциями. Кроме этого, аминогликозиды могут вызывать необратимое поражение слухового нерва. Левомицетин может поражать органы кроветворения, а также оказывает эмбриотоксическое действие. Ципрофлоксацин может оказывать нейротоксическое действие, фторхинолоны – вызывать артропатии. Наименее токсичным является пенициллин, но при его длительном использовании возможно поражение центральной нервной системы.

3. Побочные токсические эффекты. Эти осложнения связаны не с прямым, а с опосредованным действием на различные системы организма. Антибиотики, действующие на синтез белка и нуклеиновый обмен, всегда угнетают иммунную систему. Хлорамфеникол может подавлять синтез белков в клетках костного мозга, вызывая лимфопению. Фурагин, проникая через плаценту, может вызывать гемолитическую анемию плода.

4. Реакции обострения. При применении химиотерапевтических средств в первые дни заболевания может происходить массовая гибель возбудителей, сопровождающаяся освобождением большого количества эндотоксина и других продуктов распада. Это может сопровождаться ухудшением состояния вплоть до токсического шока. Такие реакции чаще бывают у детей. Поэтому антибиотикотерапия должна сочетаться с дезинтоксикационными мероприятиями.

5. Развитие дисбиоза. Он чаще возникает на фоне применения антибиотиков широкого спектра действия. Предупредить развитие этого вида осложнений невозможно, но реально свести до минимума его последствия. С этой целью рекомендуется использовать антибиотики узкого спектра действия; параллельно антибактериальным антибиотикам назначать противогрибковые препараты; применять эубиотики для восстановления нормальной микрофлоры.

Осложнения со стороны микроорганизма

Проявляются развитием лекарственной устойчивости. В ее основе лежат мутации хромосомных генов или приобретение плазмид устойчивости. Существуют роды микроорганизмов, обладающие природной устойчивостью.

Биохимическую основу устойчивости обеспечивают следующие механизмы:

1) энзиматическая инактивация антибиотиков. Этот процесс обеспечивается с помощью синтезируемых бактериями ферментов, разрушающих активную часть антибиотиков;

2) изменение проницаемости клеточной стенки для антибиотика или подавление его транспорта в бактериальные клетки;

3) изменение структуры компонентов микробной клетки.

Развитие того или иного механизма резистентности зависит от химической структуры антибиотика и свойств бактерий.

Методы борьбы с лекарственной устойчивостью:

1) поиск и создание новых химиотерапевтических препаратов;

2) создание комбинированных препаратов, которые включают в себя химиотерапевтические средства различных групп, усиливающих действие друг друга;

3) периодическая смена антибиотиков;

4) соблюдение основных принципов рациональной химиотерапии.

3. Принципы рациональной химиотерапии

Принципы рациональной химиотерапии состоят в следующем.

1. Микробиологический принцип – назначение лекарственных препаратов строго по показаниям, т. е. только в тех случаях, когда без них нельзя обойтись, с учетом противопоказаний (например, повышенной чувствительности или аллергической реакции к препаратам той или иной группы).

Выбор препарата для химиотерапии может проводиться в различных вариантах возникающих ситуаций.

При этиологически расшифрованных заболеваниях выбор препарата должен определяться с учетом чувствительности возбудителя (антибиотикограмма), выделенного от данного конкретного больного в результате бактериологического исследования.

При выделении возбудителя, но без определения его чувствительности к химиотерапевтическим препаратам, или при эмпирической инициальной химиотерапии заболевания с неидентифицированным, но предполагаемым возбудителем выбор препарата для химиотерапии должен основываться на показателях антибиотикочувствительности соответствующих микроорганизмов (наиболее вероятных возбудителей данной нозологической формы заболевания) по данным литературы или при ориентации на данные о региональной чувствительности тех или иных инфекционных агентов-возбудителей данного заболевания.

2. Фармакологический принцип. При выборе препарата необходимо учитывать данные его фармакокинетики.

Лечение должно проводиться строго по схеме, рекомендованной для выбранного химиопрепарата (способ и кратность введения препаратов, длительность лечения) с учетом коэффициента увеличения концентрации препарата в целях создания эффективных концентраций препарата непосредственно в органах и тканях (примерно 4 МПК – минимальная подавляющая концентрация, определенная по возможности методом серийных разведений).

Длительность приема химиопрепаратов должна составлять как минимум 2–3 дня – в целях профилактики формирования устойчивых к данному препарату штаммов возбудителей, а также формирования бактерионосительства.

При дерматомикозах, кандидозе и трихомониазе влагалища с целью предупреждения рецидивов лечение продолжают в течение 2–4 недель после исчезновения симптомов заболевания.

3. Принцип иммунохимиотерапии. Химиотерапию желательно проводить с помощью средств, способствующих повышению активности защитных механизмов макроорганизма.

Весьма эффективны при проведении химиотерапии комбинации препаратов с различными механизмами и спектром действия.

Однако при комбинированном применении препаратов необходимо учитывать несколько факторов:

1) лекарственную совместимость предполагаемых к совместному использованию химиопрепаратов;

2) возможность того, что препараты, содержащие одно и то же вещество в качестве активного действующего начала, могут носить различные торговые названия, так как выпускаются разными фирмами и могут быть дженериками (препаратами, производимыми по лицензии с оригинала) одного и того же химиопрепарата;

3) комбинированное применение антибиотиков повышает риск развития дисбаланса нормальной микрофлоры.

4. Клинический принцип. При назначении препаратов следует учитывать общее состояние больного, возраст, пол, состояние иммунной системы, сопутствующие заболевания, а также наличие беременности.

5. Эпидемиологический принцип. Подбирая химиопрепарат, необходимо учитывать, к каким лекарственным препаратам микроорганизмы устойчивы в среде, в которой находится больной. Распространенность устойчивости к данному препарату не остается постоянной и изменяется в зависимости от того, насколько широко используется препарат.

6. Фармацевтический принцип. Необходимо учитывать срок годности и условия хранения препарата, поскольку при истечении срока годности и несоблюдении правил хранения в нем образуются токсичные продукты деградации.