Текст книги "Основы общей и экологической токсикологии"

4.5. Метаболизм органических экотоксикантов

Метаболизм — полная совокупность катализируемых ферментами превращений органических молекул в организме. Метаболиты — вещества, образующиеся в катализируемых ферментами процессах метаболизма.

Термин «фермент» (лат. fermentum – бродило, закваска) был предложен голландским ученым Ван-Гельмонтом в начале XVII в. Так он назвал неизвестный агент, принимающий активное участие в процессе спиртового брожения. В настоящее время термины «энзим» и «фермент» рассматриваются как синонимы. В отечественной литературе принят термин «фермент». На сегодняшний день известно более 2000 ферментов.

Ферменты – это специфические белки, выполняющие в организме роль биологических катализаторов. Как известно, белки являются азотистыми, высокомолекулярными соединениями, построенными из аминокислот. В состав белков входят следующие основные элементы: углерод (50 – 55 %), водород (6 – 7 %), азот (15 – 18 %), кислород (21 – 23 %) и сера (0,25 – 2,5 %).

Любая аминокислота содержит по крайней мере две функциональные группы (карбоксильную группу ( – СООН) и аминогруппу ( – NH₂)) и имеет следующую структурную формулу:

где R – органическая группа или радикал.

Основное различие между отдельными аминокислотами заключается в природе радикала (R – ).

Для обозначения фермента к названию катализируемой реакции прибавляют суффикс «-аза»: дегидрогеназа — катализатор отщепления водорода; монооксидаза — катализатор внедрения в молекулу субстрата одного атома кислорода; метилтрансфераза — катализатор переноса метильной группы; эстеразы — катализаторы реакций гидролиза сложных эфиров; и т. д. Биологические катализаторы – ферменты значительно эффективнее неорганических катализаторов. Скорость ферментативных реакций обычно в 10⁸– 10¹¹ раз выше скорости соответствующих неферментативных процессов.

Известно, что пероксид водорода (Н₂О₂) может самопроизвольно распадаться на воду и кислород:

Этот процесс протекает крайне медленно и на глаз незаметен. Однако он идет, и с течением времени пероксид водорода становится все более и более слабым.

В присутствии неорганического катализатора – железа или платины – скорость распада пероксида водорода увеличивается в тысячи раз, а при добавлении фермента каталазы – в миллиарды раз. Одна единственная молекула каталазы за одну минуту может расщепить до пяти миллионов молекул пероксида водорода.

Каталаза широко представлена в различных органах и тканях. Много каталазы в эритроцитах. Всем хорошо известно, что если на небольшую ссадину или рану полить пероксид водорода, то бурно идет реакция разложения пероксида водорода и образуется огромное количество пузырьков кислорода, отчего жидкость как бы белеет. В данном случае пероксид водорода используют как антисептик, так как кислород, освобождающийся при разложении пероксида водорода, весьма активен в химическом отношении.

Химические реакции с участием энзимов (ферментов) протекают с очень небольшими затратами энергии. Они могут приводить как к детоксикации ксенобиотиков, так и к образованию метаболитов с более высокой токсичностью (в последнем случае говорят об активации).

В случае органических соединений возможны три типа превращений под действием ферментов: полная минерализация до СО₂ и Н₂О без образования на промежуточных стадиях персистентных (устойчивых) и биологически активных соединений (при этом происходит увеличение биомассы организмов, участвующих в минерализации); разрушение ксенобиотиков до низкомолекулярных соединений, которые затем выделяются в окружающую среду и включаются в природный круговорот веществ; химическая трансформация с накоплением метаболитов в клетках организма.

Живые организмы, за исключением некоторых видов бактерий, не имеют специфических ферментов для преобразования ксенобиотиков.

Здесь уместно напомнить третий закон экологии, сформулированный известным американским экологом Барри Коммонером: «природа знает лучше» (Коммонер Б., 1974). Дело в том, что вариации химических веществ, действительно имеющие место в живой материи, намного более ограничены, чем возможные вариации. Яркая иллюстрация: если сделать по одной молекуле всех возможных типов белка, то суммарная их масса превысит массу всей известной вселенной. Очевидно, что фантастически огромное количество видов белка были однажды созданы отдельными живыми организмами, но оказались вредными и исчезли ввиду гибели экспериментального организма. По той же причине живые клетки синтезируют жирные кислоты (тип органической молекулы, которая состоит из цепочек атомов углерода) с четными числами, характеризующими длину углеродной цепочки (например, 4, 6,8ит.д.атомов углерода), но не синтезируют кислот с нечетными числами. По-видимому, последние были однажды опробованы и оказались неудачными. Можно даже предположить, что факт отсутствия ДДТ в природе свидетельствует о том, что когда-то в прошлом какие-то злосчастные клетки синтезировали его молекулу и погибли.

Один из поразительных фактов в химии живых систем – это то, что для любой органической субстанции, вырабатываемой организмами, существует где-то в природе фермент, способный эту субстанцию разложить. Как следствие, ни одно органическое вещество не будет синтезировано, если нет средств к его разложению. Поэтому, когда человек синтезирует новое органическое вещество, по структуре значительно отличающееся от природных веществ, есть вероятность, что для него не существует разлагающего фермента и это вещество будет накапливаться.

Метаболические превращения, протекающие за счет неспецифических ферментных систем, в общем виде можно представить последовательностью:

Общая тенденция заключается в превращении экзогенного вещества в более полярное соединение и в последующем связывании образовавшегося продукта с высокополярным фрагментом, облегчающим его выделение. У растений, не имеющих системы выделения, аналогичной органам выделения животных, обычно происходит конъюгирование экзогенных веществ (или их метаболитов) с углеводами и депонирование в местах, не связанных с общим метаболизмом.

Как действуют ферменты? В основе действия ферментов лежит образование фермент-субстратного комплекса, который далее распадается с образованием продуктов реакции и освобождением исходного фермента. Заметим, что по принятой терминологии вещество, на которое действует фермент, называют субстратом. Соединение фермента с субстратом именуют фермент-субстратным комплексом. Подобно тому, как ключ может открывать только свой замок, так и фермент действует только на определенный субстрат. При образовании и превращениях фермент-субстратных комплексов принято различать несколько стадий:

1. Присоединение молекулы фермента к субстрату.

2. Преобразование первичного промежуточного соединения (фермент-субстратного комплекса) в один или несколько последовательных активированных комплексов.

3. Отделение конечных продуктов реакции от фермента.

При повышении температуры до 40…50 °C увеличивается активность большинства ферментов, что соответствует общеизвестному закону ускорения химических реакций с повышением температуры. Установлено, что повышение температуры на 10 °C увеличивает скорость ферментативной реакции в 2 раза (такая закономерность для большинства ферментов проявляется в интервале от 0 до 50 °C). Однако при температуре свыше 50 °C происходит постепенное снижение активности ферментов. Дальнейшее нагревание (70…80 °C) приводит к инактивации ферментов. Степень инактивации зависит также от длительности температурного воздействия.

Таким образом, весьма характерным свойством ферментов является их термолабильность, т. е. чувствительность к изменениям температуры.

Большинство ферментов млекопитающих, в том числе и человека, наиболее активны при температуре 37…38 °C, т. е. при обычной температуре тела. Впрочем, и из этого правила имеются исключения. Так, каталаза наиболее активна при 0…10 °C. Ферменты рыб и других холоднокровных животных лучше работают при температурах ниже 37…38 °C.

Ферменты весьма чувствительны к изменениям рН среды, в которой они действуют. Каждый фермент имеет оптимум рН, при котором он наиболее активен. Для большинства ферментов оптимальная среда близка к нейтральной (рН около 7), т. е. максимальная активность ферментов проявляется при физиологических значениях рН, а в кислой и щелочной среде их активность падает.

Из этого правила, впрочем, имеются исключения, и их довольно много. Например, пепсин, содержащийся в желудочном соке, активен лишь в очень кислых средах (рН 1,5 – 2,5), а оптимум действия трипсина лежит при рН около 8 – 9, т. е. в щелочной среде.

В окружающей среде основными ферментативными механизмами являются окислительный, восстановительный, гидролитический и конъюгативный. В частности, эти реакции осуществляются при биотическом дехлорировании хлорированных химических веществ. Хотя соединения со связью углерод – галогены образуются в довольно больших количествах в природных условиях, прочность этой связи является основной причиной высокой устойчивости галогенированных соединений в окружающей среде, так как на нее могут воздействовать лишь немногие живые организмы. В связи с этим расщепление связи С – Cl является предпосылкой минерализации хлорированных загрязняющих веществ.

Ниже приведено уравнение реакции гидролиза мочевины, катализируемой ферментом уреазой:

Важным направлением биологической трансформации у позвоночных животных является перевод гидрофобных соединений в водорастворимые, способные выводиться с мочой. Это достигается путем конъюгации — связывания ксенобиотиков и продуктов их трансформации с гидрофильными молекулами, такими как глюкуроновая кислота, Н₂SO₄ ит.п.

4.6. Биотрансформация неорганических экотоксикантов

Из всех классов неорганических соединений, поступающих в биосферу в результате человеческой деятельности, наибольшее внимание привлекают тяжелые металлы. В их число, согласно решению Целевой группы по выбросам Европейской экономической комиссии ООН, включены Pb, Cd, Hg, Ni, Co, Cr, Cu, Zn, а также As, Sb и Se.

Некоторые из перечисленных элементов необходимы живым организмам, поскольку входят в состав важных биомолекул. Однако потребность в них невелика и поступление избыточных количеств металлов в организмы приводит к тяжелой интоксикации. Поэтому многие организмы имеют естественные механизмы метаболизма и удаления тяжелых металлов, чаще всего в форме металлорганических соединений. Неорганические катионы переводятся в такие соединения различными путями. Один из наиболее изученных механизмов биометилирования включает перенос метиланиона от модифицированной формы витамина В₁₂ (метилкобаламина CH₃CoB₁₂).

Другим направлением биотрансформации ртути является восстановление катионов Hg²⁺ или CH₃Hg⁺ c участием НАДФ/H⁺.Образовавшаяся металлическая ртуть, обладающая высокой летучестью, может переходить в газовую фазу. Таким образом, в общем виде метаболические превращения ртути могут быть представлены в виде следующей схемы:

Процессы биометилирования наиболее интенсивно осуществляются микроорганизмами (псевдомоноподобными бактериями), обитающими в донных отложениях. Поэтому металлорганические соединения прежде всего поступают в наибольших количествах в водные экосистемы. Вследствие довольно высокой химической устойчивости и липофильности органические формы ртути и некоторых других тяжелых металлов накапливаются в жировых тканях и передаются по пищевым цепям.

Здесь уместно напомнить о первом законе экологии Барри Коммонера: «все связано со всем». Иными словами, вред, наносимый одному компоненту экосистемы, может привести к большим неблагоприятным последствиям в функционировании всей экосистемы. Очень часто в паутину, сплетенную из многих экологических связей, оказывается вовлеченным и человек. Ниже приведены два ярких примера на эту тему.

В одном небольшом боливийским городе, решившем покончить с москитами, опылили препаратом ДДД (в отличие от ДДТ не более ядовитым, чем аспирин) всю растительность. Погибших насекомых съели ящерицы, а ящериц – кошки. В результате этого погибли все кошки, появилось огромное количество мышей, что вызвало эпидемию тифа.

Вообще неорганические токсиканты представляют особую опасность для организма вследствие их устойчивости и липофильности (взаимодействия с жирами), обусловливающими большой период полувыведения, т. е. время, в течение которого выделяется или разрушается половина усвоенного организмом вещества. Биологический период полувыведения ртути велик, он составляет для большинства тканей организма человека 70 – 80 дней. Для кадмия период полувыведения составляет более 10 лет, поэтому даже следам кадмия, если они систематически попадают в организм, необходимо уделять самое серьезное внимание. Не приходится удивляться вредным последствиям внедрения кадмия в организм; соответствующая болезнь носит название итаи-итаи, выражается в болезненном скручивании костей, анемии и почечной недостаточности.

В настоящее время известно, что кроме ртути, алкилированию под действием бактерий (как аэробных, так и анаэробных) способны подвергаться многие металлы: мышьяк, олово, свинец, таллий, кадмий и даже золото. Такие вещества оказываются губительными для организмов в нанограммовых количествах.

Глава 5
ТОКСИКОМЕТРИЯ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ

Одной из важнейших характеристик химических веществ, загрязняющих окружающую среду, является их токсичность.

Токсичность – это способность химического соединения оказывать вредное действие немеханическим путем. Токсичность – свойство веществ вызывать отравление организма. Характеризуется дозой вещества, вызывающей ту или иную степень отравления. Различают токсическую и летальную дозы. Первая характеризует минимальное количество токсического вещества, вызывающего появление устойчивых признаков отравления, вторая – минимальное количество токсичного вещества, способного вызвать смертельный исход (Голубев А. А. [и др.], 1973; Основы… 1976).

Любая оценка химического вещества в плане его опасности для организма или риска применения в природных объектах вне зависимости от того, касается это окружающей среды или самого человека, складывается из двух независимых и равных по своему значению составляющих — экспозиции и токсичности (экотоксичности). Любая из них сама по себе не дает возможности оценить воздействие химического вещества на окружающую среду. В предельном случае «самое ядовитое» вещество при нулевой экспозиции совершенно безопасно, а «малоядовитое» вещество в большой концентрации (с большой долей вероятности) может оказаться токсичным. Задачей токсикологии является защита человека от действия токсичных веществ, и главная проблема заключается в использовании результатов, полученных in vitro и в экспериментах на животных, для организма человека.

Экотоксикология направлена на защиту не конкретного индивидуума, а на сохранение функций и многообразия экосистем и на защиту видов, страдающих от воздействия вредных веществ.

Загрязняющие вещества могут проникать в организм человека из окружающей среды тремя основными путями: ингаляционным (при дыхании), пероральным (при приеме воды или пищи) и кожно-резорбтивным (при контакте с кожей).

Количественной мерой токсичности являются величины, обратные дозам или концентрациям химического вещества, вызывающим токсический эффект, например 1/ЛД₅₀ или 1/ЛК₅₀. Чем больше величины 1/ЛД₅₀ или 1/ЛК₅₀, тем токсичнее данное вещество.

Все дозы или концентрации веществ, вызывающие тот или иной эффект при воздействии на различные биообъекты, условно делят на две зоны: зону смертельных величин (ЛД, ЛК) и зону величин несмертельных (эффективных, действующих – ЕД, ЕК).

В общем случае вероятность токсического эффекта (Р) является сложной функцией дозы (Д) или концентрации (К) и времени (t):

P = f (Д, t). (5.1)

Если зафиксировать один из параметров (Д или t), то получим две другие функции:

P = f (Д), при t = const, (5.2)

P = f (t), при Д = const. (5.3)

Общего аналитического выражения дозовой зависимости реакции организма на химическое воздействие в области эффективных доз пока не установлено, и все наблюдаемые варианты дозовых зависимостей (аппроксимационные кривые) распределены на три группы: S-образные кривые, показательные (экспоненциальные) кривые и сложные зависимости (парадоксальные эффекты) (рис. 5.1).

Если обозначить через р вероятность гибели (сколь угодно близкую к единице) каждого отдельного животного или любого другого биологического объекта при воздействии абсолютно смертельной дозы (концентрации) (ЛД ₁₀₀,ЛК₁₀₀ ), тогда вероятность того, что от

этой дозы погибнут все взятые в эксперимент тест-объекты (N), будет равна р^N. Вероятность же наступления противоположного события, т. е. вероятность того, что не все тест-объекты погибнут (например, один тест-объект выживет), будет соответственно равна (1 — р^N). Эта величина (1 — р^N) с увеличением N возрастает и стремится к единице:

(1 — р^N)>1,N > ∞. (5.4)

Следовательно, чем больше по объему будет взятая в опыт группа тест-объектов, тем больше будет вероятность того, что хотя бы одно животное при воздействии данной дозы (концентрации) выживет, т. е. тем меньше вероятность того, что все тест-объекты погибнут. Это означает, что величина ЛД₁₀₀ (ЛК₁₀₀) с увеличением количества взятых в опыт тест-объектов будет обязательно возрастать. Аналогичное положение имеет место и в отношении величины ЛД₀ (ЛК₀). И эта доза (концентрация) с увеличением N будет изменяться, но только в противоположную сторону – в сторону уменьшения. Причину рассмотренного явления объясняют индивидуальной чувствительностью животных к ядам.

Рис. 5.1. Основные виды зависимости «доза – эффект»:

а – S-образные; б – экспоненциальные; в – бимодальные (парадоксальные)

Обычно используют наиболее статистически значимые величины доз или концентраций, приводящие к гибели 50 % биообъектов (ЛД₅₀,ЛК₅₀).

Числовые значения ЛД₅₀ или ЛК₅₀ зависят от многих факторов: природы химического вещества (его состава и строения), вида биообъекта (человек, собака, крыса и т. д.), пола и возраста биообъекта, способа воздействия на организм, продолжительности воздействия, температуры и т. п.

При прочих равных условиях для данного биообъекта токсичность вещества определяется его химической природой. Для иллюстрации приводим табл. 5.1, в которой представлены значения средних смертельных доз некоторых химических веществ для человека и лабораторных животных.

Таблица 5.1

ЛД₅₀ (мг/кг) химических веществ для человека и различных видов лабораторных животных при пероральном введении

(по: Саноцкий И. В., Уланова И. П., 1975)

При анализе данных, приведенных в табл. 5.1, обращает на себя внимание различная чувствительность к одному и тому же веществу различных биообъектов. Так, ЛД₅₀ паратиона увеличивается в ряду

человек < крыса < мышь < морская свинка < кролик,

т. е. к паратиону наиболее чувствителен организм человека и наименее чувствителен организм кролика.

Незнание этого факта может привести к серьезным ошибкам. Приведем два примера.

Несколько лет назад в журнале «Science» была опубликована заметка о реакции самца слона на диэтиламид лизергиновой кислоты (ЛСД). Авторы хотели изучить весьма своеобразное состояние, наблюдаемое у самцов слона и известное под названием «муст». Находящийся в состоянии муста самец становится очень свирепым и опасным, но это не имеет отношения к периоду половой активности (и вопреки распространенному мнению состояние муста не означает, что слону нужна самка).

Вскоре после опубликования этой заметки в одном из писем редактору журнала расчет дозы ЛСД был назван «слоноподобной ошибкой». При определении дозы ЛСД для слона авторы исходили из количества препарата, которое приводит в ярость кошку и, увеличив его пропорционально весу слона, сделали вывод, что ему следует ввести дозу 297 мг. Длинное описание того, чем это кончилось, можно свести к следующему: после инъекции 297 мг ЛСД слон начал трубить и метаться, а затем остановился и закачался; спустя 5 минут он упал, у него начались судороги, дефекация, и он погиб.

Значения ЛД, определенные в экспериментах на животных, нельзя пересчитывать по отношению к людям (пересчет к 70 кг). Очень часто смертельные дозы для людей значительно ниже, чем для животных. В 1938 г. такого рода пересчет повлек за собой гибель около 100 человек при применении диэтиленгликоля.

Одно из важнейших обобщений в токсикологии состоит в признании того, что большей дозе токсиканта соответствует, как правило, большая выраженность биоэффекта. Однако в середине 1980-х гг. в работах ряда исследователей были получены неожиданные результаты при изучении закономерностей биоэффектов физиологически активных веществ в области малых и сверхмалых доз или концентраций (в интервале 10^– 5…10^– 17 моль и менее). При уменьшении концентрации вещества (на 1 – 2 порядка) эффект закономерно снижается, затем наступает «зона молчания» (при более низких концентрациях эффект не наблюдается), а далее при еще более низких концентрациях, отличных от первоначальных на 4 – 6 порядков, эффект возникает снова. Это явление получило название эффекта сверхмалых доз (СМД) или сверхмалых концентраций (СМК). Такой эффект наблюдался при исследовании разнообразных химических агентов: регуляторов роста растений, противоопухолевых препаратов, нейропептидов и гормонов, иммуномодуляторов, антиоксидантов и других, как белковых, так и небелковых соединений.

Особый интерес в токсикологии и экотоксикологии вызывают так называемые парадоксальные эффекты. Уникальный аспект парадоксальных эффектов сводится к следующему: по мере уменьшения дозы или концентрации воздействующего яда токсичность его увеличивается, и наоборот: при увеличении дозы – эффект уменьшается. Парадоксальные эффекты выглядят провалами на кривых «доза – эффект». В ряде случаев кривые, описывающие парадоксальную зависимость, имеют два провала (Булатов В. В. [и др.], 2002).

Парадоксальные эффекты реализуются гораздо чаще, чем фиксируются в научной литературе. Их не всегда удается наблюдать только потому, что они появляются ниже или выше границ изучаемых концентраций ксенобиотиков или в области промежуточных концентраций, которые не рассматривались. В других случаях, когда парадоксальные эффекты казались совершенно очевидными по экспериментальным данным, их просто не учитывали. Кроме того, парадоксальные эффекты могут выявляться в более отдаленное время, чем это определено рамками конкретного эксперимента. В результате они могут быть просто упущены. Однако, если увеличить время наблюдения за биообъектом, сравнимый эффект может быть достигнут при действии значительно более низких концентраций ксенобиотика.

Парадоксальные эффекты широко распространены в физиологии многих биообъектов в самых разнообразных условиях, а также в химических системах. В литературе довольно полно описан один из частных случаев бифазной зависимости «доза – эффект», так называемое явление гормезиса. Гормезис представляет собой двухфазный ответ на воздействие ксенобиотика – стимуляция эффекта при низкой концентрации и ингибирование – при высокой концентрации.

Хотя парадоксальный эффект имеет место при действии химических веществ на биологические системы разных уровней организации (организменный, клеточный, субклеточный), механизм его в большинстве случаев неясен, и в настоящее время четкое объяснение природы этого феномена отсутствует. Тем не менее, для ряда случаев механизм парадоксальных реакций установлен. Так, например, выяснено, что некоторые ферменты в процессе взаимодействия с ядом могут существенно отличаться по своей чувствительности к ингибитору или к промежуточным продуктам, которые накапливаются в результате ингибирования. В этих условиях активность биохимической системы, связанной с метаболизмом данного яда, может парадоксально реагировать в ответ на увеличение дозы ингибитора.

Во всех биологических организмах, представляющих собой открытые динамические системы, действует закон Арндта – Шульца: «Наличие целого каскада взаимосвязанных реакций в биологических системах позволяет даже незначительному раздражению вызвать максимальную ответную реакцию в организме. Сильные и сверхсильные раздражения, а также слабые раздражения, повторяемые слишком часто, скорее блокируют ответ на раздражение».

Для примера отметим, что с биотическими концентрациями ртути издавна работают в гомеопатии, которая утверждает, что две фазы действия лекарства определяются дозой. Например, в обычных терапевтических дозах атропин вызывает сухость слизистых, тогда как в крайне малых дозах он повышает их секрецию. Этот фармакологический принцип, открытый в 1870-х гг. двумя исследователями Hugo Schulz (академический ученый) и Rudolf Arndt (психиатр и гомеопат), получил название Закон Арндта – Шульца. Например, в очень низких концентрациях йод, бром, хлорид ртути и мышьяковая кислота (H₃AsO₄) стимулируют рост дрожжей, в средних дозах – подавляют, а в больших дозах – убивают клетки.

В настоящее время для оценки параметров токсичности химических веществ, загрязняющих окружающую среду, используют два типа методов: развернутые методы и экспресс-методы (рис. 5.2).

Рис. 5.2. Методы определения параметров токсичности