Текст книги "Жизнь на скорости света. От двойной спирали к рождению цифровой биологии"

Бактериальная рибосома состоит из двух крупных частей, называемых 30S и 50S субъединицами, которые расходятся и сходятся во время работы. Меньшая субъединица 30S – это часть рибосомы, которая считывает генетический код; в большей, 50S, собственно делаются белки. Субъединица 30S изучена с точностью до атома Йонат и независимо – Венкатраманом Рамакришнаном в Лаборатории молекулярной биологии Совета по медицинским исследованиям в Кембридже (Англия). Они, например, открыли «акцепторный участок», часть субъединицы 30S, который распознает и отслеживает точность соответствия между матричной и транспортной РНК. Детали молекулярного строения показывают, как рибосома выполняет спаривание двух первых букв кодона: молекулы тычутся, пока не «ощутят» желобок в двойной спирали из хорошо подогнанных РНК, чтобы гарантировать, что код прочитывается с высокой достоверностью. При проверке третьей буквы в тройке, соответствующей конкретной аминокислоте, этот механизм оказывается менее строгим из-за неоднозначности кода. Это совпадает с наблюдением, что конкретной тРНК – и аминокислоте на ней – может соответствовать не одна тройка нуклеотидов мРНК. Например, аминокислоту фенилаланин может кодировать как тройка УУУ, так и УУЦ.

Кроме того, Гарри Ф. Ноллер из Калифорнийского университета в Санта-Крусе (начинавший свое исследование, будучи очарован тем, как двигаются молекулы) в 1999 году опубликовал первые подробные изображения целой рибосомы, а потом, в 2001-м, дополнил их еще более тонкими деталями. Его работа показала, как формируются и распадаются молекулярные мостики во время этой операции{67}67
  http://library.cshl.edu/oralhistory/interview/cshl/memories/harry-noller-and-ribosome/


[Закрыть]. Рибосомная машина содержит пружины сжатия и кручения, сделанные из РНК, чтобы держать субъединицы вместе, когда они смещаются и проворачиваются относительно друг друга. Ее малая субъединица, двигаясь вдоль матричной РНК, связывается с транспортной РНК, у которой на одном конце свободный антикодон, а на другом – аминокислота. Аминокислоты связываются вместе в белок большой субъединицей, которая тоже связывается с транспортной РНК. Таким образом рибосома может пропускать через свой центр по 15 груженных аминокислотами молекул РНК в секунду, координируя присоединение новых звеньев к растущему белку.

На нарушении этих функций бактериальных рибосом основано действие многих антибиотиков. К счастью, хотя бактериальные и человеческие рибосомы похожи, они достаточно различаются, чтобы антибиотики могли связаться с бактериальными рибосомами и блокировать их эффективнее, чем человеческие. Все аминогликозиды – тетрациклин, хлорамфеникол, эритромицин – работают, убивая бактериальные клетки вмешательством в работу рибосом.

Йонат, Рамакришнан и Томас А. Стейтц поделили Нобелевскую премию 2009 года по химии за свои опыты по выяснению, как работает эта чудесная машина.

По мере развития геномики роль РНК выглядела все более важной. Согласно центральной догме, РНК – всего лишь посредник, обеспечивающий выполнение команд, зашифрованных в ДНК. В этой модели двойная спираль ДНК расплетается, и ее генетическая информация копируется на одноцепочечную мРНК. В свою очередь мРНК переносит ее от генома к рибосомам. Общепринятым также было мнение, что ДНК, не кодирующая белки, – это «мусорная» ДНК. Оба представления изменились в 1998 году, когда Эндрю Файр из Института Карнеги в Вашингтоне, Крейг Кэмерон Мелло из Массачусетского университета и их коллеги опубликовали свидетельства того, что двухцепочечная РНК, снятая с некодирующей ДНК, может быть использована, чтобы отключать определенные гены, – что помогло объяснить некоторые озадачивающие явления, наблюдающиеся, например, у петуний{68}68
  Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. (1990). “Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans.” Plant Cell 2 (4), стр. 279–289.


[Закрыть]. Теперь стало ясно, что некоторые участки ДНК кодируют короткие молекулы РНК – молекулярные выключатели, играющие ключевую роль в том, как и насколько интенсивно используются гены. Вся информация в живой клетке в конечном счете заключена в определенном порядке нуклеотидов и аминокислот – в ДНК, РНК и белках. Поддержание этой чрезвычайной упорядоченности в геноме определяется священными законами термодинамики. Чтобы молекулярные машины могли обуздать тепловое движение, надо затратить химическую энергию. Клетки также требуют постоянных затрат этой энергии, чтобы образовывать ковалентные связи между молекулами, а также для выстраивания этих молекул в правильном порядке или последовательности. Посреди этой бури химического хаоса лежит относительно неколебимый набор инструкций, закодированных в ДНК.

Обсуждая механизм кодирования наследственной информации, Шрёдингер имел причину говорить об «апериодическом кристалле»: он хотел подчеркнуть надежность хранения наследственной информации и использовал термин «кристалл», чтобы «объяснить постоянство гена». Совсем другое дело – белковые роботы, закодированные в наших генах, нестабильные и быстро ломающиеся. Продолжительность жизни любого белка лежит в интервале от секунд до дней. Им приходится выдерживать суету в клетке, где тепловая энергия заставляет молекулы биться друг о друга. Белки также могут складываться в неактивные и часто ядовитые скопления – на чем основаны некоторые хорошо известные болезни.

В каждый конкретный момент человеческая клетка обычно содержит тысячи разных белков, производя одни и избавляясь от других по мере надобности для поддержания своего благополучия. Недавние исследования ста белков в человеческих раковых клетках{69}69
  Eden, E., N. Geva-Zatorsky, I. Issaeva, A. Cohen, E. Dekel, T. Danon, L. Cohen, A. Mayo, U. Alon. “Proteome half-life dynamics in living human cells.” Science, 11 февраля 2011, 331 (6018), стр. 764–768. Опубликовано онлайн 13 января 2011.


[Закрыть] показали, что период полураспада белков составляет от 45 минут до 22,5 часа. Сменяются и сами клетки. Каждый день в человеческом организме умирает 500 миллиардов кровяных клеток. Предполагается, что в ходе нормального развития любого органа умирает половина составляющих его клеток. У нас каждый день слущивается около 500 миллионов клеток кожи. В результате вы сбрасываете весь ваш внешний слой кожи каждые две-четыре недели. Пыль, которая накапливается у вас дома – это вы. Если вы не будете постоянно создавать новые белки и клетки, вы умрете. Жизнь – это процесс постоянного обновления. Без нашей ДНК, без программ жизни, клетки очень быстро гибнут, а с ними и весь организм.

То, что линейные цепочки аминокислот, определенные генетическим текстом, складываются в характерные формы, чтобы выполнять свои особые функции, кажется на первый взгляд почти что чудом. Не все правила, определяющие складывание белков, уже поняты, что неудивительно, если учесть, что типичная цепочка из аминокислот (полипептид) имеет от миллионов до триллионов возможных конфигураций сложения. Чтобы вычислить все возможные конформации любого белка до предсказуемого термодинамически стабильного состояния, Лоуренсовская национальная лаборатория в Ливерморе объединила усилия с IBM, породив Blue Gene – линию суперкомпьютеров, которые могут выполнять около триллиона операций с плавающей запятой в секунду (то есть имеют мощность в один петафлопс).

Белок из сотни аминокислот может складываться множеством способов, так что количество различных структур составляет от 2¹⁰⁰ до 10¹⁰⁰ возможных конформаций. Чтобы испробовать все возможные конформации для каждого белка, понадобилось бы примерно 10 миллиардов лет. Но в линейную последовательность белкового текста встроены инструкции по складыванию, которые в свою очередь определены линейным генетическим текстом. В результате с помощью броуновского движения – постоянного движения молекул, вызываемого тепловой энергией, – эти процессы происходят очень быстро – за несколько тысячных секунды. Это обеспечивается тем, что правильно сложившийся белок имеет самую низкую возможную свободную энергию. И так же, как вода стекает в самую нижнюю точку, белок естественно принимает свою предпочтительную форму.

Правильно сложенная конформация – та, которая гарантирует, что фермент может правильно работать, – включает переход от высокой степени энтропии и свободной энергии к термодинамически стабильному состоянию сниженной энтропии и свободной энергии. У белка, называемого виллин, этот процесс можно даже наблюдать благодаря компьютерной симуляции{70}70
  Видео про складывание белка можно посмотреть на http://www.youtube.com/watch?v =sD6vyfTtE4U&feature=youtu.be. См. также http://www.ks.uiuc.edu/Research/folding/


[Закрыть]. Растягивая действие реальной продолжительностью в шесть миллионных секунды до нескольких секунд, симуляция показывает, как тепловая энергия заставляет трястись исходную линейную цепочку из восьмидесяти семи аминокислот; линейный белок дергается туда-сюда и всего за шесть микросекунд проходит через множество разных конформаций на пути к окончательной форме. Представьте, сколько актов эволюционного отбора ушло на этот дерганый танец, учитывая, что аминокислотная последовательность белка определяет не только тип его свертывания, но и его окончательную структуру – и, следовательно, его функцию.

Соревнование между «правильными» и потенциально вредными вариантами складывания белков довольно быстро привело к появлению «контроля качества» клеточных белков в виде другой группы специализированных молекулярных машин. Эти «молекулярные дуэньи» – шапероны – помогают белкам складываться и препятствуют образованию вредных агрегаций, а также разбирают агрегации, которые уже сформировались. Так, например, шапероны Hsp70 и Hsp100 разбирают агрегации, а Hsp60 состоит из разных белков, которые образуют что-то вроде бочонка с крышкой, чтобы, находясь внутри, несложившийся белок мог принять правильную форму. Неудивительно, что нарушение функционирования шаперонов лежит в основе многих нейродегенеративных заболеваний и форм рака.

Самая частая у европеоидов наследственная болезнь из тех, что определяются одним геном (в США она поражает одного новорожденного из 3500), – муковисцидоз, пример неправильно складывающегося, неверно ведущего себя белка. Он вызывается дефектом в гене, который отвечает за белок, называемый муковисцидозный трансмембранный регулятор проводимости (CFTR). Этот белок регулирует транспорт хлорид-иона сквозь клеточную мембрану; его изъяны приводят к разнообразным симптомам. Например, дисбаланс воды и соли у пациентов с муковисцидозом приводит к тому, что их легкие забивает липкая слизь, которая к тому же становится средой для роста болезнетворных бактерий. Повреждение легких из-за постоянных инфекций – главная причина смерти людей с этой болезнью. Не так давно ученые показали{71}71
  Sun, Fei, Zhibao Mi, Steven B. Condliffe, Carol A. Bertrand, Xiaoyan Gong, Xiaoli Lu, Ruilin Zhang, Joseph D. Latoche, Joseph M. Pilewski, Paul D. Robbins, and Raymond A. Frizzell. “Chaperone displacement from mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator restores its function in human airway epithelia.” The FASEB Journal, Vol. 22, № 9, стр. 3255–3263. 2 сентября 2008.


[Закрыть], что по большей части в основе муковисцидоза лежит самая обычная мутация, мешающая отделению транспортного белка от одного из его шаперонов. В результате последние этапы нормального складывания не проходят, и активный белок не производится в должном количестве.

Разрушение скоплений белка и белковых фрагментов жизненно важно, потому что эти субстанции могут образовывать пробки или бляшки, которые очень токсичны. Когда при забастовке мусорщиков прекращается вывоз отходов, на улицах растут горы зловонных отбросов, уличное движение замедляется, растет риск болезней, и город быстро выходит из строя. То же верно для клеток и органов. Болезнь Альцгеймера, дрожь паркинсоника и неотвратимое ухудшение при болезни Крёйцфельда-Якоба (человеческая форма коровьего бешенства) – все это происходит из-за накопления токсичных нерастворимых белковых агрегаций.

Некоторые белковые машины приспособлены для исправления ошибок при синтезе и сборке белков. Протеасомы отвечают за ликвидацию ненормальных белков путем протеолиза – реакции разрывания белковых связей, выполняемой ферментами протеиназами. Эта машина представляет собой цилиндрический комплекс, средняя часть которого состоит из четырех колец, подобно стопке бубликов, каждый бублик сделан из семи белковых молекул. Предназначенные для ликвидации в протеасоме белки-мишени помечаются молекулами убиквитина – маленького белка, присутствующего по всей клетке. Примерно тридцать лет назад этот базовый механизм избавления клетки от отходов был выявлен тремя учеными: Аароном Чехановером, Аврамом Хершко и Ирвином А. Роузом; в 2004 году они получили за это Нобелевскую премию.

Продолжительность жизни каждого белкового робота в клетке генетически запрограммирована. Действие этой программы слегка отличается в разных ветвях жизни. Например, и E. coli, и дрожжевые клетки содержат фермент бета-галактозидазу, которая помогает расщеплять сложные сахара; однако период полураспада этого фермента сильно зависит от аминокислоты на конце белка (N-концевой аминокислоты). Когда на N-конце бета-галактозидазы стоит аргинин, лизин или триптофан, время полураспада белка составляет 120 секунд у E. coli и 180 секунд у дрожжей. Если на том же месте стоит серин, валин или метионин, время полураспада значительно возрастает – более 10 часов у E. coli и более 30 часов у дрожжей. Это называется N-концевым правилом{72}72
  Varshavsky, Alexander (1997). “The N-end rule pathway of protein degradation.” Genes to Cells 2 (1), стр. 13–28.


[Закрыть] пути деградации белка.

Нестабильность и недолговечность белков показывают, что и жизнь самих клеток была бы очень короткой, если бы клетки были просто мембранными мешочками – пузырьками – с белками, но без генетического материала. Все клетки умрут, если не смогут постоянно делать новые белки для замещения тех, что повреждены или неправильно сложены. Бактериальная клетка должна заново сделать все свои белки или умереть в течение часа или даже меньше. Это верно и для клеточных структур, таких как мембрана: круговорот фосфолипидных молекул и мембранных транспортеров таков, что, если они не будут постоянно пополняться новыми, мембрана лопнет и все содержимое клетки вытечет. При культивировании клеток в лаборатории применяют простой тест на жизнеспособность: определить, протекает ли их мембрана настолько, чтобы пропустить внутрь крупные частицы красителя. Если они могут проникнуть в клетки, те явно мертвы.

Другая белковая машинерия разлагает и разрушает старые или отказывающие клетки в многоклеточных организмах. Эта программируемая клеточная смерть – апоптоз – критически важная составляющая жизни и развития. Конечно, разборка чего-то настолько сложного, как клетка, требует чрезвычайно точной координации. Чтобы начать разрушение, апоптосома, белковый комплекс, прозванный «машина смерти о семи спицах», использует каскад каспаз – особой разновидности протеаз, т. е. ферментов, переваривающих белок. Эти каспазы ответственны за разборку главных клеточных белков, таких как белки цитоскелета, что приводит к характерным изменениям формы клеток, подвергающихся апоптозу. Другой признак апоптоза – это фрагментация ДНК. Каспазы играют важную роль в этом процессе, активируя фермент, расщепляющий ДНК, – ДНКазу. Кроме того, они ингибируют ферменты, ремонтирующие ДНК, разрушая структурные белки в ядре клетки.

Наши тела можно было бы представить как трехмерные белковые структуры, но постоянное обновление их компонентов делает эти структуры динамическими. Шрёдингер уловил это, когда говорил о «поразительном даре организма концентрировать в себе „поток порядка“, избегая тем самым распада в атомный хаос, – о „питье упорядоченности“ из подходящей окружающей среды».

И наконец, мы должны рассмотреть, что именно движет всей бешеной активностью и обновлением во всех и в каждой клетке. Если и был кандидат на жизненную силу для одушевления жизни, это то, что в 1827 году впервые заворожило Роберта Броуна (1773–1858), когда этот шотландский ботаник заинтересовался постоянными зигзагообразными движениями фрагментов пыльцевых зерен, феноменом, который назовут в его честь (если только вы не француз – они утверждают, что сходные наблюдения были изложены в 1828 году ботаником Адольфом-Теодором Броньяром, 1801–1876). Броуна озадачило то, что эти микроскопические движения происходили не от потоков жидкости, и не от испарения, и не от прочих очевидных причин. Сначала он подумал, что заметил «тайну жизни», но, обнаружив, что так же двигаются и минеральные крупицы, отмел это представление.

Первый существенный сдвиг в нашем нынешнем понимании того, чему стал свидетелем Броун, произошел более чем через 75 лет после его открытия, когда Альберт Эйнштейн (1879–1955) рассмотрел теоретически, как невидимые молекулы, из которых состоит вода, должны подпихивать плавающие в ней мелкие частицы. До статьи Эйнштейна 1905 года кое-кто из физиков (особенно Эрнст Мах, 1838–1916) все еще сомневался в физической реальности атомов и молекул. Модель Эйнштейна была в конце концов подтверждена точными экспериментами, проведенными в Париже Жаном Батистом Перреном (1870–1942), который в 1926 году был награжден за эту и другие работы Нобелевской премией.

Броуновское движение оказалось важным, когда дело дошло до понимания работы живых клеток. Многие жизненно важные компоненты клеток, такие как ДНК, намного больше отдельных атомов, но все же достаточно малы, чтобы их двигали постоянные удары окружающего моря атомов и молекул. Так что, хотя ДНК действительно имеет форму двойной спирали, благодаря силам хаотического броуновского движения это извивающаяся, сгибающаяся, кружащаяся спираль. Белковые роботы живых клеток способны складываться в свои правильные формы лишь потому, что их компоненты – это подвижные цепочки, пластинки и спирали, которые постоянно толкутся внутри защитной клеточной мембраны. Жизнь движется броуновским движением, начиная с кинезиновых грузовичков, которые тянут маленькие мешочки с веществами вдоль микротрубочек к вращающейся АТФ-синтетазе{73}73
  Oster, George, and Hongyun Wang. “How Protein Motors Convert Chemical Energy into Mechanical Work” (2003). In Molecular Motors, edited by M. Schliwa (Wiley-VCH). http://users.soe.ucsc.edu/~hongwang/publications/Schliwa_08.pdf


[Закрыть]. Критически важно, что броуновское движение зависит от температуры: слишком низкая – и движения не хватает; слишком высокая – и все структуры идут вразнос от бешеного движения. Поэтому жизнь может существовать только в узком спектре температур.

Внутри этого спектра в клетках постоянно происходит что-то вроде девятибалльного землетрясения. «Вам не нужно было бы даже нажимать на педали велосипеда: просто приделайте к колесу храповик, чтобы оно не могло крутиться назад, и тряситесь вперед», как говорили Джордж Остер и Хуньгун Ван с факультета молекулярной и клеточной биологии Калифорнийского университета в Беркли{74}74
  Oster, George, and Hongyun Wang. “How Protein Motors Convert Chemical Energy into Mechanical Work” (2003). In Molecular Motors, edited by M. Schliwa (Wiley-VCH). http://users.soe.ucsc.edu/~hongwang/publications/Schliwa_08.pdf


[Закрыть]. Белковые роботы совершают похожий трюк, используя храповики и рабочие такты для обуздания силы броуновского движения. Благодаря непрекращающемуся беспорядочному движению и вибрации молекул на коротких дистанциях очень быстро происходит диффузия, что позволяет происходить биологическим реакциям с малыми количествами реагентов в чрезвычайно тесных объемах большинства клеток.

Теперь, когда мы знаем, что линейный текст ДНК определяет строение белковых роботов и РНК, которые управляют нашими клетками, а их строение, в свою очередь, определяет их функции, следующий вопрос очевиден: как нам читать и понимать этот текст, чтобы мы могли понять программу жизни?

Глава 4. Оцифровка жизни

Первые дни молекулярной биологии были отмечены тем, что многим показалось самонадеянным отщеплением новой науки от биохимии. Однако наш спор не касался методов биохимии, но лишь их слепого игнорирования новой области химии информации.

Сидней Бреннер, 2005{75}75
  Brenner, Sydney. “Biochemistry Strikes Back.” In The Inside Story, edited by Jan Witkowski, 2005, стр. 367.


[Закрыть]

Настала эра цифровой биологии, в которой белки и другие взаимодействующие молекулы в клетке можно рассматривать как компьютерное «железо», а информацию, закодированную в ДНК, – как клеточный «софт», то есть программы. Вся информация, нужная для создания живой самовоспроизводящейся клетки, заключена в цепочках двойной спирали ДНК. По мере чтения и истолкования этого текста мы в конце концов сможем полностью понять, как работают клетки, а затем изменять и улучшать их путем написания новых клеточных программ. Но, конечно, это легче сказать, чем выполнить: изучение этих программ – ДНК – показывает, что они значительно сложнее, чем мы думали даже лет десять назад.

В то время как первая линейная последовательность аминокислот в белке (инсулине) была установлена Фредом Сэнгером в 1949 году, разработка методов чтения ДНК оказалась делом долгим. В 1960-х и 1970-х продвижение было медленным и секвенирование измерялось в нескольких парах оснований в месяц или даже в год. Например, в 1973 году Аллан Максэм и Уолтер Гилберт из Гарвардского университета опубликовали статью, описывающую, как с помощью их нового метода секвенирования{76}76
  Gilbert, Walter, and Allan Maxam. “The Nucleotide Sequence of the lac Operator.” Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 70, № 12, Part I, стр. 3581–3584, 1973.


[Закрыть] были установлены двадцать четыре пары оснований. Одновременно шло и секвенирование РНК, продвигавшееся несколько быстрее. И все же по сравнению с возможностями современных технологий даже для чтения нескольких букв кодированного текста в ту пору требовались поистине героические усилия.

Большинство людей узнали о геномике при первой расшифровке человеческого генома, которая увенчалась моим появлением в Белом доме в 2000 году рядом с моими коллегами-соперниками и президентом Клинтоном, где мы торжественно объявили об открытии последовательности человеческого генома. На самом деле первые идеи о расшифровке ДНК относятся к временам полувековой давности, когда Уотсон и Крик предложили модель ее атомной структуры. Большой скачок в нашем познании случился, когда в 1965-м группа под руководством Роберта Холли из Корнеллского университета опубликовала последовательность из семидесяти семи рибонуклеотидов аланиновой транспортной РНК (тРНК) из клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae{77}77
  Holley, R. W., G. A. Everett, J. T. Madison, A. Zamir (май 1965). “Nucleotide Sequences In The Yeast Alanine Transfer Ribonucleic Acid.” J. Biol. Chem. 240 (5), стр. 2122–2128. PMID14299636.


[Закрыть] как часть работы по выявлению того, как тРНК помогает собирать аминокислоты в белки. Секвенирование РНК продолжало лидировать, когда в 1967 году группа Фреда Сэнгера установила последовательность нуклеотидов рибосомальной 5S-РНК E. coli, короткой молекулы из 120 нуклеотидов{78}78
  Brownlee, G. G.; F. Sanger, B. G. Barrell (1967). “Nucleotide sequence of 5S-ribosomal RNA from Escherichia coli.” Nature 215 (5102), стр. 735–736.


[Закрыть]. Первый реальный геном, который был успешно расшифрован, был вирусной РНК: в 1976 году лабораторией Вальтера Фирса в Гентском университете в Бельгии был секвенирован бактериофаг MS2. Фирс изучал бактериофаги (которые захватывают для своего размножения бактерии) совместно с Робертом Л. Синшаймером из Калтеха, а потом с Харом Гобиндом Кораной в Мэдисоне (Висконсин).

Технология секвенирования ДНК, которая дала мне возможность секвенировать человеческий геном, зародилась в середине 1970-х, когда группа Фреда Сэнгера в Кембридже разработала новую технику – первую, которую можно было назвать «более-менее секвенированием». За ней последовала методика, которую Сэнгер назвал дидезокси-секвенированием ДНК, но которая в его честь теперь называется «секвенированием по Сэнгеру». В нем применяются дидезоксинуклеотиды, или нуклеотиды-терминаторы, которые останавливают ДНК-полимеразу, не давая ей добавлять нуклеотиды к растущей цепочке ДНК. У дидезоксинуклеотидов нет гидроксильной группы (–ОН), что означает, что после того, как ДНК-полимераза прицепит их к растущей нуклеотидной цепочке, дальше нельзя добавить никаких нуклеотидов. Прикрепив радиоактивный фосфат к одному из четырех нуклеотидов, чтобы пометить фрагменты, стало возможным прочесть порядок А, Т, Ц и Г, прикладывая гель, использованный для разделения оснований, к рентгеновской пленке[7]7
  В опытах Сэнгера синтез ДНК с одинаковых матриц шел параллельно в четырех пробирках, в каждой из которых часть нуклеотидов одного из типов (А, Т, Ц или Г) была представлена дидезоксинуклеотидами, меченными радиоактивным фосфором. Присоединение такого нуклеотида обрывало дальнейший синтез. В результате в каждой пробирке получался набор фрагментов ДНК, оборванных в случайном месте (но всегда – по одному и тому же нуклеотиду). Затем все четыре набора подвергались электрофорезу в акриламидном геле, в ходе которого фрагменты распределялись в соответствии со своей длиной: чем короче фрагмент, тем дальше он успевал продвинуться в геле под действием электрического поля. Наконец, все четыре полоски геля выкладывались рядком на рентгеновскую пленку, и по картине распределения меток восстанавливалась последовательность нуклеотидов во всей цепочке. Скажем, самая дальняя метка на пленке оставлена полоской с меченым А – значит, первый нуклеотид в последовательности – А. Следующая по дальности метка оставлена полоской с меченым Ц – значит, второй нуклеотид – Ц. И так до полной расшифровки последовательности.


[Закрыть].

Группа Сэнгера использовала его новые инструменты секвенирования для установления первой последовательности генома ДНК-вируса, принадлежащего бактериофагу phi X 174{79}79
  Sanger, F., G. M. Air, B. G. Barrell, N. L. Brown, A. R. Coulson, C. A. Fiddes, C. A. Hutchinson, P. M. Slocombe, et al. (1977). “Nucleotide sequence of bacteriophage φX174 DNA.” Nature 265 (5596), стр. 687–695.


[Закрыть]; эта последовательность была опубликована в Nature в 1977 году. Клайд Хатчинсон (ныне сотрудник Института Вентера) стажировался в лаборатории Сэнгера (от Университета Северной Каролины, где он с 1968 года был штатным преподавателем) и внес свой вклад в секвенирование генома phi X 174. В 1950-х Синшаймер, использовав рассеяние света, оценил размер генома phi X 174 примерно в 5400 оснований и был удовлетворен, когда Сэнгер выяснил, что точное количество – 5386{80}80
  http://oralhistories.library.caltech.edu/33/0/OH_Sinsheimer.pdf


[Закрыть].

За два года до появления статьи Сэнгера я закончил свою диссертацию в Калифорнийском университете в Сан-Диего (UCSD) и успел перейти в Университет штата Нью-Йорк в Баффало, чтобы начать собственную научную и преподавательскую карьеру. Я пропустил публикацию Сэнгера, потому что она вышла в самый разгар Бурана-77[8]8
  Буран-77 – катастрофическая снежная буря на северо-западе штата Нью-Йорк (где расположен город Баффало) 28 января – 1 февраля 1977 года. Скорость ветра достигала 111 км/час, температура опускалась до –57 °C, толщина снежного покрова местами превышала 2,5 м. Буран парализовал транспортное сообщение и работу электросетей.


[Закрыть], к тому же спустя две недели после публикации у меня родился сын{81}81
  Venter, J. Craig (18.10.2007). A Life Decoded: My Genome: My Life. Penguin. E-book.


[Закрыть]. Моя лаборатория в это время работала над выделением и описанием рецепторов для нейромедиаторов – белков, обеспечивающих передачу сигналов между нервными клетками.

За десять лет, последовавших за работой над геномом phi X 174, секвенирование ДНК постепенно прогрессировало. Хотя секвенирование по Сэнгеру стало мировым стандартом, оно было медленным, очень трудоемким и требовало заметных количеств радиоактивного фосфора, у которого период полураспада – всего пара недель. Кроме того, чтение гелей с последовательностями было скорее искусством, чем наукой. В своей второй Нобелевской лекции Сэнгер описывал утомительные усилия, которых требовало раннее секвенирование ДНК, и заключал: «Судя по всему, для секвенирования генетического материала был весьма желателен новый подход»{82}82
  Sanger, Frederick, Nobel lecture, 8 декабря 1980.


[Закрыть].

В 1984 году я перевел свою исследовательскую команду в Национальный институт здоровья, и мы начали учиться молекулярной биологии с помощью нескольких хороших сборников рецептов по этому предмету и моих взаимодействий с Маршаллом Ниренбергом и его лабораторией, которая располагалась этажом ниже нашей в корпусе 36. За мой первый год в НИЗ мы секвенировали только один ген, адреналинового рецептора человеческого мозга{83}83
  Chung, F. Z., K. U. Lentes, J. Gocayne, M. Fitzgerald, D. Robinson, A. R. Kerlavage, C. M. Fraser, J. C. Venter. “Cloning and sequence analysis of the human brain beta-adrenergic receptor. Evolutionary relationship to rodent and avian beta-receptors and porcine muscarinic receptors.” FEBS Lett, 26 января 1987; 211(2), стр. 200–206.


[Закрыть], используя радиоактивное секвенирование по Сэнгеру, но это заняло большую часть года. Как и Сэнгер, я был уверен, что должен быть способ получше. К счастью, это было примерно в то время, когда Лерой Худ и его команда в Калтехе опубликовали ключевую статью с описанием, как они заменили в нуклеотидах-терминаторах радиоактивный фосфат на четыре разных флюоресцентных красителя, которые, если их активировать лазерным лучом, можно было последовательно считывать прямо в компьютер{84}84
  Smith, Lloyd M., Jane Z. Sanders, Robert J. Kaiser, Peter Hughes, Chris Dodd, Charles R. Connell, Cheryl Heiner, Stephen B. H. Kent & Leroy E. Hood. “Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis.” Nature 321, стр. 674–679 (12 июня 1986).


[Закрыть]. Я раздобыл одну из первых автоматических ДНК-секвенирующих машин в новой компании Applied Biosystems, как раз когда начались серьезные обсуждения дикого предложения секвенировать целиком человеческий геном.

Используя новую технологию секвенирования ДНК в сочетании с компьютерным анализом, моя лаборатория быстро секвенировала тысячи человеческих генов по разработанной мною новой методике, фокусировавшейся на относительно коротких последовательностях, которые я назвал «экспрессированными метками сиквенса» (expressed sequence tags; EST){85}85
  Adams, M. D., J. M. Kelley, J. D. Gocayne, M. Dubnick, M. H. Polymeropoulos, H. Xiao, C. R. Merril, A. Wu, B. Olde, R. F. Moreno, et al. “Complementary DNA sequencing: Expressed sequence tags and human genome project.” Science 252, стр. 1651–1656 (1991).


[Закрыть]. Метод EST включал секвенирование экспрессированного[9]9
  Экспрессией гена в молекулярной биологии называется реализация закодированной в нем информации; первый этап экспрессии гена – считывание с него матричной РНК.


[Закрыть] генетического материала – матричной РНК (точнее, синтезированной на ней комплементарной ДНК). Хотя с помощью методики EST мы успешно прочли несколько тысяч человеческих генов, мой подход не встретил немедленно всеобщего одобрения. Многие увидели в нем угрозу традиционному пути работы с генами: мы могли за день открыть больше генов, чем всё научное сообщество – за предыдущие десять лет. Не улучшило ситуации и то, что правительство США решило зарегистрировать патенты на все гены, идентифицированные моей командой. Наши открытия вызывали атаки и возражения, но они же приводили к некоторым заманчивым предложениям, в том числе – создать мой собственный базовый научно-исследовательский институт, каковое я и принял в 1992 году. Я назвал его Институтом геномных исследований (The Institute for Genomic Research, TIGR), и именно там, в Роквилле (штат Мэриленд), мы построили самую крупную в мире фабрику секвенирования ДНК, используя последние версии автоматических ДНК-секвенирующих машин.

Ход истории геномики изменился в 1993 году после случайной встречи на научной конференции в Бильбао, в Испании, где я обрисовал наше быстрое продвижение в открытии генов. Многие в аудитории как будто были шокированы масштабными результатами наших работ по EST и самой природой наших открытий – особенно генов, ответственных за неполипозный рак толстой кишки, открытых в сотрудничестве с Бертом Фогельштайном из Киммелевского онкологического центра Университета Джонса Хопкинса в Балтиморе. Как только рассеялась толпа, пришедшая задавать прямые вопросы, передо мной появился высокий приятного вида человек с серебристыми волосами и в очках. «Я думал, у вас есть рожки», – сказал он, намекая на демонический образ, который часто использовала пресса, изображая меня. Он представился Хэмилтоном Смитом из Университета Джонса Хопкинса. Я уже знал о Хэме по его серьезной репутации в нашей области и по Нобелевке, и мне он сразу понравился – он явно решил составить обо мне и моей науке собственное впечатление и не давать окружающим влиять на его мнение{86}86
  Venter, J. Craig (18.10.2007). A Life Decoded: My Genome: My Life. Penguin. E-book.


[Закрыть].

Хэм к тому времени сделал долгую и плодотворную карьеру и теперь, в 62 года, подумывал об отставке. Когда мы разговаривали в баре, а потом на обеде после моей лекции, он высказал интересную идею: предложил свою любимую бактерию Haemophilus influenzae, из которой он выделил первые рестриктазы, в качестве идеального кандидата для секвенирования генома с применением моего подхода.

Наш первый совместный проект начался с медленного старта, поскольку Хэм объяснил, что есть проблемы с получением библиотек клонов, содержащих фрагменты генома H. influenzae. Только спустя годы он признался мне, что его коллеги в Университете Джонса Хопкинса были совсем не в восторге от нашего проекта, глядели на меня с подозрением из-за фурора, произведенного EST, и опасались, что сотрудничество со мной испортит ему репутацию. Хотя многие из них всю свою трудовую жизнь изучали H. influenzae, они не сразу оценили идею получения полной последовательности генома. Хэм в конце концов был вынужден действовать за спиной своей группы – как и я несколькими годами раньше при работе с EST{87}87
  Venter, J. Craig (18.10.2007). A Life Decoded: My Genome: My Life. Penguin. E-book.


[Закрыть].

Хэм начал сотрудничать со мной в TIGR. Наша работа над проектом началась в 1994 году и вовлекла в себя большую часть моей научной команды. Мы действовали не так, как Сэнгер много лет назад с phi X 174, используя изолированные одиночные вырезанные фрагменты для секвенирования по одному за раз. Мы полностью положились на случайность. Мы разбили геном на фрагменты в смешанной библиотеке[10]10
  Библиотека генов, клонотека – коллекция клонов, представляющих генетический материал данного организма.


[Закрыть] и случайно выбрали двадцать пять тысяч фрагментов, чтобы получить прочитанные последовательности примерно по пятьсот букв каждая. Применив новый алгоритм, разработанный Грейнджером Саттоном, мы начали составлять величайшую на то время биологическую мозаику, собирая кусочки в исходный геном. В процессе мы разработали несколько новых методов для завершения сборки генома. Каждая отдельная пара оснований генома была точно секвенирована, а двадцать пять тысяч фрагментов аккуратно собраны. Результатом стало то, что 1,8 миллиона пар оснований генома были воссозданы в компьютере в правильном порядке.

Следующим шагом было интерпретировать геном и идентифицировать все составляющие его гены. Будучи первым, кто изучал набор генов живого самовоспроизводящегося организма, я хотел сделать гораздо больше, чем просто представить последовательность. Команда потратила значительное время, выясняя, что говорит набор генов о жизни организма. Что означает тот софт, который программирует структуры и функции жизни? Мы описали наши результаты в статье, которая была быстро принята к публикации в журнале Science и должна была выйти по расписанию в июне 1995 года. Слухи о нашем успехе поползли еще за несколько недель до ее выхода. В результате меня пригласили прочитать президентскую лекцию на ежегодной встрече Американского микробиологического общества, которая проходила в Вашингтоне 24 мая 1995 года, и я принял это предложение с условием, что на сцене ко мне присоединится Хэм. Ожидания стали физически давить на меня, когда президент общества Дэвид Шлезингер из Университета Вашингтона в Сент-Луисе объявил то, что он назвал «историческим событием».