Текст книги "Невидимый страж. Как иммунитет защищает нас от внешних и внутренних угроз"

Глава 16^*
ЕЩЕ КОЕ-ЧТО ОБ АНТИТЕЛАХ

Кроме врожденного и приобретенного клеточного иммунитета у многоклеточных организмов существует древняя защитная система комплемента (именно так, через «е», – не путайте с «комплиментом»). Некоторые ее элементы обнаружены уже у первых беспозвоночных, а значит, появились около 500 млн лет назад.

У человека система комплемента представляет собой комплекс защитных белков, постоянно присутствующих в крови. Белки комплемента связываются с белками или углеводами на поверхности микробных клеток, которые отличаются по химическому составу от собственных клеток организма. Это запускает каскад сложных биохимических реакций и приводит к образованию так называемого мембраноатакующего комплекса, который образует в мембране канал, через который в клетку начинает поступать вода. В результате под действием осмотического давления клетка сначала разбухает, а потом разрывается и погибает. К сожалению, за миллионы лет эволюции многие бактерии научились обходить эту систему, и сейчас древние пути активации комплемента уже не играют такой важной роли в защите нашего организма. Но, подобно тому как кистеперые рыбы напоминают нам о первых шагах позвоночных на суше, так и система комплемента является своего рода живым ископаемым, свидетельствующим о первых эволюционных шагах защитных сил нашего организма.

Впрочем, в организме все идет в дело, и позвоночные смогли встроить древнюю систему комплемента в «новомодную» систему гуморального иммунного ответа. Так, активация этого пути является одним из важных эффектов присоединения антител к поверхности микроорганизмов. Такая связка «система комплемента – антитела» работает гораздо эффективнее, чем древние способы активации комплемента, и служит одним из важных способов защиты от бактериальных инфекций у человека.

Долгие годы ученые были уверены, что антитела всех млекопитающих имеют одну и ту же структуру: две тяжелые цепи Н и две легкие цепи L. Однако в 1993 году группа бельгийских ученых обнаружила в крови представителей семейства верблюдовых (верблюдов, лам, викуний и альпак) антитела, строение которых заметно отличалось от классического. Они имеют уникальную структуру и состоят только из фрагмента одной укороченной тяжелой цепи, а легкие цепи у них вообще отсутствуют.

Такие антитела были названы HCAb (heavy chain antibody). Антигенраспознающий участок HCAb формируется лишь одним вариабельным доменом – VHH (variable domain of the heavy chain antibody). При этом VHH – полностью функциональная молекула, которая способна распознавать и связывать антиген ничуть не хуже, чем вариабельные домены обычных антител. При изоляции VHH-доменов (без константных цепей) они сохраняют способность связываться с антигенами так же, как и обычные антитела. Эти молекулы – самые крошечные из известных белков с аналогичными свойствами, их размер составляет всего 2×4 нм. По этой причине фрагмент HCAb называют наноантитело, нанотело или мини-антитело.

Малые размеры дают этим антителам целый ряд преимуществ. Они легко проникают внутрь органов и тканей, куда классическим антителам из-за их крупных размеров путь закрыт. Кроме того, благодаря структурным особенностям наноантитела способны распознавать в антигенах участки, недоступные классическим антителам.

С точки зрения биотехнологических перспектив важно отметить, что наноантитела более стабильны, чем обычные, при низких и высоких температурах и различных значениях pH. Их проще и экономичнее синтезировать в больших количествах, что важно при производстве лекарств. С ними легко производить разнообразные генно-инженерные манипуляции, к тому же из-за своего малого размера они практически не иммуногенны (не вызывают иммунного ответа в организме человека). Сейчас терапевтический потенциал наноантител исследуется во многих лабораториях по всему миру, включая Россию. На рынке уже появились первые препараты, разработанные на основе наноантител. Среди них, например, каплацизумаб для лечения редкой и опасной болезни крови – синдрома Мошковица, для которого характерна усиленная агрегация тромбоцитов, приводящая к множественному образованию тромбов и нарушению нормального кровообращения.

К сожалению, антительный иммунитет не лишен и некоторых побочных эффектов. Самым опасным, хотя, к счастью, достаточно редким является антителозависимое усиление инфекции (АЗУИ), при котором связывание вируса с не полностью нейтрализующими антителами усиливает его проникновение в клетки инфицируемого организма. Иногда при этом усиливается и репликация вируса.

Лучше всего АЗУИ изучено на примере вируса лихорадки Денге – опасного заболевания, распространенного во многих тропических странах. Как мы знаем, повторное заболевание обычно протекает легче первого (подробнее о механизмах этого явления мы поговорим в главе о вакцинации). Однако в случае Денге дело обстоит ровно наоборот: первое заболевание часто протекает легко, а второе и последующие – тяжело. Когда ученые занялись выяснением механизмов этого явления, оказалось, что в тропических странах распространено несколько серотипов (разновидностей) вируса и повторное заражение, с высокой вероятностью, происходит другим серотипом. Антитела, оставшиеся после первого случая, распознают его лишь «приблизительно», то есть из нейтрализующих они становятся связывающими. Так бывает и при других вирусных инфекциях, например при гриппе, – именно поэтому вакцину против него каждый год разрабатывают заново. Однако в случае с Денге ситуация осложняется тем, что связывающие антитела не только не помогают организму бороться с вирусом, но, напротив, облегчают ему атаку на иммунные клетки организма. Обычно фагоцитирование комплекса «вирус – антитело» сопровождается деградацией вируса, но в случае АЗУИ оно вызывает репликацию вируса внутри клеток фагоцитов (макрофагов, дендритных клеток) и ведет к их гибели. Таким образом, вирус «обманывает» процесс фагоцитоза и использует антитела хозяина в качестве «троянского коня», чтобы проникнуть внутрь иммунной клетки. В результате массовой гибели иммунных клеток, вызванной АЗУИ, вторая встреча с вирусом Денге протекает у больных тяжелее. Именно антителозависимое усиление является причиной того, что эффективная и безопасная вакцина против вируса Денге до сих пор не разработана и геморрагическая лихорадка остается настоящим бичом в тропических регионах.

Глава 17
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА – «ВОЛШЕБНАЯ ПАЛОЧКА» СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ

Ученый всегда стоит на перепутье: с одной стороны, все добытые им сведения – это его интеллектуальная собственность и, возможно, в будущем финансовый успех, с другой – достояние науки. Обмениваться данными или нет? Вот в чем вопрос.

Чарльз Гребер. Открытие

Способность антител специфически связывать различные белки с самого начала казалась ученым весьма многообещающей. Однако все идеи о ее практическом использовании упирались в очень низкую продуктивность любого естественного способа производства этих молекул. Сколько антител способна произвести одна лабораторная мышь, да хотя бы и кролик?.. К тому же довольно быстро стало ясно то, о чем мы говорили в предыдущей главе: разные организмы и даже разные В-клетки одного и того же организма производят разные антитела к одному и тому же веществу. Тот же самый дифтерийный антитоксин – это не один иммуноглобулин, а множество белков, эффективность связывания которых с разными эпитопами дифтерийного токсина неодинакова.

С точки зрения медицинской практики это, возможно, было бы не очень важно. Но в науке во второй половине ХХ века утвердились определенные стандарты, подразумевающие использование «чистых веществ». В данном случае – «чистых антител», а еще точнее, идентичных, то есть моноклональных, антител, которые производились бы потомками (клонами) одной и той же В-клетки. Такие клетки можно было выделить из крови экспериментальных животных и искусственно размножать некоторое время – но, увы, недолго. Как и всяким нормальным клеткам, В-лимфоцитам присущ природный предел делений, называемый еще пределом Хейфлика[6]6
  Предел, или лимит, Хейфлика – максимальное число делений дифференцированных соматических (не половых) клеток. Максимальное число делений клетки зависит от типа клетки (фибробласт, гепатоцит, макрофаг и т. д.), а также от организма, из которого она взята. Для большинства человеческих клеток он равен примерно 50 делениям.


[Закрыть], после которого клетки погибают или, во всяком случае, перестают делиться.

Однако раковые клетки научились обходить естественные ограничения, налагаемые пределом Хейфлика, – они обладают способностью делиться безостановочно. Двум замечательным ученым – Жоржу Кёлеру и Сезару Мильштейну – пришла в голову блестящая идея попробовать соединить здоровые В-клетки, производящие антитела, со злокачественными раковыми клетками. Так появилась на свет гибридомная технология.

Суть ее состоит в следующем. Лабораторное животное (обычно мышь или крысу) иммунизируют чужеродным белком (антигеном), к которому необходимо получить антитела. Затем из селезенки животного выделяют В-клетки, отбирают те, что производят нужные антитела, и с помощью нарушающего мембраны агента сливают их с бессмертными раковыми клетками. Эти гибридные клетки (гибридомы) разделяют и помещают по одной на питательную среду. Клетки, получившиеся в результате деления в каждой из них, будут потомками одного и того же гибридома, то есть клонами, и станут производить моноклональные (идентичные) антитела. Затем среди десятков получившихся клеточных линий ученые отбирают ту, чьи антитела лучше всего решают поставленную задачу (например, наиболее полно блокируют активность исходного белка), и дальше запускают ее в промышленное производство.

Коммерческие перспективы гибридомной технологии были очевидны с самого начала, и Жоржу Кёлеру и Сезару Мильштейну предлагали ее запатентовать. Ученые, вероятно, стали бы богаче Билла Гейтса, если бы приняли это предложение. А оно «проталкивалось» на самом высоком уровне. Сама Маргарет Тэтчер – «железная леди» Великобритании – высказала крайнее недовольство, когда британская компания National Research Development Corporation (NRDC) не смогла запатентовать эту технологию, ведь такой патент мог буквально озолотить британскую экономику.

Однако ученые опубликовали результаты своих исследований в общедоступном научном журнале и тем самым предоставили свободный доступ к ним всем желающим. И никогда не пожалели о своем решении. Мильштейн однажды прямо сказал назойливому журналисту, докучавшему ему вопросами об упущенных возможностях: «Нет, я не был несчастен, Маргарет Тэтчер – была». Прекрасная, практически рождественская история о научном бескорыстии и идеализме.

В 1984 году открытие Жоржа Кёлера и Сезара Мильштейна было отмечено Нобелевской премией с формулировкой «за открытие и разработку принципов выработки моноклональных антител с помощью гибридом».

В наши дни гибридомная технология позволяет производить любые необходимые антитела в промышленных масштабах. Конечно, эти лекарственные препараты никогда не будут такими же дешевыми, как условный «аспирин», но с каждым годом они становятся все более доступными широкому кругу людей. Использование моноклональных антител настолько многообразно, что ему можно было бы посвятить отдельную (и очень немаленькую) книгу. Однако я проиллюстрирую мощь этой технологии лишь одним примером из прикладной фармацевтики и несколькими из фундаментальной науки. Впрочем, в этой книге мы еще не раз будем говорить о том, как используются моноклональные антитела в иммунологии и медицине.

Большой проблемой молекулярной биологии долгие годы было выделение и очистка индивидуальных белков. В наши дни с помощью антител эта проблема решается просто и элегантно. Закажите в компании, производящей реактивы, антитела к белку, который вас интересует (или воспользуйтесь уже существующими, если речь идет о «популярном» белке вроде р53). А дальше просто забросьте в раствор «удочку» с этим антителом и «поймайте» нужный белок. Этот метод, названный иммунопреципитацией, далеко продвинул молекулярную биологию.

Второй вариант использования антител – «подсвечивание» интересующих нас клеток. На антитело можно навесить разные флуоресцентные (светящиеся) метки или красители. Тогда антитело к белку А будет светиться, скажем, желтым, а антитело к белку В – зеленым. Теперь представьте, что А и В – это не просто белки, а рецепторы, специфичные для определенных типов клеток, например В– и Т-лимфоцитов. Тогда первое антитело будет налипать только на В-клетки, а второе – только на Т-клетки. В результате под микроскопом эти два типа клеток будут светиться разными цветами. На этом подходе основаны две лабораторные технологии – иммуногистохимия и метод проточной цитометрии.

Иммуногистохимия позволяет нам точно идентифицировать разные клетки в тканях. Например, при биопсии распознать опухолевые клетки среди нормальных, чтобы понять стадию развития онкологического заболевания. Проточная цитометрия дает возможность автоматизировать процесс подсчета и сортировки разных типов клеток. Использование иммунных методов сделало классификацию клеточных типов более точной, например позволило различать под микроскопом те клетки, что выглядят одинаково, но обладают разными биологическими свойствами.

Представьте себе инопланетянина, который, изучая нашу планету и наблюдая исключительно одетых людей, определил их всех как «человеки». При этом у него, естественно, сразу возникло множество вопросов. Почему одни человеки таскают человеческих личинок на руках чаще, чем другие? Как объяснить, что одни человеки при встрече целуются, а другие лишь пожимают друг другу руки? И так далее… А потом ему наконец доставили генетические образцы с Земли, и он увидел, что человеки, оказывается, бывают двух генетических типов – ХУ (человеки-мужчины) и ХХ (человеки-женщины) – и у них совершенно разные репродуктивные роли. Разумеется, эта информация сразу объясняет множество явлений социальной и личной жизни земных человеков.

Примерно такое же прозрение наступило у биологов, когда с помощью иммунологических методов они смогли начать делить клетки на подтипы. Но каким бы важным ни было использование моноклональных антител в биологии, их рынок для лабораторного использования составляет лишь ничтожную долю от общего количества. Основной объем производимых антител – это лекарства, которые смогли победить болезни, до того считавшиеся неизлечимыми.

Глава 18
ЛЕКАРСТВА НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ. «ГЕРЦЕПТИН». ГУМАНИЗАЦИЯ АНТИТЕЛ

Спасая других, мы спасаем себя.

Мультсериал «Звездные войны: Войны клонов» (Star Wars: The Clone Wars)

Открытие технологии получения моноклональных антител произвело настоящую революцию в фармакологии. Многие заболевания, особенно онкологические, связаны с нарушением межклеточных взаимодействий, за которые отвечают лиганды и рецепторы. Получив антитела к этим молекулам, можно воздействовать на разные сигнальные пути и корректировать их активность. Обычно приходится блокировать слишком активные сигнальные пути с помощью антител-антагонистов. Однако существует технология получения и антител-агонистов, которые, связываясь с рецепторами, активируют их. При этом антитела фактически играют роль искусственных лигандов, но более эффективных и стабильных, чем лиганды естественные. Такой подход используют, когда болезнь связана со сниженной активностью какого-то важного сигнального пути.

Сегодня рынок препаратов на основе моноклональных антител исчисляется десятками миллиардов долларов и продолжает расти. В качестве примера такой истории успеха хотелось бы привести историю разработки препарата «Герцептин» (трастузумаб), спасшего за последние десятилетия десятки, если не сотни тысяч жизней.

Как известно, самым распространенным онкологическим заболеванием у женщин является злокачественная опухоль молочной железы, в просторечии рак груди. Пока единственным способом его лечения оставалось хирургическое вмешательство, такая примитивная классификация опухолей (по месту локализации) вполне удовлетворяла медиков. Однако с появлением и бурным развитием химиотерапии врачам стало очевидно, что этого недостаточно. Внешне похожие опухоли демонстрировали различную чувствительность к лечению, разную частоту рецидивов и скорость роста. Стало понятно, что рак груди – это не одно заболевание, а целая группа. Развитие молекулярно-биологических методов позволило изучать опухоли на молекулярном уровне. На сегодняшний день онкологи выделяют по меньшей мере пять подтипов «рака груди», каждый из которых требует специфического лечения.

Один из наиболее агрессивных вариантов опухоли молочной железы связан с нарушениями в гене HER2. Этот ген кодирует мембранный белок, рецептор для факторов роста – молекул, управляющих клеточным делением. В норме в каждой клетке две копии этого гена (в 17-й паре хромосом, одна из которых от отца, другая от матери), однако в раковых клетках он часто амплифицирован и присутствует в десятках копий. В результате клетки с такой генетической перестройкой синтезируют в несколько раз больше этого рецептора, чем здоровые клетки молочной железы.

Клетки, синтезирующие небольшое количество рецептора HER2, делятся лишь изредка и сохраняют чувствительность к сигналам (от других рецепторов), блокирующим деление, то есть следуют «правилам внутреннего распорядка» организма. Раковые клетки, синтезирующие патологически много HER2, делятся как сумасшедшие и теряют чувствительность к сигналам, останавливающим этот процесс. Они буквально выходят из-под контроля. Опухоли с высоким уровнем HER2 агрессивны и малочувствительны к стандартной химиотерапии. Однако тот факт, что данный онкомаркер является рецептором, делал эту разновидность рака перспективным кандидатом для лечения с использованием антител. За разработку такого лекарства в 1980-х годах взялась американская фармацевтическая компания Genentech.

В 1989 году ученые из Genentech усовершенствовали процесс получения и очистки мышиных антител к человеческому белку HER2. Однако до создания лекарства было еще далеко. Не забывайте, что мышиные антитела (как и любые другие мышиные белки) – это чужеродные для человеческого организма молекулы. Являясь в нашем организме антигенами, они вызовут иммунный ответ и будут нейтрализованы «нормальными» (собственно человеческими) антителами. Так что лекарства из них не выйдет.

Чтобы предотвратить подобную реакцию, мышиное антитело следовало преобразовать в белок, более сходный с обычными человеческими антителами. «Этот процесс, выразительно называемый очеловечиванием антител, представляет собой столь же тонкое и деликатное искусство, что и перевод романа на иностранный язык» – так красноречиво охарактеризовал этот этап разработки лекарства американский онколог Сиддхартха Мукерджи в своей книге «Царь всех болезней. Биография рака»[7]7
  Мукерджи С. Царь всех болезней. Биография рака. – М.: Neoclassic: АСТ, 2013.


[Закрыть].

Суть очеловечивания, или, как еще говорят, гуманизации, антител заключается в том, чтобы в гене антитела по максимуму заменить мышиную последовательность нуклеотидов человеческой, сохраняя при этом в неприкосновенности вариабельную часть, отвечающую за распознавание антигена. Схематически этапы этого пути показаны на рисунке. Итоговое антитело получило название трастузумаб – окончание «зумаб» указывает на то, что это антитело больше чем на 90 % идентично человеческому белку и лишь 10 % последовательности в нем остались от первоначального мышиного белка.

В 1992 году начались клинические испытания препарата на пациентках, чьи опухоли синтезировали повышенное количество белка HER2 (это легко определялось методами гистохимии по образцам биопсии). Исследования продолжались несколько лет. Лишь в 1998-м Genentech обнародовал их результаты на встрече членов Американского общества клинической онкологии, а в 2003 году трастузумаб начали широко использовать в терапии. Таким образом, для практической реализации научной идеи потребовалось более 15 лет напряженной работы многих сотен людей – от исследователей, выделявших спленоциты из селезенки мышей, до врачей, проводивших клинические исследования в госпиталях.

Эффект «Герцептина» (под таким коммерческим названием трастузумаб поступил в продажу) связан с его воздействием сразу на несколько сигнальных путей. С одной стороны, блокируя HER2-рецептор, это лекарство прерывает бесконечный цикл клеточных делений в раковых клетках. С другой – привлекает иммунные клетки с Fc-рецепторами, и они начинают атаковать опухоль. С третьей – блокирует рост кровеносных сосудов, которые необходимы, чтобы обеспечивать опухоль кислородом и питательными веществами.

Не выдерживая такой множественной атаки, опухоль начинает сокращаться в размерах, а потом и вовсе исчезает. Зачастую бесследно. Во всяком случае, многие пациентки, принимавшие участие в первых клинических испытаниях «Герцептина», живут и здравствуют и поныне – притом что первоначальный диагноз не обещал им больше пары лет, а то и нескольких месяцев жизни.

«Герцептин» был лишь одной из первых ласточек. За последние два десятилетия на рынок вышли десятки препаратов на основе моноклональных антител. С их помощью борются с самыми разными заболеваниями – от меланомы до ревматоидного артрита, от лимфомы до патологических процессов в сетчатке глаза, приводящих к слепоте. Перспективы развития терапии на основе моноклональных антител выглядят вдохновляющими, однако у этого метода есть свои ограничения. Антитела эффективны там, где речь идет о лигандах и рецепторах (или других доступных белках), однако они бессильны, если молекулярная поломка произошла в белках, работающих внутри клетки.

Моноклональные антитела, вероятно, никогда не смогут полностью заменить традиционные лекарственные препараты – небольшие молекулы, способные проникать через плазматическую мембрану. Но этого и не нужно. Довольно того, что они значительно расширили наши возможности противостоять многим тяжелым и опасным заболеваниям, в том числе и связанным с иммунной системой. В этой книге мы еще неоднократно будем говорить о разных вариантах иммунотерапии на основе моноклональных антител.