Текст книги "Неандерталец. В поисках исчезнувших геномов"

Тем временем в Загреб пришло письмо о сотрудничестве, подписанное профессором Штоком от имени Берлинской академии наук, – это было официальное выдвижение неандертальского проекта. К формальному письму прилагалось письмо и от меня. Павао Рудан, к которому обратилась за консультацией хорватская сторона, предложил несколько условий сотрудничества: по крайней мере один хорватский соавтор должен участвовать в каждой публикации по коллекции из Виндии; Хорватская академия должна быть поименована в разделе “Благодарности”; нам надлежит приглашать двух хорватских ученых в Лейпциг каждый год до тех пор, пока проект не закроется. Я согласился со всеми положениями и добавил, что мы, от лица Берлинской академии, поддержим составление каталога коллекции из Виндии.

На все эти переговоры ушло время. Лето перешло в осень, осень превратилась в зиму. Я запрашивал образцы из других неандертальских местонахождений, особенно из тех, где по результатам предыдущих исследований в костях сохранилась ДНК. Начать, естественно, следовало с самой долины Неандерталь, где нашли первого неандертальца в 1856 году. Ту пещеру раскопали не ученые, а рабочие каменоломни, которые просто складывали кости по мере того, как находили их. С тех пор и пещеру, и холм, в котором была пещера, срыли при выработке известняка. Множество костей из того местонахождения затерялось в отвалах. Но за несколько лет до описываемых событий у Ральфа Шмитца, с которым мы занимались изучением первого, “типового”, образца, появилась сумасшедшая, но восхитительная идея: поискать потерянные кости. Тщательно изучив старые карты и исходив пешком всю долину Неандерталь – и в изрядной мере прислушиваясь к интуиции, – он таки нашел то место, куда 150 лет назад свозили пустую породу и всякий мусор из каменных разработок. Теперь эту площадку частично занимали гараж и автомастерская. Ральф начал раскопки, и его усилия увенчались успехом: он не только нашел кости, принадлежавшие тому “типовому” индивиду, но и отыскал остатки второго индивида. В 2002 году мы выделили мтДНК из этого второго индивида и опубликовали результаты в соавторстве с Ральфом[52]52
  R.W. Schmitz et al. The Neanderthal type site revisited: Interdisciplinary investigations of skeletal remains from the Neander Valley, Germany. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99, 13342–13347 (2002).


[Закрыть]. Йоханнес достал с дальней полки остатки костной ткани от тех опытов и сделал новые вытяжки. Затем проанализировал их более современными методами, пытаясь выделить ядерную ДНК вдобавок к митохондриальной. Результаты оказались неутешительными. Экстракты содержали 0,2–0,5 процента неандертальской ДНК – недостаточно для составления генома.

На Кавказе в пещере Мезмайская вели раскопки два археолога из Санкт-Петербурга, Любовь Голованова и Владимир Дороничев. Им попался скелет неандертальского ребенка. Ребенка, по-видимому, специально похоронили, так как все кости были в целости и не сдвинуты. Этот скелет отличало от остальных находок кое-что еще: возраст большинства неандертальских костей, которые попадают к нам на анализ, примерно 40 тысяч лет, а этому было от 60 до 70 тысяч. Любовь и Владимир приехали к нам и привезли часть ребра на анализ, и еще они привезли фрагмент черепа неандертальца, найденного в верхних слоях раскопа. Йоханнес приготовил экстракты и получил по содержанию 1,5 процента неандертальской ДНК из экстракта ребра. Мы, конечно, рассчитывали на большее; к тому же ребро было таким крошечным, что нечего было даже надеяться выделить достаточное количество ДНК для составления генома. Но тем не менее кое-какую информацию опыты с ребром принесли.

Третье интересное для нас местонахождение находилось на северо-западе Испании, в Астурии, и называлось Эль-Сидрон. Я съездил туда в 2007 году. Если в детстве мечтаешь стать палеонтологом, то в воображении рисуешь именно такое место. Вокруг Эль-Сидрона великолепные пейзажи, а вот и сама пещера – с таинственным маленьким незаметным входом. В ней веками люди укрывались от всяких напастей. Таков Эль-Сидрон. Перед входом стоит памятник испанскому солдату, который прятался здесь и был убит фашистами во время гражданской войны. Если на четвереньках протиснуться через этот узкий вход и пройти две сотни метров вглубь и вправо, то попадаешь в обширную – двадцать четыре на двенадцать метров – боковую галерею. Именно там каждое лето проводят раскопки профессор Марко де ла Расийя и его коллеги и студенты из Университета Овьедо. Им посчастливилось найти кости нескольких неандертальцев – младенца, ребенка, двух подростков и четырех молодых людей. Длинные кости были раздроблены и с многочисленными царапинами. Только кости рук располагались в ожидаемом порядке, будто бы отделенные от тела и отброшенные в сторону. Марко де ла Расийя считает, что кости выбросили в пруд где-то в стороне от пещеры – это произошло примерно 43 тысячи лет назад – и потом вода смыла кости в пещеру.

Каждое лето на этом месте находят новые кости, и мы договорились, что поднимать из земли их будут таким образом, чтобы по возможности не заносить современную ДНК и максимально сохранить ДНК неандертальцев. Под руководством Карлеса Лалуеса-Фокса, молекулярного биолога из Барселоны, и Антонио Росаса, антрополога из Музея естественных наук в Мадриде, рабочие на раскопе обрядились в стерильные перчатки, стерильные балахоны, надели маски на лицо – в общем, оделись так, как мы у себя в “чистой комнате”. Подняв кости, подходящие для экстрагирования, они складывали их в ящик со льдом. В лаборатории Антонио в Мадриде все кости снимали на томографе, чтобы задокументировать их морфологические особенности. Затем в том же замороженном состоянии их отсылали в Лейпциг. Практически никто не прикасался к ним с момента находки, развитие бактерий на них тоже должно было быть минимальным. Я возлагал большие надежды на эти кости, но когда Йоханнес провел все эксперименты, оказалось, что они содержат только 0,1–0,4 процента ДНК неандертальцев. Ни в одном местонахождении – а я, кроме вышеописанных, связался со многими другими, и результат был еще хуже – не нашлось достаточно ДНК, чтобы составить геном неандертальца. Похоже, подходящая кость есть только в Виндии, только в ней сохранилось более или менее адекватное количество ДНК. А в Загребе дела двигались со скоростью черепахи, если вообще двигались.

Одно событие все-таки нас порадовало. К концу лета 2006 года в лабораторию прибыл талантливый хорватский аспирант Томислав Маричич. Томи сопровождал нас в прошлый наш визит в Институт четвертичной палеонтологии и геологии; его местные связи очень нам помогли во время переговоров. Наш проект стал темой публичного обсуждения – хорошо, что Томи переводил мне газетные статьи, так что я был в курсе дела. В июле, после пресс-конференции в Лейпциге, на которой проект “Неандертальский геном” был официально объявлен, большая газета Jutarnji List взяла интервью у Якова Радовчича. В газете он изображался как “человек, без которого невозможно представить исследование неандертальцев”. Вот его слова: “Следует спросить: а в чем же все-таки цель исследования? Кроме того, неясно, можно ли в принципе прочитать геном неандертальца… Ведь они используют химически агрессивные методы, разрушающие материал, а материал слишком ценен, чтобы просто так им пожертвовать”. В ноябре та же газета опять его процитировала: “Три с половиной месяца назад Сванте Пэабо приезжал в Загреб в поисках образцов для молекулярного генетического анализа… Я, однако, считаю, что мы должны бережно относиться к образцам и сохранить их для будущих поколений исследователей”.

Все эти замечания заставили меня послать Якову длинный вежливый имейл, в котором я еще раз подробно разъяснил проект. Он ответил, что, уладив некоторые формальности с коллекцией, которые могут занять “от нескольких недель до нескольких месяцев”, он намерен оказать нам “полную поддержку”. В Загребе вокруг проекта ходили всякие слухи. Я раздражался, так как не мог понять, кто нас поддерживает, кто воюет против, кто что кому сказал, должен ли я верить тому, что мне говорят в лицо. Положиться без раздумий я мог только на Павао Рудана и двух его друзей из Академии наук и искусства. Одного звали Желько Кучан. Он был ученым государственного масштаба; пятьдесят лет назад он запустил науку об исследовании ДНК в университете Загреба. Другой – геолог Иван Гушич, Джонни для друзей. Веселый, оптимистичный, всегда дружелюбный, он вскоре встал во главе Института четвертичной палеонтологии и геологии (рис. 12.2).

В конце ноября, воспользовавшись выходом в свет наших статей в Nature и в Science, Павао решил поддержать проект публично. Он написал статью в воскресный выпуск крупной хорватской газеты Vjesnik. В статье говорилось, что исследования ДНК могут поведать много нового об эволюции человека и что материал из Виндии является существенным звеном исследований. “Таким образом, сотрудничество с коллегами из Общества Макса Планка необходимо продолжать и всемерно укреплять, – гласила статья. И далее: – Именно с помощью образцов из Виндии, хранящихся в нашей академии, можно впервые в истории получить геном гоминида эпохи плейстоцена… Будущее сотрудничество между нашей академией и Берлинской, особенно с группой Сванте Пэабо, значительно продвинет вперед палеоантропологию, молекулярную генетику и антропологию”. Я очень надеялся, что наши труды со временем докажут, что Павао верил в нас не напрасно.

Медленно-медленно колесо хорватской бюрократии поворачивалось в нашу пользу. Восьмого декабря 2006 года после множества проволочек, для меня в основном непостижимых, был подписан меморандум о соглашении между Хорватской и Берлинской академией наук. Я прямо не верил! Наконец-то дорога к вожделенным костям расчищена! При первой же возможности я организовал поездку в Загреб. Поехали мы с Йоханнесом и Кристин Верна, молодой француженкой, палеонтологом из отдела эволюции человека в нашем институте в Лейпциге. Ей предстояло провести в Институте четвертичной палеонтологии и геологии десять дней и составить предварительный каталог костей неандертальцев из коллекции Виндии.

Рис. 12.2. Павао Рудан, Желько Кучан и Иван “Джонни” Гушич, трое членов Хорватской академии наук, которые помогли нам с образцами неандертальских костей из пещеры Виндия. Фото: Павао Рудан, HAZU

Мы с Йоханнесом пробыли в Загребе четыре дня и вернулись в компании Павао, Желько и Джонни, а у Джонни в чемоданчике лежали стерильные упаковки с восемью вожделенными костями, и среди них знаменитая Vi-80, теперь официально переименованная Vi-33.16 (рис. 12.1).

Мы прибыли в Лейпциг поздно вечером. А с утра первым делом отнесли кости к нам в отдел эволюции человека, где их, не вынимая из упаковок, просканировали на томографе – теперь их морфологическое строение навечно зафиксировано в электронном виде. А потом в игру вступил Йоханнес и забрал кости в “чистую комнату”.

Рис.12.3. Отбор проб из неандертальской кости стерильным буром. Фото: MPI-EVA

С помощью стерильного зубоврачебного сверла он удалял два-три миллиметра поверхности с каждой из костей. Затем сверлил маленькую дырочку до плотной внутренней части кости. Ему приходилось часто останавливаться, чтобы сверло не нагрелось и чтобы из-за нагрева не потерять потенциальную ДНК (рис. 12.3). Ему требовалось примерно 0,2 грамма костного материала; этот материал опускался в раствор, который в течение нескольких часов растворял и связывал костный кальций. От кости оставались комочки белков и других неминеральных компонентов, ДНК же попадали в раствор, то есть в жидкую часть смеси. Йоханнес изолировал молекулы ДНК, соединяя их с кремнием – этот метод четырнадцать лет назад с успехом применял Матиас Хёсс для выделения ДНК из древних костей.

Чтобы подготовить молекулы ДНК для секвенирования по методу 454, Йоханнесу нужно было с помощью определенных ферментов убрать раскрученные и одиночные кусочки нитей ДНК на концах. Потом, используя следующий фермент, он пришивал к концам древних фрагментов специально синтезированные короткие отрезки современной ДНК, так называемые адаптеры. С присоединенными адаптерами отдельные фрагменты ДНК можно было “читать” на секвенаторе, как книгу; коллекция таких прочтенных “книг” складывалась в библиотеку. Адаптеры специально синтезировали для нашего проекта: они содержали короткую последовательность из четырех оснований, ТГАЦ, и эта цепочка должна была оказаться на стыке синтезированной и древней ДНК и служить своеобразным маркером искомых фрагментов. Это была одна из тех незаметных технических мелочей, которые часто играют огромную роль в продвижении молекулярной биологии в целом и в области исследования палео-ДНК в частности. Мы применили эти маркеры, так как наши библиотеки древних ДНК должны в какой-то момент покинуть чистые помещения и отправиться на секвенаторы 454. Чтобы наверняка быть уверенными, что ДНК из других библиотек, с которыми мы работаем в лаборатории, не попали в неандертальские библиотеки, мы будем обращать внимание только на те последовательности, которые начинаются с ТГАЦ. Идею адаптеров мы разработали и опубликовали в 2007 году[53]53
  A.W. Briggs et al. Patterns of damage in genomic DNA sequences from a Neanderthal. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 104, 14616–14621 (2007).


[Закрыть] .

Проведя все эти процедуры, Йоханнес приготовил вытяжки из восьми новых костей из Виндии. Затем он прогнал экстракты через ПЦР, чтобы проверить содержание неандертальской мтДНК и уровень зараженности современной ДНК. Почти во всех костях он нашел неандертальскую мтДНК. Это вдохновляло, но после всех разочарований с костями из России, Германии и Испании я придерживал свой энтузиазм. Мы немедленно отсеквенировали случайную выборку фрагментов ДНК из каждой библиотеки, чтобы оценить долю ядерной неандертальской ДНК. Процесс этот занял несколько дней, и пока мы ждали результата, я едва мог сосредоточиться на чем-то другом и заниматься остальными проектами. Мы же сказали во всеуслышание по всему миру, что составим неандертальский геном. И если в костях из Виндии недостаточно ядерной ДНК, то придется столь же громко объявлять о неудаче. Я не знал, где еще искать кости, лучших не было.

И вот перед нами результаты. Некоторые кости содержали от 0,06 до 0,2 процента ядерной ДНК, так же как и в остальных местонахождениях. Но в трех костях мы нашли 1 процент, а в одной почти 3 процента ядерной ДНК! Эта одна и есть знаменитая Vi-33.16, бывшая Vi-80. Мы не отыскали “волшебную косточку” с сохранной ядерной ДНК, но с тем, что у нас есть, можно было работать.

Итак, не все потеряно!

Глава 13
Дьявол в деталях

Новогодние каникулы я провел в размышлениях: дела наши шли отнюдь не блестяще. Подсчитав, сколько нам потребуется костного материала, чтобы отсеквенировать полный геном, я получил десятки граммов. Столько не весили все имеющиеся у нас кости. Я чувствовал себя ужасно. Неужели я настолько безнадежный оптимист или просто сверх меры наивен? Что за идиотизм – верить в существование кости с бóльшим содержанием ДНК, чем в той первой кости из Виндии… Или я слишком понадеялся на 454, что она волшебным образом вытащит из рукава сверхмощную методику прочтения ДНК… Зачем я так лихо рискнул спокойствием и размеренной научной жизнью? Теперь я всего этого запросто могу лишиться.

Те двадцать пять лет, которые пришлись на мою работу в молекулярной биологии, были временем безостановочной технической революции. Те задачи, которые требовали в мои студенческие годы дней и недель изнурительного труда, теперь превратились в несложную процедуру: секвенаторы, пришедшие на современный рынок, выполняют ее за одну ночь. Трудоемкое и кропотливое бактериальное клонирование сменилось ПЦР, с помощью которой за несколько часов достигается результат тех прошлых многонедельных или многомесячных стараний. Вероятно, из-за этого я так легко решил, что за год-два мы сможем секвенировать в три тысячи раз быстрее, чем раньше, когда анализировались результаты для нашей концептуальной статьи в Nature. Действительно, с чего бы технологической революции останавливаться? За годы работы я усвоил, что в обычном случае, если речь не идет о сверхгениях, прорывы случаются, когда используются новейшие технологические достижения. Но это вовсе не означает, что мы должны становиться пленниками технологий и ждать, когда какое-нибудь изобретение чудесно разрешит наши трудности. Мы ведь можем немножко подсобить технологиям.

Я рассуждал так: если у нас мало костного материала и если в них ничтожное количество ДНК, то нужно хотя бы снизить потери ДНК на пути от экстракта к библиотеке. И после каникул на пятничном собрании я постарался донести до нашей группы чувство глубочайшего кризиса, в котором мы оказались. Я сказал, что на волшебную кость с кучей ДНК не осталось надежды и ничто чудесным образом нас не спасет. Мы должны использовать только то, что имеем, а это значит – заново переосмыслить каждый шаг лабораторных манипуляций. Например, что мы делаем при очистке ДНК-содержащих растворов? Ведь белков и других веществ в этих растворах совсем чуточка, а цена очистки – потеря большой доли ДНК. Если как-то минимизировать эти потери, то нам, может, и хватит имеющихся костей, и мы тогда дотянем до выпуска новых технологий 454.

Я неделю за неделей переспрашивал своих сотрудников, как именно они выполняют каждый из этапов работы с костями. Этот способ задавать один и тот же вопрос снова и снова я извлек из своего полузабытого юношеского прошлого, когда на военных сборах в Швеции нас учили допрашивать заключенных. И чем больше я спрашивал, тем больше приходил к убеждению, что при тщательной очистке вытяжек, предписанной протоколом 454, мы, по-видимому, теряем непомерно большую часть ДНК. И продолжал настаивать на осмыслении каждого шага этого протокола. А что еще оставалось делать?

В мои студенческие годы в молекулярной биологии вовсю использовались радиоактивные метки. Но потом во избежание обременительных мер предосторожности молекулярные биологи перешли к нерадиоактивным стратегиям. Потому теперешние студенты практически не имеют опыта работы с радиоактивными включениями. Однако при этом радиоактивные метки остаются наиболее чувствительным методом обнаружения даже ничтожного количества ДНК. И вот на одном из наших пятничных собраний я предложил Томи Маричичу пометить небольшое количество ДНК радиоактивным фосфором и использовать раствор для приготовления отсеквенированной библиотеки. А раствор с остатками ДНК, которые в обычных случаях выбрасываются, можно измерить на радиоактивность. Уровень радиоактивности покажет, сколько ДНК из раствора не пошло на секвенирование. Таким образом, можно напрямую измерить уровень потерь при очистке вытяжек.

Мой план, когда я изложил его на пятничном собрании, был встречен молчанием. Я сначала подумал, что все просто замерли в молчаливом восхищении перед изяществом и простотой моего решения. Но на самом деле в своем бездумном натиске я не принял во внимание, как живет моя группа. В подобном устройстве жизни кроется реальная сила исследовательской группы, но временами оно же оборачивается не на пользу делу. У нас принято было обсуждать любую идею, каждый мог свободно высказывать свое мнение, и в результате на собраниях мы приходили к общему решению, что и как нужно сделать. Но, как и в любой демократии, временами берут верх неразумные решения. На том собрании некоторые выказали решительный скептицизм. К их мнению в группе тогда прислушивались. К моему плану предъявили ряд претензий, вызванных, по-моему, подсознательным страхом перед малознакомыми методиками, к тому же старомодными и небезопасными, и вообще жуткими. Я решил не торопить события. Сначала обратиться к другим методам – попробовать оценить, сколько ДНК остается после каждой процедуры приготовления библиотек, и испытать новую технику для ПЦР. Но все это оказалось бесполезным – обычные методы показали слабую чувствительность или не годились по другим причинам.

Месяц за месяцем я продолжал настаивать на радиоактивном эксперименте, мое нетерпение росло, и я уже страстно жалел об ушедших временах автократии, когда слово профессора было законом. Но, стиснув зубы, соглашался, не желая разрушать атмосферу свободного обмена мнениями, которая, на мой взгляд, очень важна для дела.

И вот, когда все остальные способы были испробованы и отброшены, группа скрепя сердце согласилась. Томи неохотно заказал радиоактивный фосфор, пометил некоторое количество обычной человеческой ДНК, которую мы использовали для проверочных опытов, и потом проделал все процедуры по приготовлению вытяжек для секвенирования по 454. Результат получился ошеломительным. Он показал, что на первых трех этапах теряется от 15 до 60 процентов ДНК. Для биохимических процедур такой уровень потерь в принципе ожидаем. Но на последнем этапе, когда с помощью сильных щелочей разделяются комплементарные нити ДНК, потери против изначального количества достигают более 95 процентов. Естественно, для тех, кто работает с современной ДНК, все эти потери не имеют значения – материала у них полным-полно, так что даже 95– процентная потеря незаметна. А вот при работе с древностями она оборачивается полной катастрофой. Но раз проблема выявлена, то и решение нашлось. Чтобы разделить ДНК на одиночные нити, годятся не только щелочи. ДНК можно просто нагреть. Томи испробовал этот метод и обнаружил, что выход полученного для секвенирования раствора в 10–250 раз выше, чем при воздействии щелочами! С такими картами можно продолжать игру.

В большинстве лабораторий растворы после секвенирования выливают. А мы, к счастью, к этому большинству не относились. По моему настоянию мы сохраняли вытяжки от всех экспериментов – вдруг что новое изобретут, и они вновь пригодятся. Наверное, эта моя идея была наименее популярна среди лабораторного народа. В лаборатории стояли унылые ряды холодильников, забитые замороженными остатками экстрактов, и никому в голову не приходило, что они когда-либо будут использованы. Но спасибо нашим обстоятельствам – навязчивая идея профессора была реабилитирована. Теперь Томи оставалось только подогреть образцы растворов прошлых экспериментов с костями из Виндии и получить новые неандертальские ДНК, и относительно много, и без затрат на рутинные процедуры экстрагирования. Он так или иначе усовершенствовал и другие этапы приготовления библиотек. И в результате выработал пошаговую методику от костных вытяжек до растворов для секвенирования, в сотни раз более эффективную, чем прежние[54]54
  T. Maricic and S. Pääbo. Optimization of 454 sequencing library preparation from small amounts of DNA permits sequence determination of both DNA strands. BioTechniques 46, 5157 (2009).


[Закрыть].

После обсуждения деталей проекта с хорватскими партнерами мы остановились на трех костях из Виндии – Vi-33.16 и двух других, Vi-33.25 и Vi-33.26. Все они, по-видимому, представляли собой осколки длинных костей, раздробленных, чтобы добраться до костного мозга (см. рис. 12.1). Благодаря усилиям Томи у нас появилась надежда получить только из этих костей 3 миллиарда нуклеотидов неандертальского генома. Но нельзя забывать, что в наших библиотеках по-прежнему содержалось не меньше 97 процентов бактериальной ДНК. Поэтому для команды из Брэнфорда путь до этой цифры – 3 миллиарда нуклеотидов – составлял от четырех до шести тысяч циклов секвенирования. Убедить Майкла Эгхольма выполнить такой объем работы даже думать не стоило.

Мне казалось, что мы намертво застряли, когда кто-то предложил поискать в трех хорватских костях “карманы” – области, в которых меньше бактериальной ДНК и, соответственно, больше неандертальской. Мы и раньше замечали, что в костях есть участки с большим или меньшим содержанием ДНК – вероятно, одни микрообласти казались бактериям более пригодными для роста, чем другие, и потому там бактерии размножались более интенсивно. Мысль обнадеживала, и Йоханнес принялся сверлить кости, чтобы найти наилучшие микрообласти. Он сверлил и сверлил – сначала кости стали похожи на флейту, затем на швейцарский сыр. Действительно, в некоторых участках мтДНК было в десять раз больше, чем в других, отстоящих на какой-то сантиметр. Но все равно – 4 процента неандертальской ДНК и не больше.

Рис. 13.1. Команда “Неандертальского генома” в Лейпциге, 2010 г. Слева направо: Эдриан Бриггс, Эрнан Бурбано, Матиас Мейер, Аня Хайнце, Джесс Дэбни, Кай Прюфер, я, реконструкция неандертальского скелета, Дженет Келсо, Томи Маричич, Цяомэй Фу, Удо Штенцель, Йоханнес Краузе, Мартин Кирхер. Фото: MPI-EVA

Снова и снова мы возвращались к этой проблеме на наших пятничных собраниях. Там, на мой взгляд, концентрировался весь научный и социальный опыт: аспиранты и молодые специалисты знали, что их будущее, их карьера зависят от полученных результатов и публикаций. Поэтому они хитроумно изыскивали возможности провести ключевые эксперименты и вместе с тем избежать экспериментов дополнительных, связанных с общими нуждами, которые вряд ли войдут в громкие публикации с их авторством. Я смирился с мыслью, что начинающим ученым движут эгоистичные побуждения, и своей задачей видел соблюдение тонкого баланса между личными карьерными интересами молодого специалиста и общелабораторной линией и взвешивал всякий раз индивидуальные возможности каждого. Но когда неандертальский кризис накрыл нас с головой, я был восхищен, с какой легкостью личные интересы уступили групповым. Группа сплотилась в единое целое, где каждый, не ожидая награды и славы, рвался выполнить любое трудоемкое дело, только бы хоть немножко продвинуть проект. Царило чувство единения во имя общей цели, и все без исключения видели в ней великое, историческое предприятие. Я чувствовал, что собрал превосходную команду (рис. 13.1). Иной раз в приступе сентиментальности я ощущал любовь ко всем присутствующим и к каждому персонально. Из-за этого безрезультатность наших попыток казалась еще горше.

На пятничных собраниях весной 2007 года наша сплоченная группа показала себя с наилучшей стороны. Люди вбрасывали идею за идеей, одна безумнее другой, как увеличить долю неандертальской ДНК или найти “карманы” с наибольшим ее содержанием. Невозможно сказать, чья идея в конце концов сыграла, потому что мысли рождались на глазах, по ходу живейшего обсуждения, где все говорили и все принимали участие. Мы стали обсуждать, нельзя ли как-то отделить бактериальную ДНК от всего остального. Может, у бактериальной ДНК есть какое-то свойство, на которое можно нацелиться и оно сработает: ну, к примеру, размер бактериальных и неандертальских фрагментов. Но нет и нет – размер бактериальных фрагментов был таким же, как и неандертальских.

Но все же, все же чем отличаются бактериальные последовательности от ДНК млекопитающих? – спрашивали мы себя. И вот наконец меня осенило – метилирование! Метильные группы присоединяются к нуклеотидам, чуть-чуть химически изменяя их, но не саму последовательность. У бактериальной ДНК чаще метилируются аденины, а у млекопитающих метилируются в основном цитозины. Возможно, стоит попробовать подобрать антитела к метилированным аденинам и, таким образом, выделить бактериальную ДНК из экстрактов. Антитела – это белки, которые производятся иммунной системой, когда та узнает о внедрении чужеродной субстанции, например бактериальной или вирусной ДНК. Они циркулируют в крови, едва только обнаружат поблизости чужеродных агентов, накрепко связываются с ними и так помогают от них избавиться. Так как антитела строго специфичны, то есть связываются только с теми веществами, которые были предъявлены иммунным клеткам, они стали мощным инструментом в лабораторных работах. Например, если впрыснуть мыши метилированный аденин, то ее иммунные клетки распознают этот метилированный аденин как чужеродного оккупанта и произведут специфические антитела к метилированному аденину. Эти антитела можно потом выделить из крови мыши, очистить и использовать в лабораторных экспериментах. Я подумал, что мы можем изготовить такие антитела и попробовать с их помощью убрать бактериальную ДНК из вытяжек.

Быстрый поиск по литературе показал, что неподалеку от Бостона есть такая компания New England Biolabs, где исследователи уже синтезировали антитела к метилированным аденинам. Я написал Тому Эвансу, прекрасному ученому, который занимался репарацией ДНК и работал, как я знал, в этой компании. И он любезно прислал нам антитела. Теперь требовался доброволец из группы, который с их помощью попробовал бы связать бактериальную ДНК и удалить ее из вытяжки. Я надеялся, что таким образом мы сможем существенно повысить долю неандертальской ДНК. Задумка казалась мне весьма остроумной. Но когда я на собрании изложил ее нашей группе, она была встречена с изрядным скептицизмом. Я подумал, что дело опять-таки в неприятии незнакомых методик. Но теперь я припомнил им опыты с радиоактивностью. И таки настоял на своем. Эдриан Бриггс взялся за дело. Много месяцев он провел, пытаясь заставить антитела связываться с бактериальными фрагментами и отделить их от небактериальных. Он испробовал все мыслимые вариации методик. Так ничего и не сработало. Мы не понимали почему – и до сих пор не понимаем. Я уже стал привыкать к ехидным шуточкам по поводу гениальности своей идеи с антителами.

Но чем же еще эту бактериальную ДНК изничтожить, как от нее избавиться? Высказывалось предложение найти какой-нибудь часто повторяющийся мотив в бактериальных последовательностях. Тогда мы бы смогли с помощью синтетической ДНК связать эти мотивы и убрать бактериальную ДНК, примерно так, как мы пытались это проделать с антителами. Наш тихоня Кай Прюфер, студент-компьютерщик, который после появления в лаборатории самостоятельно выучил и стал понимать биологию генома лучше, чем любой студент-биолог, вызвался поискать такие потенциально полезные мотивы. И нашел. У него определилось несколько таких комбинаций из двух – шести нуклеотидов, которые гораздо чаще встречались у бактерий, чем в неандертальской ДНК, например, ЦГЦГ, или ЦЦГГ, или ЦЦЦГГГ и т. д. И когда он доложил об этом на собрании, то все вдруг стало на свои места. Конечно, как я об этом раньше не подумал! В каждом учебнике по молекулярной биологии так и написано: в геноме млекопитающих сравнительно редки такие сочетания нуклеотидов, где Ц идет за Г. А причина этого проста – у млекопитающих метилируются только те цитозины, за которыми стоят гуанины. Такие метилированные цитозины прочитываются ДНК-полимеразой с ошибками и в этом случае превращаются – мутируют – в тимины. В результате в течение миллионов лет эволюции в геноме млекопитающих постепенно становилось все меньше и меньше ЦГ-сочетаний. У бактерий, напротив, цитозины не метилируются, или это происходит редко, и поэтому ЦГ-мотивы у них обычны.

Можем ли мы как-то использовать это свойство? Ответ для нас всех был, естественно, очевиден. У бактерий имеются ферменты, так называемые рестриктазы, которые разрезают ДНК в местах с конкретными и специфичными мотивами, такими как ЦГЦГ или ЦЦЦГГГ. Если мы выдержим нашу неандертальскую вытяжку с набором таких ферментов, то они порежут бактериальную ДНК на мельчайшие кусочки, которые уже нельзя секвенировать, а неандертальская ДНК останется целехонька. И тогда та чуточка неандертальской ДНК увеличится относительно бактериальной, а нам того и нужно. На основе своего анализа Кай предложил коктейль из восьми рестриктаз, чтобы уж точно сработало. Мы немедленно обработали им одну из наших вытяжек этой смесью и отсеквенировали ее. Секвенатор выдал результат: 20 процентов неандертальской ДНК против обычных четырех процентов! А это значило, что теперь нужны не несколько тысяч циклов секвенирования, а только семь сотен. Для группы в Брэнфорде этот объем работы выглядел в пределах достижимого. Вот она, эта маленькая хитрость, сделавшая невозможное возможным. Единственный изъян методики виделся в том, что потеряются те участки, которые все же содержат мотивы ЦГ. Но их мы сможем выловить, используя различные наборы рестриктаз и сравнивая с результатами секвенирования без ферментов вообще. И вот мы представили наши наработки с рестриктазами Майклу Эгхольму в 454. “Блестяще!” – сказал он. Впервые мы почувствовали, что достижение нашей цели вообще реально.