Текст книги "Неандерталец. В поисках исчезнувших геномов"

Глава 9
Поближе к ядру

Работа Хенрика с Х-хромосомой показала, что закономерности сходства и различия между мтДНК обезьяны и человека распространяются, по крайней мере, на некоторую часть ядерного генома. А что же касается неандертальца, то невозможно было предугадать, сможем ли мы когда-нибудь добраться до его ядерного генома. В периоды уныния я думал, что мы навечно уткнулись в бледную и упрощенную митохондриальную историю человека. Понятно, что, не считая результатов всяких затейливых “допотопных” исследований вроде растений из янтаря или динозавров (а я их и не считал настоящими результатами), еще никому не удавалось выделить ядерную ДНК из древних остатков. Но когда уныние уступало здравому смыслу, то казалось, что попробовать все же стоит.

Именно в тот момент в лабораторию прибыл Алекс Гринвуд, ростом маленький, но очень настойчивый. Я посвятил его в наши планы по выделению ядерной ДНК и честно предупредил, что хотя результат чрезвычайно для нас важен, вероятность получить его невелика. Алекс принял вызов.

Я предложил метод “массированной атаки”. Это вот что: тестировать все подряд образцы костной ткани и отобрать те, у которых митохондриальная ДНК сохранилась наилучшим образом, затем экстрагировать всю ДНК из большего количества ткани – вдруг да объявится ядерная. Мы, конечно, не могли себе позволить отрабатывать подобную методику на материале собственно неандертальцев; сохранившихся остатков было слишком мало, и слишком они были ценны, а риск провала слишком велик. Поэтому мы решили попробовать поработать с костями животных, материалом более массовым и потому менее ценным для палеонтологов. Вот тут-то и пригодились кости пещерных медведей, которые я вывез из темных подвалов Института четвертичной палеонтологии в Загребе. Те кости раскопали в известняковой пещере Виндия, как раз вместе с костями неандертальцев, из которых мы выделили ДНК. Так что если бы нам удалось выделить ядерную ДНК из медведей, то почему бы после не попробовать то же и с неандертальцами?

Для начала Алекс экстрагировал всю ДНК из костей хорватских пещерных медведей – а их возраст, напомню, от 30 до 40 тысяч лет. Затем он проверил, содержат ли экстракты мтДНК, схожие с медвежьими. Да, содержат. Он выбрал те вытяжки, в которых нашлось наибольшее количество мтДНК, и попробовал амплифицировать из них короткие фрагменты ядерной ДНК. Не получилось. Алекс приуныл, я тоже расстроился, но не удивился. Он столкнулся с хорошо мне знакомой проблемой: так как каждая клетка имеет сотни митохондриальных геномов и только два ядерных, то количество каждого конкретного фрагмента ядерной ДНК уменьшается сто– или тысячекратно по сравнению с количеством отдельно взятого фрагмента мтДНК. Так что даже если в наших экстрактах и присутствовало некоторое минимальное количество ядерных нуклеотидов, то вероятность того, что амплифицируются именно они, падала в 100–1000 раз.

Проблема решалась очевидным способом: увеличить количество костного материала. Алекс сделал экстракты из большего количества кости и попробовал амплифицировать более короткие участки ядерных ДНК. Он использовал такие праймеры, которые подсоединялись к концам исключительно медвежьих ДНК-фрагментов, но наверняка не человеческих. Это для того, чтобы не тратиться лишний раз на человеческие ДНК-загрязнения. В этот раз Алекс не получил ничего, вообще ничего. Из этого мегаэкстракта не удалось амплифицировать даже митохондриальной ДНК. Ничего.

После нескольких недель бесплодных попыток и опытов с различными костями мы наконец догадались, что из большого количества ткани просто невозможно экстрагировать ДНК. И не потому, что амплифицировать там нечего, а потому, что экстракты содержали какое-то вещество, угнетающее ферменты, участвующие в ПЦР; ПЦР останавливалась, и на выходе оказывалось пусто. Мы промучились некоторое время, пытаясь определить и убрать непонятный ингибитор, но не смогли. Мы стали постепенно, поэтапно разбавлять экстракт, пока амплификация мтДНК снова не активировалась. Определив разбавленный до нужной концентрации раствор, мы пробовали амплифицировать ядерную ДНК. И получали… неудачу за неудачей. Я старался сохранять оптимизм, но шли месяцы, и Алекс все больше падал духом и волновался: будут ли вообще хоть сколько-нибудь годные для публикации результаты?.. Мы обдумывали и такую возможность: после смерти животного ядерные ДНК разрушаются ферментами, проникающими сквозь ядерную мембрану разлагающейся клетки. Митохондриальная же ДНК окружена двойной мембраной, потому лучше защищена от ферментных атак. Следовательно, у нее больше шансов дождаться, пока органическая ткань высохнет, замерзнет или окажется так или иначе недоступна для ферментов, и, таким образом, она может сохраниться. Такой сценарий заставил меня задуматься, а возможно ли в принципе обнаружить древнюю ядерную ДНК, даже если мы сумеем справиться с проблемой ингибитора ПЦР. Мало-помалу я, как и Алекс, впал в уныние. Итак, пещерные медведи нас подвели. Мы предположили, что, быть может, условия, в которых находились кости, просто не благоприятствовали сохранению ядерной ДНК. И мы приняли решение переключиться на другой материал, самой лучшей, как мы ожидали, сохранности: остатки мамонтов из вечной мерзлоты в Сибири и Аляске. Те мамонты замерзли сразу после смерти, а замораживание, как мы знаем, замедляет или совсем прекращает развитие бактерий и множество других химических реакций, включающих и разрушительные для ДНК. Мы уже знали из работ Матиаса Хёсса, что мамонты из Сибири дают большое количество мтДНК. Правда, неандертальцев никогда не находили в вечной мерзлоте, так что работа с мамонтами означала шаг в сторону от моей конечной цели. Но нам нужно было как-то узнать, способна ли в принципе ядерная ДНК пережить 10 или даже 100 тысяч лет. Если мы не найдем ядерные нуклеотиды в замороженных тканях мамонта, то всё, можно прекращать поиски: неандертальцев находят в куда менее благоприятных для сохранения условиях, и ядерная ДНК там уж и подавно не сохранится.

К счастью, я систематически коллекционировал древние кости из разных музеев, так что Алекс смог немедленно опробовать наши идеи на имеющемся материале. Он отобрал зуб мамонта, в котором осталось особенно много мтДНК. Этот зуб выкопали из вечной мерзлоты, когда строили главное шоссе на Аляске, идущее от северо-востока Британской Колумбии до Фэрбенкса. Шоссе строили в страшной спешке во время Второй мировой войны. Зуб нашли, положили в большую коробку и оставили ее в Американском музее естественной истории, там он с тех пор и лежал. Чтобы облегчить работу по выделению ДНК, мы наметили сегмент ядерного генома, содержащего часть гена, известного как 28S рДНК; он кодирует одну из молекул РНК рибосом, органелл, управляющих синтезом белков в клетке. Преимущество этого гена нам виделось в том, что в одной клетке содержалось несколько сотен его реплик. И получалось, что после смерти животного подобных фрагментов оставалось примерно столько же, сколько и мтДНК. К моему великому облегчению и радости, у Алекса получилось амплифицировать этот рибосомальный ген. Он секвенировал размноженные копии из вытяжки мамонта и реконструировал нуклеотидную последовательность этого гена, используя методику перекрывающихся участков. Эту методику мы отработали, еще когда изучали неандертальскую мтДНК. Затем Алекс взялся сравнить полученную последовательность с соответствующими цепочками африканских и индийских слонов, ближайших родственников мамонта. У меня тогда по поводу загрязнений началась прямо-таки паранойя, и я запретил Алексу и вообще кому-то из лаборатории работать с ДНК слонов до тех пор, пока Алекс не получит результат по мамонтам. И вот теперь, выйдя наконец из “чистой комнаты”, Алекс занялся секвенированием гена 28S рДНК слонов, применив тот же праймер, что и для мамонта. И получил ту же последовательность. Соответствующий фрагмент ДНК африканских слонов отличался все же по двум позициям, что говорило о том, что мамонты ближе к индийским, чем к африканским слонам. Мы, конечно, сравнили мамонтов со слонами, но не это являлось целью всей затеи: нам нужно было выделить древнюю ядерную ДНК. Чтобы подтвердить возраст, мы отправили ткань зуба того мамонта на углеродное датирование. И когда в ответном сообщении открылось “14 тысяч лет”, я в первый раз за много месяцев удовлетворенно расслабился. Так мы впервые в истории получили ядерную ДНК позднего плейстоцена.

Вдохновленный результатом, Алекс придумал праймеры для амплификации двух коротких участков фрагмента особого гена, который носит название “ген фактора Виллебранда”; в геноме слона содержится только по одному такому гену. Фактор Виллебранда – его ген записывают как vWF – это белок крови, который помогает тромбоцитам прикрепляться к поврежденным кровеносным сосудам. Мы выбрали именно этот ген, так как его нуклеотидная последовательность как у слонов, так и у многих других млекопитающих уже была известна, и нам оставалось только выделить его из тканей мамонта и сравнить с уже имеющимися, современными. Я глазам не поверил, когда на очередном еженедельном лабораторном обсуждении Алекс показал картинки с полосками в геле, и это было не что иное, как амплифицированные фрагменты гена мамонта. Он повторил эксперимент дважды, каждый раз с заново приготовленными экстрактами из мамонтовой кости. Среди множества клонов, которые он секвенировал, были хорошо видны ошибки в отдельных молекулах ДНК, появляющиеся или из-за химического разрушения древних ДНК, или из-за пристраивания неправильного нуклеотида к цепочке ДНК при ПЦР (рис. 9.1). Но для одной из позиций Алекс заметил интересную закономерность. Он секвенировал в общей сложности тридцать клонов, проведя для каждого три независимые серии ПЦР. В одной из позиций у пятнадцати клонов стояло Ц, у четырнадцати – Т и у одного А. Единственный случай с аденином (А) мы посчитали ошибкой ДНК-полимеризации, но остальная картинка – у меня сердце замерло… Это конкретное место в цепочке являлось тем, что генетики называют гетерозиготной позицией, или, иначе, точечным нуклеотидным полиморфизмом (сокращенно – SNP, СНИП). В этом месте две копии данного гена, полученные от мамы-мамонтихи и папы-мамонта, различались. И нам удалось увидеть самую первую гетерозиготную позицию, СНИП, ледникового периода. То есть мы имели дело с генетикой в чистом виде, с генетикой в действии, если хотите, – вот вам ядерный ген, у которого в популяции встречается два варианта. Дело пошло на лад. Если нам удалось прочитать оба варианта этого гена, тогда, в принципе, остальные части генома тоже могут быть доступны. И таким образом, откроется возможность, по крайней мере теоретически, получать генетическую информацию о видах, вымерших много тысяч лет назад.

Рис.  9.1.  Клонированные  ДНК  последовательности  по  трем  амплификациям фрагмента ядерного гена мамонта возрастом 14 тысяч лет. Стрелка показывает на гетерозиготную позицию, или СНИП, впервые обнаруженную для ДНК из позднего  плейстоцена.  Из A.D. Greenwood et al.  Nuclear DNA sequences from late Pleistocene megafauna. Molecular Biology and Evolution 16, 1466– 1473 (1999)

Чтобы закрепить успех, Алекс отсеквенировал еще два фрагмента генов, имеющих по одной копии в ядре. Один из них кодировал белок, регулирующий выделение нейромедиаторов в мозге, а другой – белок, связывающий витамин А; этот последний вырабатывался палочками и колбочками в глазу. И в обоих случаях у Алекса все превосходно получилось.

Мы так долго бились с ядерной ДНК, что Алексовы результаты с мамонтом были встречены с величайшей радостью, и у меня несколько дней царил прямо праздник на душе. Но… не мамонты интересовали меня, совсем не мамонты. Неандертальцы – вот моя цель, а я точно знал, что в вечной мерзлоте неандертальцев не бывает. Я убедил Алекса вернуться к пещерным медведям и попробовать еще раз материал из Виндии: проверить, не сможем ли мы все же получить ядерную ДНК из остатков, не подвергшихся заморозке. Он проанализировал мтДНК нескольких пещерных медведей и выбрал кость, в которой, по всей видимости, ДНК содержалось больше всего. Мы сделали ее углеродный анализ – оказалось, 33 тысяч лет, что приблизительно соответствовало возрасту неандертальцев. Алекс стал работать именно с этой костью. Он попробовал выделить гены рибосомальной РНК – а в геноме множество их копий. И действительно, после амплификации Алексу удалось получить небольшое их количество. Далее он реконструировал последовательность из амплифицированных клонов. И выяснил, что у пещерных медведей она идентична соответствующим нуклеотидным последовательностям современных медведей.

Безусловно, это был успех, но с “ложкой дегтя”. Мы затратили столько усилий на ген с множеством копий в геноме; а что, если речь пойдет о гене, у которого есть только одна копия, например о vWF, с которым Алекс работал на мамонтовом материале? Тогда эксперименты заведомо обречены на провал. Алекс тем не менее попробовал и, как и ожидалось, потерпел неудачу. В глубине души – я никому об этом не рассказывал – я глубоко огорчился результатами экспериментов. Мы показали, что ядерная ДНК способна выдержать более десятка тысяч лет в вечной мерзлоте и что только следы даже самой распространенной ядерной нуклеотидной последовательности обнаруживаются в костях пещерных медведей. Разница между замораживанием и хранением в известняковой пещере была огромной.

В 1999 году мы опубликовали все открытия Алекса в прекрасной, на мой взгляд, работе[42]42
  A.D. Greenwood et al. Nuclear DNA sequences from Late Pleistocene megafauna. Molecular Biology and Evolution 16, 1466–1473 (1999).


[Закрыть], которую незаслуженно обошли вниманием. Там доказывалось, что ядерная ДНК сохраняется в остатках из вечной мерзлоты и что в ней даже можно выявить гетерозиготную позицию, такую, где две хромосомные копии несут разные варианты нуклеотидных последовательностей. Мы с уверенностью говорили о перспективах генетических исследований остатков из вечной мерзлоты и в конце работы написали: “В отложениях вечной мерзлоты и в других холодных средах находится множество животных остатков. В подобных остатках выявляются не только мтДНК, но и ядерные ДНК-последовательности, причем во многих случаях представленные в геноме единственной копией; это открывает перспективы использования ядерных локусов в филогенетических и популяционных генетических задачах, а также в исследованиях генов, определяющих фенотипические признаки”.

Со временем другие ученые продолжили эти исследования, однако произошло это нескоро, через пять или даже десять лет. Но что еще обиднее, на тот момент казалось, что если только неандертальца не раскопают в вечной мерзлоте, никогда нам не увидеть целого неандертальского генома.

Глава 10
Вот они, ядра

Тем временем дела в лаборатории под моим руководством продвигались вперед, медленно, но верно. И все-таки, стоило мне остаться одному, например отгородившись от мира ремнем самолетного кресла или слушая в затемненном зале не слишком интересную лекцию, как прежняя досада возвращалась: ядерную ДНК неандертальцев так и не удалось выделить. Но я знал, я чувствовал, что она там есть, должна быть, и пусть ПЦР хоть сто раз отрицает это. Просто нужно как-то исхитриться достать эту ядерную ДНК.

Очередную попытку в этом направлении предпринял Хендрик Пойнар. Исчерпав терпение в бесплодных попытках отыскать ДНК флоры и фауны, заключенной миллионы лет назад в янтарь, он решил приложить силы к задаче более перспективной. Нам с ним в некотором смысле повезло: я попал на скучную конференцию и от нечего делать обдумывал наши разработки касательно выделения ДНК из помета животных. Например, мы изучали вымершего гигантского наземного ленивца из ледникового периода. Гигантские ленивцы оставили большое количество помета, который археологи окрестили милым научным термином “копролиты”. Даже больше – например, пол в некоторых пещерах в Неваде почти целиком состоит из окаменевших экскрементов гигантского ленивца. В статье 1998 года в Science Хендрик уже обозначил присутствие и сохранность в подобном материале мтДНК. Мы описали процесс реконструирования растительной ДНК из одного такого комка и показали, как с помощью копролитов можно воссоздать меню ленивца, пообедавшего незадолго до своей гибели 20 тысяч лет назад[43]43
  H.N. Poinar et al. Molecular coproscopy: Dung and diet of the extinct ground sloth Nothrotheriops shastensis. Science 281, 402–406 (1998).


[Закрыть]. Такой прекрасный результат позволял предположить, что окаменевший помет содержит большое количество ДНК, в том числе и ядерной. Я предложил Хендрику попробовать это выяснить.

Хендрик начал с того, что применил наши прошлогодние химические уловки. Еще в 1985–  м, когда занимался анализом мумий из Берлина, я заметил, что почти все вытяжки содержат некий компонент, который под ультрафиолетом светится голубым, и что если видишь голубое свечение, то ДНК в экстракте нет. Я не знал, что это за компонент, но наблюдение болезненно врезалось в память из-за тогдашнего разочарования: голубое свечение появлялось вместо розового, на которое я надеялся. По ходу изучения химических процессов, происходящих в тканях тела после смерти и в следующие десятки тысяч лет, мне попалась информация о явлении, известном как реакция Майяра. Этой химической реакцией занимается в основном пищевая индустрия. Так совпало, что моя мать была химиком-пищевиком, и она прислала мне кипу литературы на эту тему. Реакция Майяра происходит, когда нагревают обычные формы сахара или же подвергают их длительному воздействию сравнительно невысоких температур. В результате сахар образует связи с аминогруппами из белков и ДНК, и получаются длинные, спутанные молекулярные комплексы. Эта реакция запускается в разных процессах приготовления пищи; например, цвет и приятный запах свежеиспеченного хлеба являются ее побочными эффектами. Но меня интересовал не запах и цвет, а то, что продукты реакции в ультрафиолете светились голубым. Я подумал: а не происходит ли нечто подобное в химическом плане и с мумиями? В моей голове реакция Майяра ассоциировалась (наверное, неправильно) не только с голубым свечением, но и с характерным коричневым цветом мумий и их сладковатым запахом, вполне для меня приемлемым. И у меня возникло подозрение, что неудачи с выделением ДНК из мумий сопряжены с тем, что реакции Майяра связали древнюю ДНК с другими молекулами.

Ну что же, эту догадку можно проверить. В 1996 году в Nature вышла статья, описывающая химический реагент N-фенацил тиазолиум бромид, сокращенно PTB, разлагающий молекулярные комплексы, образованные реакцией Майяра[44]44
  S. Vasan et al. An agent cleaving glucose-derived protein cross-links in vitro and in vivo. Nature 382, 275–278 (1996).


[Закрыть]. Если добавить РТВ в испеченный хлеб, то он превратится обратно в тесто (правда в такое, которое уже никому не захочется испечь снова). Так как в готовом виде РТВ не продавался, Хендрик синтезировал его в лаборатории. Когда мы добавляли реагент в вытяжки из костей пещерных медведей или неандертальцев, то иногда действительно получалась более высококачественная амплификация. И когда Хендрик добавил РТВ в копролит из Невады возрастом в 20 тысяч лет, ему удалось амплифицировать и фрагменты vWF гена, того, который Алекс секвенировал из замороженного мамонта, а еще фрагменты двух других ядерных генов – все это к моему величайшему удивлению. Мы опубликовали результаты в июле 2003 года[45]45
  H. Poinar et al. Nuclear gene sequences from a Late Pleistocene sloth coprolite. Current Biology 13, 1150–1152 (2003).


[Закрыть]. Наконец-то у нас получилось продемонстрировать, что ядерный геном сохраняется не только в условиях замораживания.

Вдохновленный результатами, я уже решил, будто все идет к тому, чтобы возобновить эксперименты по выделению ядерной ДНК из пещерных медведей, теперь с помощью РТВ. Печально, но ничего не вышло. Химические ухищрения не помогли. На самом деле в какой-то момент стало понятно, что копролит из Невады – это редчайшее исключение, где РТВ срабатывает. Исследования копролитов тем не менее укрепили меня во мнении, что ядерная ДНК в остатках есть, нужно только придумать новый способ ее найти.

Я спрашивал всех, кого только можно, о способах секвенирования небольших количеств ДНК. В числе прочих я подверг “допросу” шведского биохимика Матиаса Улена, неутомимого изобретателя и предпринимателя от биотехнологий. Матиас обладал безграничной энергией и с детским восторгом относился к новым идеям, заражая своим энтузиазмом творческих людей, неизменно собиравшихся вокруг него. После встреч с ним я всегда возвращался в приподнятом настроении. Одной из творческих личностей в его окружении был Поль Нюрен. Десять лет назад он, несмотря на всеобщий скептицизм, изобрел и разработал новый метод секвенирования ДНК. Матиас тотчас же разглядел научный потенциал изобретения Поля. Еще он осознавал, что технологии секвенирования ДНК пора уже обновлять: мы до сих пор использовали методики, разработанные Фредом Сэнгером в Англии, за что он и получил в 1980 году свою вторую Нобелевскую премию по химии.

Метод секвенирования Сэнгера основан на прикреплении нуклеотидов поочередно друг за другом ДНК-полимеразой, ферментом, который выстраивает новую цепочку ДНК на матрице имеющейся цепочки. В реакции секвенирования ДНК-полимераза берет старт от праймера в назначенном месте ДНК. Далее небольшие порции каждого из четырех нуклеотидов метят разными флуоресцентными красителями и, кроме того, немного изменяют их химически. В результате после встраивания такого измененного нуклеотида реакция секвенирования останавливается именно в месте его прикрепления. Получаются цепочки ДНК разной длины, и концы таких фрагментов раскрашены разными цветами. По этим цветам можно понять, что за нуклеотид сидит на конце. Эти фрагменты – а они разной длины – подвергают процедуре электрофореза. При электрофорезе кусочки ДНК распределяются в геле соответственно своим размерам (длинам, молекулярным весам). И тогда можно посмотреть, как цветные метки и, следовательно, нуклеотиды в этом геле расположены: например, метка и нуклеотид в 10– й позиции от места старта, в 11– й позиции, в 12–   й и т. д. На самом лучшем оборудовании для считывания, какое использовалось, к примеру, в проекте “Геном человека”, можно анализировать сразу сотни фрагментов ДНК длиной до 800 нуклеотидов. И что же проделал Поль Нюрен в лаборатории Матиаса? А вот что: он изобрел новый метод секвенирования, так называемый метод пиросеквенирования. И хотя пиросеквенированию предстояло еще хорошенько повзрослеть, но в перспективе оно обещало стать и быстрее, и проще метода Сэнгера.

При пиросеквенировании тоже используется ДНК-полимераза; она так же выстраивает комплементарные цепочки ДНК на матрице, но определение череды новоприкрепленных нуклеотидов устроено по-другому, в обход трудоемкого процесса разделения фрагментов по размеру. В этом случае нуклеотиды определяются по световым вспышкам, которые испускаются в момент присоединения нуклеотида к цепочке ДНК. Поль придумал, что можно добавлять в реакционную камеру по одному из четырех типов нуклеотидов по очереди. И тогда при добавлении, например, А (аденина) к исходной цепочке с концевым Т (тимином) ДНК-полимераза пристроит аденин к тимину, и в этот момент в результате химических реакций произойдет световая вспышка. Эту вспышку можно зафиксировать мощной камерой и передать на компьютер. А если в концевой позиции стоит не тимин, а любой другой нуклеотид – что же, тогда реакции не произойдет и светового импульса не будет. Поль добавлял в реакционную камеру по очереди нуклеотид за нуклеотидом, повторяя цикл за циклом. По вспышкам света он мог прочитать всю нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК. Прекрасный метод: требуется только своевременно добавлять нуклеотиды и другие компоненты в реакционную камеру и следить за отснятыми картинками. Но что еще лучше – этот процесс можно легко автоматизировать. И когда Матиас обо всем этом рассказывал, я воодушевился не меньше, чем он.

Спустя некоторое время Матиас пригласил меня поучаствовать в экспертном совете компании “Пиросеквенирование”, которую они с Полем учредили для разработки коммерческого продукта на основе новой технологии. Я с удовольствием согласился: это давало мне возможность быть в курсе развития замечательной технологии, которая, как я считал, могла здорово изменить наши методы изучения палео-ДНК. Я стал членом экспертного совета в 2000 году, спустя год после запуска в производство первого коммерческого аппарата. Он секвенировал одновременно девяносто шесть фрагментов ДНК, каждый в отдельной лунке пластикового планшета. Однако этот аппарат мог прочитать подряд только тридцать последовательных нуклеотидов или около того. По сравнению с современными машинами, работающими на принципе Сэнгера, “тридцать нуклеотидов” звучало довольно жалко, но ведь пиросеквенирование делало первые шаги и еще не достигло предела своих возможностей. На самом деле, хотя тогда я и не понимал этого, Нюрен положил начало революции в секвенировании, известной теперь как секвенирование второго поколения, которая в конце концов фундаментально изменила не только подход к изучению ископаемой ДНК, но и множество направлений в биологии.

Я очень хотел опробовать пиросеквенирование и поэтому уговорил Хенрика Кессманна отправиться в стокгольмскую лабораторию Матиаса в Королевский технологический институт. Хенрик ухватился за возможность полюбоваться на вытянутые от удивления лица стокгольмцев, когда он поприветствует их на безупречном шведском; хоть он и вырос в Германии, мать его была шведкой, и он прекрасно говорил на ее языке. Кроме того, он лихо управлялся с данными о современном народонаселении Европы и Азии и на их основе мог реконструировать возможные генетические связи между популяциями. Что же до новых технологий – он их отлично освоил, хотя не обошлось без трудностей.

В августе 2003 года совет компании “Пиросеквенирование” подписал разрешение на использование нового инструмента американской компанией 454 Life Sciences, основанной предпринимателем-биотехнологом Джонатаном Ротбергом. 454 Life Sciences намеревалась улучшить методы пиросеквенирования с помощью ультрасовременной струйной автоматики. Их нововведения базировались на присоединении коротких синтетических ДНК к концам фрагментов изучаемой ДНК. С помощью этих коротких кусочков одноцепочечные нити ДНК прицеплялись к микрошарикам, и затем в жировых капельках на шариках проходила массированная амплификация присоединенных фрагментов. В результате этого гениального хода в капельках жировой эмульсии синтезировались одновременно, но по отдельности, каждая в своей капельке, сотни тысяч нитей ДНК. Затем шарики разделялись на планшетке теперь уже с тысячами лунок, и далее начинался собственно пирофосфатный этап. И наконец (и это такое серьезное “наконец”!), составлялись таблицы вспышек для каждой лунки в каждом цикле. Для этого компания позаимствовала методику регистрации световых импульсов у астрономов – ведь астрономам приходится наблюдать миллионы ночных звезд и как-то регистрировать свои наблюдения. И все это вместе позволило секвенировать за раз не девятосто шесть, а двести тысяч фрагментов ДНК!

С такими мощностями, подумал я, мы могли бы просто секвенировать все подряд фрагменты палео-ДНК из вытяжек, все, что попадется, а потом проверять, что в них содержится. Метод “массированной атаки”, по сути, прямо противоположен тем техникам, когда приходится вылавливать каждый тщательно выбранный заранее кусочек ДНК. По сравнению с пиросеквенированием метод, основанный на выискивании отдельных сегментов с помощью ПЦР, не только ужасно трудоемок, но и решительно ограничивает поле зрения только одним, заранее заданным фрагментом, лишает возможности посмотреть, какие же еще ДНК содержатся в вытяжке. И хотя с помощью тогдашнего инструментария 454 Life Science нельзя было прочитать фрагмент длиннее ста нуклеотидов, но ведь цепочки, секвенированные Алексом из мамонта и Хендриком из гигантского ленивца, все равно получались не больше ста нуклеотидов. Мне не терпелось опробовать технику 454.

О новых методиках я советовался не только с Матиасом и остальными “пиросеквенистами”. В июле 2005 года нашу лабораторию в Лейпциге посетил Эдвард Рубин, генетик, человек кипучей, неукротимой энергии. Встречи с ним я ждал с нетерпением. Он занимал должность профессора в Лоуренсовской лаборатории в Беркли, в Калифорнии, и еще являлся директором Объединенного института генома при министерстве энергетики США. Эдди считал, что будущее за клонированием ДНК в бактериях, то есть примерно за тем, с чего я сам начинал работу с мумиями еще в 1980– х в Упсале. Эти методы, убеждал он меня, стали теперь намного более эффективными, чем в те давние времена. Я согласился проверить эффективность новых методик и отправил ему в лабораторию в Беркли экстракты двух костей пещерных медведей, содержавшие, как мы уже знали, большое количество мтДНК. В его лаборатории к молекулам ДНК из этих вытяжек присоединили молекулы-транспортеры и с их помощью внедрили ДНК в бактерий. По ходу роста и деления каждой бактерии получается клон, содержащий тысячи копий уникальной ДНК из костной вытяжки. Остается взять и прочитать ДНК каждого из получившихся клонов, словно книги из обширной библиотеки. Команда Эдди использовала традиционную химию Сэнгера для секвенирования 14 тысяч случайным образом выбранных клонов из двух библиотек – о таких цифрах в 1984– м можно было только мечтать. Из 14 тысяч клонов только 389, то есть 2,7 процента, содержали цепочки ДНК, похожие на те, что имеются у собак, и, таким образом, с большой вероятностью принадлежавшие пещерным медведям. Остальное пришло от бактерий и плесени, поселившихся на костях после смерти животного. И хотя пропорция собственной медвежьей ДНК была до смешного мала, но все же результат вдохновлял: значит, ядерная ДНК все-таки есть в костях из пещер Европы!

Результаты мы опубликовали в 2005 году в Science, Эдди и его группа значились основными авторами[46]46
  J.P. Noonan et al. Genomic sequencing of Pleistocene cave bears. Science 309, 597–600 (2005).


[Закрыть]. Статья несколько претенциозно утверждала, что прочитать древний геном – да, возможно. Но уже после публикации некоторые члены моей лаборатории, рассмотрев результаты более взвешенно и произведя дополнительные расчеты, пришли к неутешительным выводам. Группа из Беркли секвенировала каждый фрагмент ДНК из библиотек, которые мы им переслали, и выявила в сумме 26 861 нуклеотид из генома пещерного медведя. Если принять во внимание, что мы использовали десятую часть грамма костной ткани для составления библиотек и что геном состоит примерно из трех миллиардов нуклеотидов, нам придется увеличить количество исследуемой ткани в сотню тысяч раз – то есть понадобится больше десяти килограммов костей. Только так нам удастся хотя бы приблизительно составить геном пещерного медведя. Предположим, мы справились с немыслимо трудоемкой задачей перемолоть такое количество костей и получить из порошка вытяжки, но секвенирование в таких масштабах обойдется в баснословную сумму. И даже если с пещерным медведем как-то можно получить результат, то в случае действительно интересных ископаемых, от которых для исследования остаются в прямом смысле крохи, количественный, “массированный” подход просто бесполезен. Я лично считал, что секвенирование неандертальского генома с помощью клонирования в бактериях – это тупик. Просто невозможно, и все. По моим представлениям, большая часть ДНК должна была потеряться при получении бактериальных библиотек: ведь ДНК может просто не попасть в бактерию или, все же попав, деградировать под действием бактериальных ферментов. Эдди, однако, энтузиазма не терял и утверждал, что мы получили нехарактерно низкий процент продукта секвенирования. Он даже говорил, что следующие попытки потребуют меньше материала и наверняка окажутся более успешными.