Текст книги "Карманный справочник врача. Основы геронтологии"

Стволовые клетки при старении

Показано, что эмбриональные ткани являются источником уникальных по своим свойствам стволовых клеток (СК), обладающих высоким потенциалом к росту и дифференцировке. При попадании во взрослый организм эмбриональные стволовые клетки способны оказать глубокое влияние на все его органы и ткани. Трансплантация СК в последние годы прочно вошла в арсенал современных экспериментальных клинических подходов к лечению целого ряда наследственных и приобретенных заболеваний. Кроветворные СК используются для восстановления кроветворения у пациентов с онкологическими и гематологическими заболеваниями, инсультом, при травмах головного и спинного мозга, нейродегенеративных заболеваниях.

В эмбриогенезе человека и млекопитающих образование нескольких сотен вариантов специализированных клеток происходит из пула зародышевых листков (экто-, энто– и мезодермы), а также из эмбриональной мезенхимы.

Термин «стволовая клетка» определяет популяцию тканевых или циркулирующих в крови низкодифференцированных клеток-предшественников, обладающих неограниченной способностью к самообновлению и дифференцировке в клеточные компоненты различных тканей.

Терминология и классификация стволовых клеток в настоящее время находится в стадии становления. Наиболее важна классификация СК по источнику их выделения.

1. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) – внутриклеточная масса раннего эмбриона (на этапе бластоцисты – 4–7-й день развития).

2. Фетальные стволовые клетки (ФСК) – клетки зародыша на 9–12-й неделе развития, выделенные из абортивного материала.

3. Стволовые клетки взрослого организма:

гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) – мультипотентные стволовые клетки, дающие начало всем клеткам крови – эритроцитам, В-лимфоцитам, Т-лимфоцитам, нейтрофилам, базофилам, эозинофилам, моноцитам, макрофагам и тромбоцитам. Кроме костного мозга, ГКС обнаружены в системном кровотоке и скелетных мышцах;

мезенхимальные стволовые клетки (МСК) – мультипотентные региональные стволовые клетки, содержащиеся во всех мезенхимальных тканях (главным образом в костном мозге), способные к дифференцировке в различные типы мезенхимальных тканей, а также других зародышевых слоев;

стромальные стволовые клетки (ССК) – мультипотентные стволовые клетки взрослого организма, образующие строму костного мозга (поддерживающую гемопоэз), имеющие мезенхимальное происхождение;

тканеспецифичные стволовые клетки (ТСК) располагаются в различных видах тканей и в первую очередь отвечают за обновление их клеточной популяции, первыми активируются при повреждении. Классическим считалось мнение, что тканеспецифичные СК обладают более низкой потентностью, чем стромальные СК костного мозга. Однако последние исследования показывают высокую пластичность ТСК (способность к дедифференцировке и дифференцировке в другие типы клеток).

В настоящее время в результате исследований, показывающих возможность их обратной трансформации в МСК, все большее внимание привлекают фибробласты.

Согласно современным данным, практически все ткани организма содержат то или иное количество СК. Тем не менее практическое значение для выделения СК с целью их последующего клинического применения имеют лишь ткани, содержащие реальные количества клеток-предшественников. К ним можно отнести костный мозг, жировую ткань, кровь и строму пуповины/плаценты.

Еще задолго от открытия СК было отмечено уменьшение с возрастом способности к регенерации у высших животных и человека и замедление репаративных процессов. Этот феномен связывают как с уменьшением количества стволовых клеток, так и с уменьшением реактивности организма на повреждающие воздействия.

С увеличением возраста количество СК в организме уменьшается, как и число ооцитов в яичниках женщины. В отношении связи количества прогениторных клеток ситуация неоднозначна.

Предложена модель истощения пула клеток-предшественников как ключевого момента в снижении способности старого организма к восстановлению. Однако было показано, что количество эндотелиальных клеток-предшественников не изменяется с возрастом, а ключевым моментом является зависимое от возраста и протеасомной активности снижение стабильности индуцируемого гипоксией фактора-1-альфа.

Широко используется перенос стволовых клеток (обычно их источником служит костный мозг) для исследования их функции у реципиентов, в том числе в комбинациях молодой донор – старый реципиент и старый донор – молодой реципиент.

Колониеобразующие единицы при переносе от молодых мышей к старым воспроизводятся меньше в числе и размерах у старых животных, но достаточно активны при трансплантации костного мозга (источник КОЕ) от старых животных к молодым.

В целом для стволовых клеток при старении отмечены следующие закономерности: гибель покоящихся стволовых клеток, истощение клона пролиферирующих СК, снижение числа СК в костном мозге, снижение числа СК в крови (снижение рециркулирующих СК, репопулирующих ткани), снижение факторов роста микроокружения. Функция самих СК с возрастом, по-видимому, меняется мало.

Активация мобилизации стволовых клеток из депо, повышение их числа в крови, активация их функции в тканях – одно из современных перспективных направлений в профилактике процессов старения.

Старение ядра клетки

Мутации в ядрах клеток

Изменениям ядра придают важное значение в диагностике и проявлении старения. Изменяется активность хроматина, накапливаются повреждения (мутации), снижается активность репарационных ферментов.

Основной причиной образования свободных радикалов в биологических жидкостях называют естественный радиационный фон. До настоящего времени фактически единственным признанным экспериментальным методом искусственной индукции ускоренного старения является облучение. Кривые повышения смертности при облучении очень схожи с ускоренным старением. При этом оказалось, что достаточно облучать голову, то есть важны регуляторные механизмы вегетативного мозга, а не обновляющиеся путем деления соматические клетки остальных тканей организма. Небольшие дозы облучения, с другой стороны, могут продлевать жизнь и снижать уровень естественных мутаций, нарастающих с возрастом в соматических клетках (рис. 1).

Рис. 1. Зависимость количества полихроматофильных эритроцитов с микроядрами в клетках костного мозга облученных (1) и необлученных (2) мышей от возраста. По горизонтали – время после облучения в месяцах, по вертикали – процент клеток (приводится по Балакину с соавт., 2001)

Последние данные связаны, видимо, с индукцией слабыми дозами облучения процессов репарации ДНК, которые превалируют над процессами естественного повреждения ДНК клеток в обычных условиях. Малые дозы облучения способны также активировать иммунные процессы за счет снижения активности более лабильных Т-супрессоров, ингибирующих в норме иммунный ответ.

Наиболее интересным фактом из многообразных исследований по связи свободнорадикальных процессов с процессом старения являются комплексные итоговые расчеты, показывающие, что продолжительность жизни самых разных видов хорошо коррелирует с соотношением процессов синтеза свободных радикалов (оцениваются по удельному потреблению кислорода тканями на единицу массы ткани) и процессами защиты от них (оцениваются по удельной активности супероксидидисмутазы – СОД – на единицу массы ткани). Интересно, что важна, прежде всего, активность СОД – фермента, инактивирующего первые реакционные молекулы, возникающие при облучении. В данный механизм естественным образом укладываются другие соотношения по связи ПЖ с интенсивностью тканевого дыхания, активностью антиоксидантных механизмов, уровнем ТБК-активных веществ в тканях и пр., которые никогда не давали хороших корреляций для разных видов. Интересно, что данное отношение работает даже для птиц (известное исключение из большинства других формул отношения ПЖ вида и тех или иных морфофункциональных характеристик организма).

В последнее время значительный интерес проявляется у геронтологов к специфическим генным белкам – сиртуинам. Они найдены в клетках практически всех организмов, от бактерий до млекопитающих. Эти белки представляют собой ферменты, участвующие в процессе упаковки молекулы ДНК в белки-гистоны. Сиртуины препятствуют распаковке «ненужных» генов, а также участвуют в репарации ДНК. Показано, что избыток сиртуинов в клетках дрожжей препятствует их старению. У мышей, генетически предрасположенных к развитию лимфомы, введение сиртуинов или стимуляция генов сиртуинов увеличивает их выживаемость на 25–45 %. Стимуляция генов сиртуинов происходит, в частности, антиоксидантом ресвератролом (который содержится в красном вине и которому приписывают геропротекторный эффект).

С возрастом увеличивается число ядер в клетке – полиплоидия, причем ядерная мембрана образует многочисленные складки для увеличения площади соприкосновения с цитоплазмой, расширяются ядерные поры, появляются ядерные включения (обычно функционально неактивные).

Изменения хроматина при старении

Изменениям хроматина в процессе старения придавали важное значение. Типичными возрастными изменениями хроматина являются:

• увеличение температуры плавления, что отражает увеличение числа химических сшивок молекулы ДНК;

• снижение экстрагируемости хромосомных белков (вследствие той же причины);

• снижение степени ковалентных модификаций белков и влияния способности различных агентов модифицировать эти белки, что снижает управляемость геномом;

• уменьшение транскрипционной активности – синтеза РНК на активных участках ДНК и пр.

При облучении мышей разного возраста репаративный синтез изменяется в 2–3 раза, при этом дело, видимо, не в снижении активности ферментов репарации ДНК, поврежденной радиацией, а в степени доступности для ферментов этих повреждений ДНК в составе хроматина клеток.

Известно большое число различных механизмов репарации ДНК. Радиационная повреждаемость ДНК стволовых клеток кишечного эпителия мышей разных линий и возраста примерно одинакова, однако скорость репарации этих повреждений с возрастом снижается. Способность диплоидных фибробластов человека к репарации индуцированных излучением однонитевых разрывов ДНК достоверно снижается с увеличением возраста донора. Показано также влияние возраста донора на интенсивность внепланового синтеза ДНК в клетках человека, подвергнутых in vitro УФ-облучению: найдена отрицательная корреляция между возрастом и величиной репарационного синтеза ДНК в лейкоцитах периферической крови здоровых субъектов 13–94 лет при сильных индивидуальных колебаниях. Было обнаружено также ослабление в старости индуцированного УФ-светом репаративного синтеза в лимфоцитах человека.

Двунитевые разрывы ДНК относятся к наиболее тяжелым повреждениям генома. Они являются молекулярным субстратом формирования различного вида структурных мутаций генов, аберраций хромосом, участвуют в инициации клеточной трансформации; они образуются при действии ионизирующих излучений, различных химических мутагенов и канцерогенов.

С возрастом в соматических клетках накапливаются не только мутации, но и хромосомные перестройки. С увеличением возраста не отмечено изменений стехиометрии большинства гистонов, однако имеются сообщения об изменениях строения подвида гистона H1. Ацетилирование гистонов, которое, предположительно, изменяет взаимодействие гистон-ДНК и делает ДНК более доступной для разного рода воздействий, снижается по мере старения на 30–70 %.

Метилирование генома и возраст

Некоторые авторы подчеркивают значимость определенных процессов в хроматине, важных для старения, например, изменения степени метилирования генома.

По-видимому, метилирование ДНК препятствует взаимодействию регуляторных белков (факторов транскрипции) с промотором. Метилирование ДНК способствует привлечению к району промотора белков, подавляющих транскрипцию.

До 5 % всех остатков цитозина в ДНК млекопитающих метилировано по 5'-позиции с образованием 5-метилцитозина (5-мЦ). Это единственное постоянно модифицированное основание в ДНК высших эукариот. Метилирование происходит в обеих нитях ДНК симметрично, и остатки 5-мЦ всегда сопровождаются остатками гуанина со стороны 3'-конца.

Метилирование ДНК вовлечено в регуляцию активности генов. Изменения в метилировании, в частности деметилирование динуклеотидов у позвоночных, связаны с изменением уровня транскрипции. Возрастное деметилирование ДНК впервые описано в 1973 году Ванюшиным, когда была обнаружена разница в степени деметилирования в тканях крыс: в ткани мозга по сравнению с печенью оно было выше. В дальнейшем было показано возрастное снижение количества 5-мЦ в легких и культурах фибробластов кожи, для последних отмечена связь деметилирования со снижением возможности к росту в культуре. Было высказано предположение, что возрастное деметилирование предрасполагает клетки к опухолевой трансформации.

В настоящее время показано, что биологический возраст хорошо коррелирует с уровнем метилирования, но только для определенных участков генома. Не удалось связать продолжительность жизни организма с количеством повторяющихся или уникальных генов.

8-Окси-2'-дезоксигуанозин (8-одГ) является наиболее распространенным окислительным продуктом повреждения ДНК. Количество его при старении in vivo и in vitro непрерывно увеличивается как в ядерной, так и в митохондриальной ДНК (в последней – с гораздо более высокой скоростью), поэтому многие геронтологи, особенно стоящие на позициях свободнорадикальной теории старения, считают его одним из лучших молекулярных биомаркеров старения.

Электрокинетические свойства ядер

Трансмембранный потенциал ядер зарегистрирован в клетках различных организмов, он сохраняется в изолированных, выделенных из клеток ядрах. Электрокинетические свойства ядер, изолированных из клеток, в ряде случаев отражают изменения в активности синтетических процессов в клетках. Величина отрицательного мембранного потенциала ядра составляет порядка 43 В (клетки линии Hela) и изменяется в ходе клеточного цикла, омическое сопротивление мембраны ядра – порядка 1 Ом · см². В ходе индукции клеточного деления (например, при регенерации печени) электрокинетическая активность ядер значительно и рано возрастает, что зависит от синтеза РНК в клетках.

Электрокинетические свойства ядер и внутриядерных структур в живых клетках характеризуются с помощью показателей электроотрицательности ядер и хроматина, которые изменяются при изменении активности клеток и состояния организма и чувствительны к действию повреждающих факторов. Результаты исследований с помощью метода внутриклеточного микроэлектрофореза имеют также прикладное значение и находят применение в различных областях медицины при изучении утомляемости, выносливости человека в экстремальных условиях, неспецифических реакций организма на различные заболевания.

Исследования более 3000 доноров позволили определить зависимость величины электрокинетической активности ядер от возраста донора (Шахбазов и др., 1986). На рисунке 2 показано изменение данного показателя для клеток буккального эпителия в зависимости от возраста.

Видно, что с возрастом эта величина выраженно снижается, впрочем, график имеет заметный максимум в среднем возрасте, для более ранних возрастов эта величина более низкая. Последнее не позволяет напрямую связать электрический потенциал ядер с возрастом, однако снижение его при различной патологии и повышение при выздоровлении и улучшении общего и физического состояния позволяют говорить о нем как о важной и простой для регистрации величине, в т. ч. для определения биовозраста.

Данный феномен отмечен для большинства типов клеток и видов животных, поэтому он может быть использован и у лабораторных животных при исследовании процессов старения.

Рис. 2. Изменение количества электроотрицательных ядер (%) с возрастом (Шахбазов и др., 1990)

Изменяется и собственно электрическая активность клеток: удлиняется скрытый период включения моторной единицы, для групп клеток отмечается большое количество потенциалов малой силы. Значимо уменьшается количество воды в тканях, количество внутриклеточных ионов калия с неизменным или даже повышенным содержанием ионов натрия (в некоторых клетках, наоборот, происходит накопление внутриклеточного калия), падает мембранная активность К-Na-АТФазы, снижается содержание молекул – энергоносителей (АТФ и КФ – креатинфосфата), изменяется сопряжение окислительного фосфорилирования и окисления; в этих условиях растет компенсаторно внутриклеточный гликолиз, что приводит к накоплению кислых продуктов метаболизма и закислению внутренней среды клеток.

Резюме

Основными изменениями клеток при старении являются:

• регуляторное замедление скорости их деления ввиду снижения факторов роста (стационарное старение) и изменения микроокружения. Необновляющиеся (нервные и пр.) клетки с возрастом гибнут по стохастическому механизму и число их в тканях необратимо снижается. Снижение скорости клеточного деления проявляется как G₁/S-блок деления клеток;

• наряду с процессами дегенерации (вакуолизация, нейрофагия, гиалиновая дегенерация, гидропическое набухание, вакуолизация и сморщивание, лизис и гиалиноз клеток с возрастом) происходит компенсаторная гиперплазия оставшихся клеток. Степень изменения клеток при старении даже одного типа различна;

• типичными являются атрофия капиллярного русла и развитие соединительной ткани, что приводит к тканевой гипоксии и дистрофии с возрастным склерозом ткани;

• типичны также отложения не до конца метаболизированных продуктов – липофусцина – в цитоплазме нервных клеток, конкреций в лизосомах и пероксисомах (метаболическое засорение клеток);

• изменяется функциональная активность (снижение лабильности и торпидность ответа, увеличение времени восстановительных процессов) клеток и их чувствительность к гормонам, число рецепторов к которым снижается;

• снижается чувствительность к апопотозу, что приводит к накоплению старых клеток. Некоторые клетки имеют врожденную запрограммированность способности к ограниченному числу делений («феномен Хейфлика»), в основе которой лежит механизм дефицита фермента теломеразы;

• число стволовых клеток, видимо, меняется мало и сохраняются их свойства, но снижается их циркуляция в крови и активность в тканях;

• изменения хроматина клеток отражают снижение скорости пролиферации и самообновления, репарации ошибок метаболизма: увеличивается ригидность хроматина и состав гистоновых/негистоновых белков, повышается выключающее гены метилирование ДНК, снижается активность ферментов репарации ДНК, накапливаются мутации и разрывы молекулы ДНК;

• увеличивается в крови содержание 8-Окси-2'-дезоксигуанозина (8-одГ) – наиболее важного для диагностики окислительного продукта повреждения ДНК;

• закономерное снижение электрокинетических свойств ядер клеток используют для диагностики биологического возраста.

Биохимия старения

Белковый обмен и ферменты при старении

Синтез белков разного типа мало изменяется с возрастом или часто меняется циклически в процессе всего онтогенеза, отражая в большинстве случаев изменения процессов центральной регуляции. Снижение протеолиза белков, часто отмечаемое в старости, наряду со снижением их синтеза, видимо, также является регуляторно-компенсаторным феноменом.

Были изучены разные аспекты функционирования ферментов как функции возраста: активность, изомеры, индукция, кинетические параметры и пр. Для многих ферментов никаких изменений не отмечено. Не выявлено никаких специфических закономерностей в изменении ферментов определенных классов, одного и того же органа или клеточной органеллы.

Часто наблюдаемые изменения в составе изоферментов отражают переключения с возрастом в работе генов: в старости работают часто другие гены, синтезирующие другие изоформы данного фермента. Сдвиг к Н4-ЛДГ в мозге, сердце и скелетных мышцах, отмеченный для крыс в старости, может сделать эти ткани более аэробными.

Измерение индукции ферментов, особенно стероидными гормонами, указывает, что в целом в старости степень индукции снижается. Снижение индукции ацетилхолинэстеразы эстрадиолом в старости происходит, скорее всего, за счет уменьшения уровня специфических для этого гормона рецепторов в ткани. Стимулирование регенерации, например печени, восстанавливает число таких рецепторов. Кинетические параметры ферментов (молекулярная масса, электрофоретическая подвижность, Км и др.) в большинстве случаев одинаковы для молодых и старых организмов. Однако удельная активность ферментов в пересчете на очищенный фермент часто снижается в старости, а их термочувствительность возрастает.

Характерное проявление общих принципов старения для «старения молекулы» – это снижение специфических функций и снижение степени резистентности к условиям внешней среды.

В целом большинство авторов резюмируют, что изменения уровня ферментов с возрастом являются вторичными, отражающими регуляторные изменения в организме.

Синтез белка, видимо, значимо снижается с возрастом – срезы печени старых крыс синтезируют почти вдвое меньше белка, в сравнении с молодыми, в основном за счет снижения альбуминовой фракции при повышении синтеза глобулинов. Снижение альбумин/глобулинового коэффициента – один из немногих надежных показателей биологического возраста.

C возрастом может изменяться количество SН-групп в макромолекулах. Это активные группы, и снижение их количества отражается на функции ферментов, детоксицирующих свойствах организма и пр.; их количество можно определить в крови, например, методом йодометрического титрования.