Текст книги "ДНК. История генетической революции"

На Московском международном конгрессе, состоявшемся летом 1961 года, собрались все ключевые специалисты по молекулярной биологии. Маршалл Ниренберг в ту пору был молодым и никому не известным ученым. Ему отвели на выступление всего десять минут, и едва ли кто-то из специалистов по молекулярной биологии слышал его выступление. Но когда стали распространяться новости о его прорывном открытии, Крик подсуетился и выкроил ему время на выступление в один из следующих дней той же конференции, чтобы Ниренберг мог рассказать о своем открытии в аудитории, способной вместить всех заинтересованных. Это был исключительно важный момент. Спокойный, скромный и никому не известный молодой человек, выступая перед элитой молекулярной биологии, рассказал, что нужно сделать, чтобы полностью расшифровать генетический код.

Фактически Ниренберг и Маттеи решили всего лишь 1/64 часть задачи: определили, что УУУ кодирует фенилаланин. Оставалось расшифровать еще шестьдесят три трехбуквенных триплета (кодона), и последующие годы были отмечены многочисленными исследованиями, в ходе которых мы тщательно выясняли, какие аминокислоты кодируются другими кодонами. Оказалось, что самое сложное – синтезировать различные варианты РНК. Получить поли-У было относительно просто, а что насчет АГГ? Эти задачи решались при помощи различных хитроумных химических уловок, и многие из этих экспериментов были выполнены Гобиндом Хораной в Университете Висконсина. К 1966 году удалось выяснить значения всех шестидесяти четырех кодонов (иными словами, выстроить весь генетический код). В 1968 году Хорана и Ниренберг (совместно с Робертом Холли) получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине.

Френсис Крик (в центре) с Гобиндом Хораной и Марианной Грюнберг-Манаго. После первого прорывного открытия, совершенного Маршаллом Ниренбергом, Гобинд Хорана открыл значительную часть генетического кода, опираясь на первопроходческие исследования Грюнберг-Манаго

Теперь давайте восстановим весь сюжет и рассмотрим, как синтезируется конкретный белок – гемоглобин.

Эритроциты специализируются на доставке кислорода из легких к тем тканям, где он требуется. Эритроциты образуются в костном мозге благодаря работе стволовых клеток – около 2,5 миллиона эритроцитов в секунду.

Когда возникает потребность в гемоглобине, расплетается соответствующий сегмент ДНК костного мозга – ген гемоглобина. Процесс в точности напоминает раздвоение ДНК при репликации. Но на этот раз копируются не две нити, а всего одна (по-научному «транскрибируется»), и в результате получается не новая нить ДНК, а новая нить матричной РНК, причем за синтез этой нити отвечает фермент РНК-полимераза. Этот сегмент матричной РНК соответствует гену гемоглобина. ДНК, с которой была скопирована эта РНК, вновь смыкается.

Матричная РНК выводится из ядра и доставляется в рибосому, которая сама состоит из РНК и белков. В рибосоме информация о последовательности нуклеотидов в матричной РНК используется для сборки новой белковой молекулы. Этот процесс называется «трансляция». Аминокислоты прибывают на место событий, прикрепленные к транспортной РНК. На одном кончике транспортной РНК расположен конкретный триплет (на приведенной здесь схеме это ЦАА), распознающий комплементарный ему противоположный триплет в матричной РНК, ГУУ. За другой кончик транспортной РНК прицеплена соответствующая аминокислота (в данном случае валин), буксируемая этой молекулой. На следующем триплете вдоль матричной РНК у нас становится транспортная РНК лизина, поскольку соответствующая последовательность в ДНК – это ТТЦ (кодирующая лизин). Теперь остается попросту биохимически склеить две аминокислоты. Сотня таких операций – и вот у нас есть белковая цепь длиной сто аминокислот. Порядок следования аминокислот зависит от порядка нуклеотидов А, Т, Г и Ц на том отрезке ДНК, по которому собирается матричная РНК. В молекуле гемоглобина две цепочки: в одной 141 аминокислота, в другой – 146.

Правда, белки – это не просто линейные цепочки аминокислот. После того как будет собрана такая цепочка, белки свертываются, образуя причудливые конфигурации. Иногда белок делает это сам, в других случаях – при помощи молекул, именуемых шаперонами. Белок становится биологически активным лишь после того, как приобретет нужную конфигурацию. Так, гемоглобин свертывается в четыре цепочки, причем цепочки в первой паре немного отличаются от цепочек во второй. Только после этого молекула приступает к делу. В центре каждой из этих цепочек расположен ключевой элемент, обеспечивающий транспортировку кислорода, – атом железа.

Сегодня удалось воспользоваться современными приемами молекулярной биологии, чтобы вернуться к некоторым классическим примерам из ранней истории генетики и переосмыслить их. Тот механизм, из-за которого одни горошины получались гладкими, а другие – морщинистыми, для Менделя оставался тайной; он считал, что есть лишь определенные признаки, подчиняющиеся законам наследования, которые он же и вывел. Однако теперь мы понимаем эту разницу в деталях на молекулярном уровне.

В 1990 году английские ученые обнаружили, что у гороха с морщинистыми зернами отсутствует один фермент, участвующий в переработке крахмала – углевода, запасаемого в семенах. Оказывается, что у гороха с морщинистыми семенами ген этого фермента не работает из-за мутации (в данном случае из-за интрузии ненужного фрагмента ДНК в середине гена). Поскольку в результате этой мутации морщинистые горошины содержат меньше крахмала и больше сахара, они быстрее теряют воду при созревании. Однако внешняя оболочка семени не сжимается при такой потере воды (и сокращении объема самого семени). Поэтому семя покрывается характерными морщинами – оно становится слишком маленьким для своей оболочки.

От ДНК до белка: в ядре ДНК транскрибируется в матричную РНК, которая затем выводится в цитоплазму для трансляции в белок. Трансляция происходит в рибосомах: транспортные РНК, комплементарные каждому триплету-кодону пар оснований в матричной РНК, доставляют аминокислоты, которые связываются друг с другом, образуя белковую цепочку

Алкаптонурию, которую изучал Арчибальд Гаррод, также исследовали в эру молекулярной биологии. В 1995 году испанские ученые, работавшие с грибком, обнаружили мутантный ген, приводящий к накоплению того же темного вещества, которое Гаррод обнаружил в моче пациентов с алкаптонурией. Оказалось, что этот ген по умолчанию кодирует один из базовых ферментов, присутствующих у многих живых организмов, и в том числе у человека. При сравнении последовательности нуклеотидов в гене грибка с последовательностями человеческих нуклеотидов удалось найти у человека ген, кодирующий фермент фенилаланинового пути – гомогентизат-1,2-диоксигеназу, вследствие чего не подвергается дальнейшему расщеплению один из промежуточных продуктов катаболизма – гомогентизат, который накапливается в жидкостях тела и выводится из организма с мочой. Далее требовалось сравнить этот ген у здоровых людей и у страдающих алкаптонурией. Что бы вы думали – оказалось, что при алкаптонурии этот ген не работает, причем всему виной мутация в единственной паре оснований. Обнаруженная Гарродом врожденная ошибка метаболизма оказалась обусловлена единственным изъяном в последовательности ДНК.

В 1966 году в Колд-Спринг-Харборе состоялся симпозиум, посвященный генетическому коду. Возникло ощущение, что мы практически у цели: код взломан, мы в общих чертах понимаем, как ДНК управляет биологическими процессами через кодируемые ею белки. Некоторые представители старой гвардии думали, что пора уже не ограничиваться изучением гена как такового. Френсис Крик решил перейти к работе в сфере нейробиологии; он никогда не пасовал перед масштабными проблемами и очень хотел выяснить, как именно работает человеческий мозг. Сидней Бреннер заинтересовался биологией развития и сконцентрировался на изучении примитивного червя-нематоды, считая, что именно столь простой организм лучше всего подходит для опытов, которые позволят ученым прояснить взаимосвязи между генами и механизмами развития. Сегодня «червь» – именно под таким названием он известен в профессиональной среде – действительно помог понять многие вещи, связанные со «сборкой» организмов. Вклад «червя» в науку был оценен Нобелевским комитетом в 2002 году, когда Сидней Бреннер и двое давнишних исследователей «червя» – Джон Салстон из Кембриджа и Боб Хорвиц из Массачусетского технологического института – были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине.

Однако большинство ученых, стоявших в свое время у истоков исследований ДНК, по-прежнему пытались выявить базовые механизмы работы генов. Почему количество одних белков во много раз больше, чем других? Многие гены включаются лишь в конкретных клетках или в определенный период жизни клетки; как обеспечивается такое срабатывание? Например, мышечная клетка кардинально отличается от печеночной как функционально, так и внешне (под микроскопом). Такое клеточное многообразие и дифференцировка связаны с изменениями в экспрессии генов; в сущности, в мышечных и печеночных клетках синтезируются разные наборы белков. Простейший способ синтезировать разные белки – регулировать, какие именно белки будут транскрибироваться в каждой клетке. Следовательно, некоторые белки, именуемые «белками общеклеточных функций» (они необходимы для работы клетки как таковой – например, обеспечивают репликацию ДНК), продуцируются во всех клетках. Кроме того, некоторые гены включаются в конкретные моменты в строго определенных клетках, продуцируя при этом нужные белки. Здесь можно поговорить о развитии – процессе, при котором из единственной оплодотворенной яйцеклетки вырастает сложно устроенный взрослый человек. Все это результат переключения генов. При формировании тканей в процессе развития гены должны включаться и выключаться целыми пачками.

Франсуа Жакоб, Жак Моно и Андре Львофф

Первые важные результаты на пути к пониманию процесса включения и выключения генов были получены в 1960-е годы в процессе экспериментов, выполненных Франсуа Жакобом и Жаком Моно в Институте Пастера в Париже. Научная карьера Моно начиналась медленно, поскольку он был настолько разносторонне одарен, что не мог сосредоточиться на чем-то конкретном. В 1930-е годы он работал на биологическом факультете Калифорнийского технологического института под руководством Моргана, родоначальника генетики дрозофил, но даже круглосуточное пребывание в кругу уже не столь юных учеников Моргана не превратило Моно в адепта науки о плодовых мушках. Он предпочитал дирижировать в университете концертами Баха (ему даже предложили подработку – преподавать студентам музыкальную грамоту) либо пропадал в роскошных домах местных миллионеров. К 1940 году он так и не закончил работу над диссертацией в Сорбонне, поскольку принимал активное участие в деятельности французского Сопротивления. Жак Моно – редчайший человек, сумевший совместить шпионаж с биологией. Он ухитрялся прятать важнейшие секретные документы в полых костях скелета жирафа, выставленного у всех на виду у него в лаборатории. Война разгоралась, поэтому ценность деятельности Моно для Сопротивления все более возрастала (как и риск попасть к нацистам). К моменту высадки союзников в Нормандии Моно уже играл в Сопротивлении ключевую роль, содействуя наступлению союзных частей, которые теснили немцев.

Франсуа Жакоб также успел повоевать, поскольку перебрался в Великобританию и вступил в Свободную армию генерала де Голля. Он служил в Северной Африке и участвовал в высадке союзников в Нормандии. Вскоре после этого он едва не погиб при бомбежке – из него вытащили двадцать осколков шрапнели, а еще восемьдесят он так и носил в себе до самой смерти в 2013 году. Из-за ранения в руку Жакобу пришлось расстаться с планами на карьеру хирурга, и он, подобно многим представителям нашего поколения, вдохновился книгой Шрёдингера «Что такое жизнь?» и занялся биологией. Он неоднократно пытался присоединиться к исследовательской группе Моно, но получал отказ. Однако на шестой или седьмой раз (по подсчетам самого Жакоба) руководитель Моно микробиолог Андре Львофф наконец уступил – это произошло в июне 1950 года.

Даже не предоставив мне возможности заново объяснить, чего я хочу, насколько я невежественен и как хочу работать, [Львофф] объявил: «Знаете, мы открыли индукцию профага!» [то есть узнали, как активировать ДНК бактериофага, внедренную в ДНК бактерии-хозяина].

«О!» – сказал я, вложив в этот возглас такую дозу восхищения, какую только мог, а про себя подумал: «И что за зверь этот профаг?»

Затем он спросил: «Вас интересует работа с фагами?» Я выдавил, что именно на нее я и рассчитывал. Он ответил: «Вот и хорошо, приходите первого сентября».

Очевидно, Жакоб отправился с собеседования прямиком в книжный магазин – покупать словарь, чтобы выяснять, чем же это он только что согласился заниматься.

Несмотря на столь бесславный старт, альянс Жакоба и Моно породил первоклассные научные достижения. Коллеги подступились к проблеме переключения генов у бактерии Escherichia coli – всем известной кишечной палочки. Они стали изучать, как эта бактерия синтезирует лактозу, молочный сахар. Для расщепления лактозы эта бактерия синтезирует фермент под названием β-галактозидаза, разделяющий лактозу на два более простых сахара: галактозу и глюкозу. Когда лактоза отсутствует в питательной среде, бактериальная клетка не синтезирует β-галактозидазу; но, когда лактоза появляется в растворе, клетка начинает продуцировать этот фермент. Жакоб и Моно рассудили, что именно наличие лактозы запускает синтез β-галактосидазы, и решили выяснить, как именно срабатывает механизм, который получил название механизма индукции-репрессии.

Поставив ряд красивых экспериментов, Жакоб и Моно установили, что синтез соответствующих белков – ферментов – индуцируется веществом, служащим субстратом и необходимым для нормальной жизнедеятельности клетки. Так, например, для нормальной жизнедеятельности E. coli необходим молочный сахар (лактоза), и в ее геноме содержатся гены, контролирующие синтез ферментов, гидролизующих лактозу до простых соединений. Если среда, в которой находятся бактерии, лактозы не содержит, эти гены пребывают в репрессированном состоянии и не функционируют. Внесенная в среду лактоза будет тем индуктором, который включает в работу длинные гены, и в клетке начинается синтез ферментов, гидролизующих лактозу до более простых соединений. После удаления лактозы из среды синтез этих ферментов прекращается. Механизм индукции-репрессии обеспечивает включение в работу тех генов, которые синтезируют необходимые на данном этапе жизнедеятельности клетки ферменты. Работа генов прекращается, когда деградируемый данными ферментами субстрат израсходован или когда синтезируемое данными ферментами вещество находится в избытке.

Оказалось, что в любых организмах действуют одни и те же принципы.

У высших организмов процесс регуляции работы генов осуществляется более сложно: у животных важную роль в этом процессе играют гормоны, клеточные мембраны; у растений – условия внешней среды, в том числе и окружающие клетки.

Жаков и Моно получили такие результаты, изучая мутантные штаммы Escherichia coli. Они не обнаружили прямых доказательств существования молекулы-репрессора, а просто логически предположили, что она существует, поскольку именно такое заключение позволяло разгадать эту генетическую загадку. Их идеи были подтверждены на молекулярном уровне лишь в конце 60-х годов, когда Уолтер (Уолли) Гилберт и Бенно Мюллер-Хилл из Гарварда решились выделить и проанализировать молекулу-репрессор как таковую. Жакоб и Моно лишь предсказали ее существование, а Гилберт и Мюллер-Хилл ее нашли. Поскольку обычно репрессор существует лишь в минимальных количествах – всего по несколько молекул на клетку, технически оказалось невероятно сложно собрать значимый образец, который удалось бы исследовать. Но в итоге у них все получилось.

В то же самое время на том же этаже, но в другой лаборатории трудился Марк Ташне, которому удалось выделить и описать другую молекулу-репрессор – на этот раз в системе переключения генов бактериофага. Оказалось, что молекулы-репрессоры – это белки, способные связываться с ДНК. Именно это и происходит с репрессором β-галактозидазы при отсутствии лактозы: он связывается с ДНК Escherichia coli на участке, расположенном поблизости от той точки, с которой начинается транскрипция гена β-галактосидазы. Таким образом, репрессор блокирует фермент, контролирующий синтез матричной РНК из гена.

После того как удалось охарактеризовать молекулу-репрессор, мы наконец смогли в целом понять молекулярные процессы, лежащие в основе жизни. Известно, что ДНК продуцирует белки посредством РНК; теперь также выяснилось, что белок может взаимодействовать непосредственно с ДНК. В таком взаимодействии участвуют белки, связывающиеся с ДНК, которые способны контролировать транскрипцию многих генов, кодирующих, возможно, другие белки-регуляторы. В связи с этим белки-регуляторы обладают координирующим влиянием на активность многих генов, и их действие характеризуется плейотропным эффектом.

После открытия центральной роли РНК в работе клетки возник интересный вопрос (ответ на который долго не удавалось найти): почему передача информации из ДНК должна опосредоваться молекулой РНК, а лишь потом возможна ее трансляция в последовательность полипептидов? Вскоре после расшифровки генетического кода Френсис Крик предложил решение этого парадокса и выдвинул идею, что РНК – предтеча ДНК. Он предположил, что РНК была первой генетической молекулой и в какой-то период вся жизнь была основана на РНК. До привычного нам нынешнего «мира ДНК» (которому пара миллиардов лет) существовал «мир РНК». Крик полагал, что своеобразная химия РНК (в ее основе присутствует сахар рибоза, а не дезоксирибоза, как в ДНК) обеспечивает ей ферментные свойства, благодаря которым РНК может катализировать собственную саморепликацию.

Крик считал ДНК «более поздней эволюционной разработкой», которая могла возникнуть из-за относительной нестабильности молекул РНК: они деградируют и мутируют гораздо легче, чем молекулы ДНК. Если требуется хорошая, стабильная молекула, подходящая в качестве долговременного хранилища генетической информации, то гораздо удобнее воспользоваться ДНК, чем РНК.

Гарри Ноллер возится с рибосомами

Идеи Крика о мире РНК, предшествовавшем миру ДНК, оставались в основном незамеченными до 1983 года. В 1983 году Том Чек из Университета штата Колорадо и Сидни Олтмен из Йеля независимо продемонстрировали, что молекулы РНК действительно обладают каталитическими свойствами, и за это открытие были удостоены Нобелевской премии по химии в 1989 году. Еще более убедительные доказательства в пользу существования мира РНК до появления ДНК появились десятилетием позже, когда Гарри Ноллер из Калифорнийского университета в городе Санта-Крус продемонстрировал, что формирование пептидных связей, обеспечивающих сочленение белков из аминокислот, не катализируется ни одним из шестидесяти разных белков, ассоциированных с рибосомой – органеллой, где синтезируются белки. Напротив, образование пептидных связей катализируется РНК. Ноллер пришел к такому выводу, удалив из рибосомы все белки и обнаружив, что она при этом не утрачивает способности образовывать пептидные связи. Исключительно подробный анализ объемной структуры рибосомы, выполненный Ноллером и другими учеными, позволяет понять, почему это происходит: белки рассыпаны по поверхности, далеко от «эпицентра действий», расположенного в центре рибосомы.

Эволюция жизни после Большого взрыва. Вероятно, мы так и не сможем узнать, когда именно возникла жизнь, но первые организмы, по-видимому, были основаны исключительно на РНК

Эти открытия позволили окончательно решить проблему «курицы и яйца», коренившуюся у истоков жизни. Доминировавшая точка зрения, согласно которой первые организмы были основаны на молекуле ДНК, столкнулась с очевидным противоречием: молекула ДНК не может собираться сама собой: для этого нужны белки! Что возникло раньше? Белки, не обладающие механизмом копирования информации, или ДНК, которая может копировать информацию, но лишь в присутствии белков? Проблема была неразрешима: считалось, что никакая ДНК без белков не получится, но белки не получатся без ДНК.

Однако РНК эквивалентна ДНК (эта молекула также может хранить и воспроизводить генетическую информацию), а также эквивалентна белкам (может катализировать критически важные химические реакции) – вот и ответ. На самом деле, в «мире РНК» проблема курицы и яйца снимается сама собой: РНК – это курица и яйцо одновременно.

РНК – это эволюционная реликвия. Справившись с той или иной проблемой, естественный отбор обычно придерживается найденного решения, фактически реализуя принцип: «пока не сломалось – не ремонтируем». Иными словами, при отсутствии селективного давления, провоцирующего изменения, клеточные системы не обогащаются никакими инновациями, поэтому несут в себе многочисленные отпечатки эволюционного прошлого. Процесс может протекать именно так, а не иначе именно потому, что данное решение было найдено раньше, а не потому, что оно является наилучшим и эффективным.

Первые двадцать лет после открытия двойной спирали были в молекулярной биологии очень плодотворными. Мы поняли базовые механизмы, лежащие в основе жизни, и даже осознали, как регулируется работа генов. Тем не менее на том этапе мы всего лишь наблюдали; мы были молекулярщиками-натуралистами, а клетка напоминала нам тропический лес. Мы описывали то, что видели вокруг. Но пришло время действовать. Довольно наблюдений: нас манила перспектива того, что вскоре мы сами сможем вмешаться и начнем манипулировать живыми существами. Все это стало реально с появлением технологий для работы с рекомбинантной ДНК, а затем и возможностей подгонки молекул ДНК под нужды человечества.

Лаборатория P4 – ультразащищенный комплекс, в котором ведутся биохимические исследования смертельно опасных организмов, например вируса лихорадки Эбола, а также разрабатывается биологическое оружие. В конце 1970-х годов в лаборатории P4 также работали ученые, исследовавшие человеческую ДНК методами генной инженерии