Текст книги "Анализы. Актуальные сведения по лабораторным исследованиям под рукой"

Кальций

Кальций – основной компонент костной ткани и зубов, участвует в свертывании крови, сокращении мышц, деятельности некоторых эндокринных желез. Всасывание и выведение кальция находятся под контролем гормонов (кальцитонина, паратиреоидного гормона) и активных метаболитов витамина D. 99 % кальция находится в костях, где он вместе с фосфором образует кристаллы гидроксиапатита, составляющего минеральную основу скелета. Несмотря на то что лишь около 1 % фиксированного кальция свободно обменивается с его растворенными фракциями, это существенно влияет на состояние костной ткани и ее механическую прочность.

Около 40 % всего кальция плазмы крови связано с белком, еще примерно 5 % образует комплексы с лимонной, фосфорной или угольной кислотой, остальной кальций находится в физиологически активном, ионизированном состоянии. Доля кальция, связанного с белками (так называемый неультрафильтруемый кальций), зависит от содержания протеина в плазме крови, поэтому четкой количественной связи между общим и ионизированным кальцием не существует, оба параметра имеют клиническое значение.

Во многих физиологических и патологических ситуациях представляет интерес именно содержание ионизированного кальция, но оно может быть определено лишь с помощью специальных кальциевых электродов, аналогичных электродам для определения рН.

Нормальная концентрация кальция в крови – 2,3–2,75 ммоль/л.

В крови кальций находится в трех формах:

1) около 0,9 ммоль/л связано с белками;

2) около 0,25 ммоль/л в комплексе с анионами (цитратом, лактатом, фосфатом, бикарбонатом);

3) 1,25 ммоль/л (около 50 %) в свободной или ионизированной форме.

Наибольшей физиологической активностью обладает ионизированный кальций.

Одним из наиболее распространенных заболеваний, связанных с нарушением обмена кальция, является остеопороз. Это системное заболевание скелета, характеризующееся снижением массы костей и нарушениями в их строении, которые приводят к значительному увеличению хрупкости костей и возможности их переломов. У здоровых людей старше 20–25 лет с возрастом происходит уменьшение костной массы со скоростью 0,5–1 % в год. У женщин в постменопаузе, а также у мужчин и женщин старческого возраста среднее уменьшение массы костей может составить 3–5 % и более в год. Риск развития остеопороза повышают такие факторы, как дефицит эстрогенов (особенно в постменопаузе), недостаток кальция и витамина D в пище, алкоголь, курение, гиподинамия.

При первичном остеопорозе уровень кальция в крови остается, как правило, в норме. При вторичном остеопорозе, который возникает в результате нарушения кальциевого обмена под действием лекарственных веществ и глюкокортикоидов, при нарушениях всасывания кальция в кишечнике, выделения почками, концентрация кальция в крови снижена.

Увеличение концентрации кальция в крови наблюдается при гиперфункции или опухолях паращитовидных желез и повышенном образовании паратиреоидного гормона, а также при различных злокачественных опухолях с метастазами в кости и заболеваниях крови (миеломная болезнь, лимфома, лимфосаркома). Уменьшение продукции паратиреоидного гормона (по разным причинам) сопровождается снижением концентрации кальция в крови.

Предложено много химических методов определения кальция в сыворотке крови и в моче; они основаны главным образом на способности образовывать окрашенные соединения с комплексонами, т. е. веществами, образующими прочные комплексы с металлами. Здесь можно выделить 2 подгруппы – либо общее количество комплекса непосредственно определяется фотометрией, либо окрашенный комплекс используется лишь как индикатор конца титрования. Методы второй группы сейчас практически не находят применения.

Основными методами определения общего кальция являются:

1) метод Вилькинсона – титрование ЭДТА в присутствии мурексида;

2) калориметрический метод с использованием креозолфталеина;

3) калориметрический метод с использованием метил-тимолового голубого;

4) флуореметрический метод с использованием кальцеина;

5) пламенная эмиссия;

6) референсный метод (атомно-абсорбционная спектрофотометрия).

Посуда для выполнения анализа должна быть изготовлена из материала, который не содержит ионы кальция. Проба берется натощак, сыворотку быстро отделяют от сгустка.

Унифицированный метод по цветной реакции с крезолфталеинкомплексоном

Принцип метода

Крезолфталеинкомплексон образует с кальцием в щелочной среде комплекс красно-фиолетового цвета, интенсивность окраски пропорциональна концентрации кальция. В реакционную смесь добавляют 8-оксихинолин, который связывает металлы, мешающие определению, но образует с кальцием менее прочный комплекс, чем крезолфталеинкомплексон.

Необходимые реактивы

1. Боратный буфер: 200 г борной кислоты (Н₃ВО₃, ортоборная кислота) растворяют при нагревании в 300 мл воды, добавляют 580 мл 5 н КОН, объем доводят водой в мерной колбе до 1 л, при температуре ниже 56 °C из раствора могут выпадать кристаллы.

2. Глицин 2 моль/л: 7,5 г глицина растворяют в 40 мл воды, переносят в мерную колбу и доводят объем до 50 мл, для консервации добавляют 2 капли хлороформа, хранят в холодильнике.

3. 8-оксихинолин (оксин), 1 %-ный раствор: 500 мг препарата растворяют в 50 мл абсолютного спирта.

4. Рабочий буферный раствор: к 300 мл воды добавляют 12,5 мл боратного буфера и 5 мл раствора глицина, перемешивают и устанавливают величину рН в пределах 10,5–10,6 с помощью 5 н КОН, добавляют 50 мл 1%-ного раствора оксихинолина, переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл и доводят до метки водой, после чего снова проверяют рН.

5. Крезилфталеинкомплексон, 0,1 %-ный раствор: 10 мг крезолфталеинкомплексона растворяют в 100 мл основного буферного раствора (при хранении в холодильнике реактив стоек не более 2–3 дней); калибровочный раствор. Основной калибровочный раствор, содержащий кальций в концентрации 25 ммоль/л, готовят, растворяя 250 мг кальция карбоната (СаСО₃) в 5 мл 1 н НСl. Раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой до метки. Для консервации добавляют 2 капли хлороформа. Одновременно готовят раствор соли магния 3 мг/мл, растворяя 2,5 г хлорида магния (MgCl₂ × 6Н₂О) в 100 мл воды. Из этих растворов готовят рабочие калибровочные растворы согласно таблице 26.

Таблица 26

Определение кальция по цветной реакции с крезолфталеинкомплексоном

Ход исследования

К 3 мл рабочего раствора крезолфталеинкомплексона добавляют 0,05 мл исследуемой сыворотки, перемешивают.

Через 5 мин фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 0,5 см при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) против рабочего раствора крезолфталеинкомплексона. Одновременно обязательно ставят хотя бы одну калибровочную пробу. Расчет ведут по калибровочной кривой либо по правилу пропорций.

Некоторые сорта стекла могут выщелачиваться, отдавая в раствор соли кальция, поэтому лабораторную посуду, особенно пробирки, желательно предварительно прокипятить в соляной кислоте. Определение желательно проводить в сыворотке или в плазме, полученной из гепаринизированной крови, так как щавелевая, лимонная кислоты и другие антикоагулянты, связывающие кальций, могут помешать определению.

Метод определения кальция по цветной реакции с глиоксаль-бис-2-оксианилом

Принцип метода

Глиоксаль-бис-2-оксианил образует с кальцием в щелочной среде окрашенный комплекс красного цвета, интенсивность которого пропорциональна концентрации кальция.

Необходимые реактивы

1. Метиловый спирт (метанол), безводный.

2. Глиоксаль-бис-2-оксианил (ГБОА), 0,05 %-ный раствор в метаноле, 50 мг препарата растворяют в 100 мл этанола (раствор нестойкий).

3. Боратный буфер рН 12,6 – растворяют в воде 10 г едкого натра (NaOH) и 10 г тетрагидробората натрия (Na₂B₄O₇ × 10Н₂О), объем доводят до 1 л в мерной колбе.

4. Ацетон.

5. Смесь метанола и ацетона 9: 1 (по объему).

6. Калибровочные растворы. Основной калибровочный раствор, содержащий 25 ммоль/л Са, готовят растворяя 100 мг карбоната кальция (СаСО₃) в 5 мл 1 н НСl и доводя объем раствора до 100 мл водой в мерной колбе. Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы с концентрацией 1,5–3,5 ммоль/л, отбирая 6–14 мл в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводя объем водой до метки (приготовление аналогично методу, описанному в предыдущем методе, но без солей магния).

Ход исследования

К 1,5 мл боратного буферного раствора прибавляют 0,02 мл исследуемой сыворотки и через l,5 мин 0,5 мл 0,05 %-ного раствора ГБОА в метаноле и еще через 1,5 мин 1 мл смеси метанола и ацетона. Фотометрируют точно через 5–10 мин после добавления 0,05 %-ного раствора ГБОА при длине волны 540–550 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см против холостой пробы, в которую вместо исследуемой сыворотки берут воду. Одновременно ставят также калибровочную пробу.

Расчет выполняют по калибровочному графику либо по правилам пропорции.

ГБОА в щелочной среде распадается с образованием анилина и глиоксаля, который затем окисляется в глиоксалевую кислоту, способную образовывать комплексы с кальцием. Даже в растворе абсолютного метанола на протяжении нескольких недель реактив разрушается. Накапливающаяся глиоксалевая кислота в значительно большей степени сказывается на экстинкции опытных, нежели калибровочных, проб. Поэтому измерение оптической плотности должно проводиться в совершенно определенное время, причем при длине волны 540–550 нм показания стабильнее, чем при длине 530 нм, при которой наблюдается максимум пика.

Метод определения кальция по цветной реакции с мурексидом в присутствии глицерина

Принцип метода

Мурексид образует с кальцием в щелочной среде окрашенный комплекс, устойчивость которого повышается путем добавления в раствор глицерина.

Необходимые реактивы

1. Мурексидглицериновый реактив – 20 мг мурексида растворяют в 10 мл 4 н КОН, 1 мл этого раствора смешивают с 20 мл смеси из 10 мл воды и 10 мл глицерина.

2. Калибровочные растворы готовят так же, как и в предыдущем методе.

Ход исследования

В 0,3 мл воды вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки, затем туда же добавляют 3 мл мурексидглицеринового реактива, перемешивают и через 5 мин фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 490 нм против холостой пробы, в которой вместо исследуемой сыворотки применяют воду. Одновременно ставят калибровочную пробу, в которую вместо сыворотки берут 0,1 мл калибровочного раствора.

Расчет производят по калибровочному графику.

Определение уровня ионизированного кальция

В современных газовых анализаторах имеется встроенный блок для определения концентрации ионизированного кальция.

Фосфор и фосфорсодержащие вещества

Фосфор находится в организме в форме неорганических фосфатов, в комплексе с липидами (липидный фосфор) и нуклеотидами (кислоторастворимый фосфор). Входит в состав скелета, фосфолипидов мембран, 2,3-дифосфоглицерата (вещества, определяющего способность гемоглобина присоединять кислород), участвует в процессах накопления и освобождения энергии в клетках (в составе АТФ, АДФ, АМФ), в ферментативных реакциях (в составе НАДФ). Поступает с пищей; всасывание в тонком кишечнике фосфора и кальция тесно связано и регулируется кальциферолом. Выведение с мочой зависит от функционального состояния почек.

Нормальная концентрация в крови: фосфор неорганический – 1–2 ммоль/л, фосфор липидный – 2,0–3,5 ммоль/л, в эритроцитах – 3–5 ммоль/л, фосфор кислоторастворимый (эритроциты) – 7–14 ммоль/л, в моче (неорганический фосфор) – 25,8–48,4 ммоль/сутки.

Определение концентрации фосфора в крови чаще всего назначается при нарушениях обмена кальция, так как наибольшее диагностическое значение имеет соотношение количества кальция и неорганического фосфора.

Увеличение концентрации отмечается при почечной недостаточности, передозировке витамина D, недостаточности паращитовидных желез, в некоторых случаях при миеломной болезни, нарушениях липидного обмена (липидный фосфор). Количество кислоторастворимого фосфора увеличивается при всех заболеваниях, сопровождающихся кислородной недостаточностью.

Снижение концентрации происходит при дефиците витамина D, первичном гиперпаратиреозе, диабетическом кетоацидозе, алиментарной недостаточности, респираторном алкалозе, болезни Крона, нарушениях всасывания в кишечнике, рахите, гиперфункции паращитовидных желез.

Определение неорганического фосфора

Унифицированный метод определения фосфора по восстановлению фосфорно-молибденовой гетерополикислоты

Принцип метода

Белки осаждают трихлоруксусной кислотой, в кислой среде фосфорная кислота образует с молибденовой кислотой фосфорно-молибденовую гетерополикислоту, которая восстанавливается эйконогеном с образованием ярко окрашенного молибденового синего.

Необходимые реактивы

1. Кислота трихлоруксусная, раствор 100 г/л (10 %-ный).

2. Кислота серная 5 н.

3. Аммоний молибденовокислый, 5 %-ный раствор готовят, растворяя 5 г (NH₄)₆Мо₇О₂ × 4Н₂О в 100 мл 5 н серной кислоты.

4. Натрий кислый сернистокислый NaHSO₃ (в такой форме соль существует только в растворе, это скорее коммерческое, нежели химическое название). При кристаллизации выпадает пиросернистокислый натрий (Na₂S₂O₅), который называют также метабисульфитом. Все 3 названия – бисульфит, пиросульфит и метабисульфит – синонимы. Препараты с этими названиями могут быть с равным успехом использованы для определения фосфора.

5. Натрий сернистокислый безводный, сульфид натрия Na₂SO₃.

6. Эйконоген, раствор. Растворяют полностью 6 г бисульфита натрия в 20–25 мл воды, вносят в этот раствор 0,1 г эйконогена (аминонафтолсульфоновой кислоты), который также должен полностью раствориться, на что уходит некоторое время.

7. Отдельно в небольшом объеме растворяют 1,2 г безводного сернокислого натрия, оба раствора смешивают, доводят объем до 50 мл, дают отстояться несколько часов и фильтруют.

8. Калибровочный раствор. Основной калибровочный раствор, содержащий 50 ммоль фосфора в 1 л, готовят, растворяя 702,2 мг высушенного до постоянной массы при температуре 120 °C однозамещенного фосфата калия КН₂РО₄ в 100 мл воды. Из него готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 1, 2 и 3 ммоль/л. Для этого 1, 2 или 3 мл основного раствора доводят водой до объема 50 мл.

Ход исследования

К 1 мл прибавляют 4 мл воды и 5 мл раствора трихлоруксусной кислоты, через 10 мин центрифугируют или фильтруют. К 5 мл безбелкового фильтрата добавляют 1 мл раствора молибденовокислого аммония, 0,2 мл раствора эйконогена и 1,8 мл воды. Через 20 мин фотометрируют при длине волны 630–690 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см против холостого опыта. Одновременно ставят холостой опыт, в который вместо исследуемой сыворотки добавляют воду, и калибровочные опыты, в которые вместо сыворотки берут рабочие калибровочные растворы.

Расчет проводят по калибровочному графику или правилу пропорций.

Чувствительность метода можно значительно повысить, если после добавления эйконогена пробы нагревать в течение 7 мин на кипящей водяной бане и фотометрировать при длине волны 830 нм. В этом случае вместо 5 %-ного раствора молибденового аммония берут 0,5 %-ный раствор в 0,5 н серной кислоте, остальные реактивы те же. Согласно унифицированному методу окончательный объем фотометрируемых проб составляет 8 мл. Если объем кюветы меньше, все дозировки можно пропорционально уменьшить.

Метод определения фосфора по образованию окрашенного комплекса малахитового зеленого с фосфорно-молибденовой кислотой

Принцип метода

Неорганический фосфор образует с молибденовой кислотой фосфорно-молибденовую гетерополикислоту, которая, реагируя с основным красителем – малахитовым зеленым, дает зеленовато-синее окрашивание.

Если фосфора нет, то малахитовый зеленый в кислой среде окрашен в желто-коричневый цвет. Белок не мешает проведению реакции, поэтому депротеинизацию не проводят, для обеспечения коллоидной устойчивости образовавшегося комплекса в раствор добавляется твин 20.

Необходимые реактивы

1. Малахитовый зеленый.

2. Аммоний молибденовокислый.

3. Цветной реактив – 1,5 г малахитового зеленого растворяют в 250 мл воды, одновременно растворяют 10,3 г молибденовокислого аммония в 250 мл 5 н НСl. Оба раствора смешивают, дают отстояться и фильтруют, за это время цвет реактива меняется.

4. Твин 20, 1,5 %-ный раствор – 0,15 мл твина 20 разводят 10 мл воды.

5. Калибровочный раствор. Основной калибровочный раствор, содержащий 50 ммоль/л, готовят, растворяя 702,2 мг однозамещенного кислого фосфата калия КН₂РО₄, высушенного при температуре 120 °C до постоянной массы, в 1 л воды. Из него готовят калибровочный раствор, содержащий 20 мкмоль/л.

Ход исследования

0,02 мл сыворотки вносят в 1,5 мл воды, к раствору добавляют 2 мл цветного реактива и 1 каплю 1,5 %-ного раствора твина. Через 10–15 мин фотометрируют при длине волны 600–650 нм против холостого опыта, который ставят так же, как и основной опыт, но без сыворотки.

Для построения калибровочного графика берут 0,5; 1 и 1,5 мл рабочего калибровочного раствора, т. е. 10, 20 и 30 нмоль фосфора, доводят объем до 1,5 мл, добавляют цветной реактив и раствор твина так же, как в основном опыте. Калибровочная проба, в которую взято 20 нмоль фосфора, по окраске соответствует опытной пробе, у которой взята сыворотка, содержащая фосфор в концентрации 1 ммоль/л. Калибровочные пробы, в которые взято 10 и 30 нмоль, соответствуют сывороткам, содержащим 0,5 и 1,5 ммоль фосфора в 1 л. По этим данным строится калибровочная кривая, которая и используется для Расчета.

Определение липидного фосфора

Унифицированный метод определения фосфора после осаждения белков трихлоруксусной кислотой

Принцип метода

При осаждении белков крови трихлоруксусной кислотой все фосфолипиды осаждаются вместе с белковым сгустком, а неорганический и кислоторастворимый фосфор остаются в растворе. Белковый сгусток минерализуется нагреванием с хлорной кислотой, и фосфор определяется эйконогеновым методом. В связи с тем что белки плазмы не содержат фосфора, весь осаждаемый трихлоруксусной кислотой фосфор входит в состав фосфолипидов.

Необходимые реактивы

1. Кислота хлорная 57 %-ная, ее концентрация должна быть 5,7 н, что проверяется титрованием. Если концентрация значительно ниже, что часто случается, так как препарат может содержать 40 или 50 % НСlО₄, соответственно увеличивается количество реактива, используемого при минерализации.

2. Кислота трихлоруксусная, 100 г/л (10 %-ный).

3. Аммоний молибденовокислый, раствор 40 г/л. Готовят, растворяя 4 г (NH₄) Mo₇O₂₄ × 4H₂O в 100 мл воды.

4. Натрий кислый сернистокислый.

5. Натрий сернистокислый безводный.

6. Эйконоген, раствор.

7. Калибровочный раствор. Основной калибровочный раствор, содержащий 50 ммоль фосфора в 1 л, разводят водой в 50 раз; получается раствор, содержащий 1 мкмоль/мл.

Ход исследования

К 0,2 мл исследуемой сыворотки добавляют 3 мл воды и медленно 3 мл 10 %-ного раствора трихлоруксусной кислоты, через 1–2 мин центрифугируют, надосадочную жидкость сливают – пробирку переворачивают и дают стечь жидкости. К осадку добавляют 1 мл 57 %-ной хлорной кислоты; если ее концентрация ниже, соответственно увеличивают количество кислоты, переносят в колбу или в большую пробирку для сжигания и минерализуют.

Минерализация – наиболее ответственный этап определения. Дигидрат хлорной кислоты НСlО₄ × 2Н₂О кипит при температуре 203 °C, при более низкой температуре из пробы удаляют воду, а при повышении температуры начинает улетучиваться сама хлорная кислота. Температурный режим должен быть подобран так, чтобы пары дигидрата хлорной кислоты конденсировались на стенках и в виде капелек опускались на дно, где опять испарялись, и т. д. При оптимальных условиях минерализация заканчивается за несколько часов; если температура слишком низкая, она затягивается, если слишком высокая, хлорная кислота улетучивается, и проба будет испорчена. Лучше всего сжигать пробы в больших пробирках 20 × 200 мм, которые устанавливают в подогреваемом электричеством металлическом блоке (каждую пробирку в отдельном гнезде). Сверху пробирки прикрывают специальными затычками или колпачками, на которых также конденсируются и стекают вниз пары хлорной кислоты. Высота блока должна быть 2–3 см; большая часть пробирки, которая находится над блоком, остается свободной и относительно холодной, на ней и конденсируется хлорная кислота. Желательно, чтобы температура в блоке поддерживалась на уровне 200–210 °C с помощью электронного реле, соединенного с контактным термометром (как в термостате). Такое устройство позволяет сжигать большое количество проб с наименьшими затратами времени лаборанта, но можно работать также с круглодонными колбами с длинными горлышками (колбы Кьельдаля) на песчаной бане, но это требует большего внимания к ходу минерализации. Внешний признак того, что минерализация окончилась, – просветление проб, но он может быть обманчивым. В то же время слишком длительное нагревание приводит к потерям, поэтому перед началом серийных анализов надо отработать режим сжигания, проверяя воспроизводимость в серии.

После охлаждения к минерализованной пробе прибавляют 7 мл воды, 1 мл раствора молибденовокислого аммония и 1 мл раствора эйконогена, объем доводят водой до 10 мл. Через 20 мин фотометрируют в кюветах с длиной оптического пути 1 см при длине волны 630–690 нм против холостого опыта, в который берут 0,8 мл хлорной кислоты, 7 мл воды и далее проводят цветную реакцию так же, как и в опыте.

Для построения калибровочной кривой минерализуют калибровочные пробы, содержащие 0,2–1 мкмоль фосфора. Для этого к ним прибавляют по 1 мл хлорной кислоты и ставят нагревать вместе с опытными пробами, после чего проводят цветную реакцию. По калибровочному графику вычисляют содержание фосфора в пробе, эту величину умножают на 5 и получают концентрацию мкмоль/мл или ммоль/л.

После минерализации образовавшийся неорганический фосфор может быть определен любым методом, в том числе и наиболее чувствительным с малахитовым зеленым. Иногда в процессе минерализации образуется некоторое количество пирофосфата, что приводит к заниженным результатам анализа. В этом случае пробу после разведения водой ставят на несколько минут на кипящую водяную баню, при этом пирофосфат гидролизуется.

Определение фосфонуклеотидов

Определение нуклеотидов эритроцитов электрофоретическим методом

Принцип метода

Белки эритроцитов осаждают трихлоруксусной кислотой, надосадочную жидкость подвергают электрофорезу на бумаге в цитратном буфере рН 5,1. Пятна АТФ и АДФ идентифицируют в ультрафиолетовом свете, вырезают, элюируют и количественно определяют прямой спектрофотометрией в ультрафиолетовом свете при длине волны 260 нм.

Необходимые реактивы

1. Натрия цитрат трехзамещенный.

2. Гепарин, ампулированный препарат, активность 5000 ЕД/мл.

3. Натрия хлорид 0,85 %-ный раствор (физиологический раствор).

4. Кислота трихлоруксусная 150 г/л (15 %-ный раствор).

5. НСl 0,01 н.

6. Цитратный буфер рН 5,1 готовят, растворяя в воде 17,65 г натрия цитрата трехзамещенного и 4,41 г лимонной кислоты. Объем доводят до 1 л.

7. Бумага для электрофореза, разрезанная на ленты 35 × 200 мм.

Ход исследования

Кровь берут с гепарином из Расчета 0,1 мл на 5 мл крови. Эритроциты отделяют центрифугированием, плазму отсасывают, а клетки дважды промывают изотоническим раствором натрия хлорида при температуре 4 °C, каждый раз центрифугируя, отсасывая надосадочную жидкость и вновь ресуспендируя в новой порции раствора. К 0,5 мл эритроцитной взвеси добавляют 0,5 мл 15 %-ной трихлоруксусной кислоты, перемешивают палочкой, выдерживают при температуре 4 °C в течение 10 мин и центрифугируют. Надосадочную жидкость используют для определения нуклеотидов.

Электрофоретическую камеру заполняют цитратным буфером рН 5,1 и смачивают бумагу для электрофореза согласно правилам работы на приборе. На место старта равномерной поперечной полосой наносят 0,05 мл исследуемого трихлоруксусного экстракта и проводят электрофорез при напряжении 12–14 В/см при силе тока 0,5–1 мА на 1 см поперечного сечения ленты в течение 3,5 ч. После этого электрофореграммы высушивают в темноте и рассматривают при освещении коротким ультрафиолетовым светом (длина волны меньше 300 нм, можно пользоваться ультрахемоскопом Блюмберга или другим аналогичным прибором). Бумага слегка флюоресцирует за счет примесей, а адениловые нуклеотиды, которые сильно поглощают свет в этой области, видны в виде темных пятен. Ближе к старту находится АДФ, дальше от старта – АТФ. Контуры пятен обводят карандашом, вырезают и элюируют 5 мл 0,01 н НСl в течение 4 ч. Одновременно экстрагируют аналогичный участок бумаги, не содержащий нуклеотидов; этот раствор используют в качестве холостого опыта. Экстинкции всех растворов измеряются при длине волн 260 и 290 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см, из первой величины вычитают вторую.

Расчет основывается на данных молярного коэффициента экстинкции при длине волны 260 нм, который у разных нуклеотидов несколько различается, однако этими небольшими различиями можно пренебречь и принять его равным 14,2 × 10³. Это значит, что такая величина оптической плотности получится, если фотометрировать в кювете с длиной оптического пути 1 см раствор концентрации 1 моль/л и вычесть из этой величины оптическую плотность при 290 нм. Для раствора концентрации 1 мкмоль/л величина будет 0,0142.

В данном методе окончательное разведение пробы в 200 раз (нуклеотиды из 25 мкл эритроцитной массы оказываются в 5 мл), поэтому Расчет производят по формуле:

Е × 200 / 0,0142 = Е × 14 085 мкмоль / л эритроцитарной массы,

где Е – разность оптических плотностей, измеренных при длинах волн 260 и 290 нм.

Нормальные величины: для АТФ – 600–1400 мкмоль/л, для АДФ – 250–800 мкмоль/л, отношение молярных концентраций АТФ / АДФ в норме 2.

Определение адениловых нуклеотидов эритроцитов методом тонкослойной хроматографии

Принцип метода

Белки эритроцитов осаждаются хлорной кислотой, избыток которой удаляется в виде калиевой соли. Безбелковый фильтрат хроматографируется в тонком слое на пластинах «Силуфол», нуклеотиды идентифицируются в ультрафиолетовом свете и определяются по светопоглощению элюатов.

Необходимые реактивы

1. Диоксан.

2. Изопропиловый спирт.

3. Аммиак, концентрированный раствор.

4. Кислота хлорная, 0,8 н (8 %-ная НСlО₄).

5. Калия карбонат, раствор 2 моль/л готовят, растворяя 27,6 г карбоната калия (поташ, К₂СО₃) в воде, объем доводят до 100 мл. В случае необходимости препарат предварительно сушат при температуре 105–110 °C.

6. Подвижная фаза для хроматографии – смешивают 40 мл диоксана, 20 мл изопропилового спирта, 40 мл воды и 10 мл концентрированного раствора аммиака. Можно использовать и более простую систему, которую готовят без изопропанола, смешивая 40 мл диоксана, 40 мл воды и 10 мл раствора аммиака.

7. НСl, 0,1 н.

8. Натрия хлорид, 0,85 %-ный раствор (изотонический раствор).

9. Пластины для тонкослойной хроматографии «Силуфол».

Ход исследования

Кровь берут с гепарином, добавляя его из Расчета 12 ME на 1 мл крови. Эритроциты отделяют центрифугированием, плазму отсасывают, а клетки 3 раза промывают холодным изотоническим раствором натрия хлорида, каждый раз центрифугируя по 20 мин при скорости 3000 об./мин.

К 1 мл эритроцитной массы добавляют 1 мл раствора хлорной кислоты, перемешивают и через несколько минут осадок отделяют центрифугированием. К 1 мл надосадочной жидкости прибавляют 0,1 мл раствора калия карбоната и оставляют на холоде, пока полностью не выпадут кристаллы образовавшегося перхлората калия. 0,05–0,1 мл холодной надосадочной жидкости (если она согреется, кристаллы частично растворяются) наносят в виде полоски на пластину «Силуфол» и проводят восходящую хроматографию в течение 60–90 мин в смеси диоксана, изопропилового спирта и аммиака.

Перед началом хроматографии камера должна быть насыщена парами растворителя, фронт растворителя должен пройти расстояние не менее 3/4 пластины; если он не пройдет его, то наиболее вероятная причина этого – плохое насыщение камеры парами подвижной фазы или плохая герметизация камеры.

Вынутые из камеры пластины высушивают на воздухе и просматривают в коротком ультрафиолетовом свете (на ультрахемоскопе Блюмберга или другом аналогичном приборе), находят пятна нуклеотидов и обводят их острым предметом. В этой системе быстрее всего движется АМФ, медленнее – АТФ. Порошок с отмеченных мест пластины соскабливают и элюируют 3 мл 0,1 н НСl. Определяют светопоглощение надосадочной жидкости при длине волны 260 нм.

При налаживании методики рекомендуется провести определение в калибровочном растворе, содержащем в 1 мл 30–60 нмоль (15–30 мкг) ампулированного препарата АТФ, который непосредственно наносят на хроматографическую пластину так же, как и нейтрализованный хлорный экстракт. Эти препараты обычно помимо АТФ содержат также АДФ и АМФ.

Расчет проводят исходя из молярных коэффициентов экстинкции: для АТФ – 14 600, для АДФ – 15 000, для АМФ – 14 700. Если для хроматографии было взято 0,1 мл нейтрализованного экстракта и окончательный объем после элюации был 3 мл, разведение составляет 1: 63, поэтому для того чтобы выразить концентрацию АТФ в мкмоль/л, надо величину умножить на 4315, для АДФ коэффициент составляет 4200, для АМФ – 4286. Если же для хроматографии берут 0,05 мл нейтрализованного экстракта, коэффициенты должны быть в 2 раза выше.

Нормальные величины: содержание АТФ – 726 × 2,4 мкмоль/л, содержание АДФ – 262 × 1,2 мкмоль/л, АМФ – 4,1 × 1,3 мкмоль/л.