Текст книги "Анализы. Актуальные сведения по лабораторным исследованиям под рукой"

Магний

Магний – второй по концентрации после калия внутриклеточный катион, входит в состав ряда ферментов. Наиболее необходим для функционирования сердца, нервной и мышечной ткани. Он содержится в мышечной и костной ткани. Активность многих ферментов зависит от магния.

Нормальная концентрация: в плазме – 0,7–1,2 ммоль/л, в моче – 3–5 ммоль/сутки.

Общее содержание в организме – около 1640 ммоль, из них:

1) в скелете – около 50 %;

2) в мышцах – около 30 %.

Суточная потребность – 300–400 мг.

Снижение концентрации магния обнаруживается одновременно в крови и моче при больших потерях воды (продолжительные поносы, полиурия при заболеваниях почек, прием мочегонных средств), при нарушениях всасывания в кишечнике, хроническом алкоголизме, в период беременности. Недостаток магния проявляется нарушениями сердечной деятельности, а при значительном дефиците – судорогами.

Избыточное содержание магния отмечается при хронической почечной недостаточности, гипофункции щитовидной железы и вызывает замедление проведения нервного импульса в проводящей системе сердца, блокаду нервно-мышечной передачи.

Методы определения магния во многом близки методам определения кальция, так как и в том и в другом случае на первом месте по точности стоит атомная абсорбция, на втором – химические методы, основанные на образовании окрашенных комплексных соединений.

Хотя магний, подобно кальцию, только частично находится в плазме крови в ионизированном состоянии, а частично связан с белками и низкомолекулярными комплексообразователями – лимонной и фосфорной кислотами, клиническое значение имеет только определение общего магния.

Известно много веществ, образующих окрашенные или флюоресцирующие комплексы с магнием, аналитическая пригодность их определяется чувствительностью и способностью избирательно реагировать с магнием в присутствии кальция. Однако абсолютной избирательности достичь очень трудно, поэтому приходится использовать составные калибровочные растворы, в которых присутствуют несколько веществ.

Давно известен не очень чувствительный метод определения с титановым желтым, который достаточно специфичен, но требует предварительной депротеинизации, благодаря чему может быть использован для определения магния в эритроцитах. Значительно чувствительнее метод с магоном (ксилидиновым синим II) или его сульфопроизводным (ксилидиновым синим I). В кислой среде это вещество существует в виде окрашенного в красный цвет недиссоциированного соединения, в слабощелочной – в виде однозарядного иона синего цвета, а в сильнощелочной – в виде двухзарядного иона красного цвета. С ионом магния образуют устойчивый окрашенный в красный цвет комплекс два однозарядных иона.

Определение магния по цветной реакции с титановым желтым

Принцип метода

Магний в щелочной среде образует комплекс красного цвета с титановым желтым, присутствие гидроксиламина стабилизирует окраску. При анализе сыворотки или эритроцитов белки осаждают вольфраматом натрия, моча предварительно разводится до нужной концентрации.

Необходимые реактивы

1. 0,075 %-ный раствор титанового желтого: 18,7 мг вещества растворяют в 25 мл воды, хранят в холодильнике в темной склянке (реактив очень светочувствителен, годен не более 10 дней).

2. 2 %-ный раствор гидрохлорида гидроксиламина: 2 г гидроксиламина гидрохлорида растворяют в 100 мл воды.

3. 0,1 %-ный раствор метилового красного в 95 %-ном этиловом спирте (индикатор с зоной перехода рН 4,4–6,2).

4. 0,2 н NaOH.

5. 1,5 н NaOH.

6. 10 %-ный раствор вольфрамовокислого натрия: 10 г вольфрамата натрия (Na₂WO₄) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл.

7. 0,67 н серная кислота.

8. Калибровочный раствор магния сульфата 1 ммоль/л: 246,5 мг сульфата магния (MgSO₄ × 7H₂O) растворяют в воде, объем доводят в мерной колбе до 1 л.

Ход исследования

К 2 мл воды добавляют 1 мл исследуемой сыворотки и 1 мл 10 %-ного вольфрамата натрия, затем 1 мл 0,67 н серной кислоты. Перемешивают стеклянной палочкой, а затем через 10–15 мин центрифугируют или фильтруют. В градуированную пробирку или мерный цилиндр с отметкой 10 мл отмеривают 2,5 мл безбелкового фильтрата, добавляют каплю индикатора метилового красного и 0,2 н NaOH до установления желтой окраски. После этого прибавляют 1 мл 2%-ного гидрохлорида гидроксиламина, 1 мл 0,075 %-ного титанового желтого и 2 мл 1,5 н NaOH и доводят объем водой до 10 мл. Фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 500–560 нм против холостого опыта, в котором вместо сыворотки крови берут 1 мл воды.

Для построения калибровочного графика в серию пробирок вносят от 0,2 до 1 мл калибровочного раствора 1 ммоль/л, доводят водой до объема 6 мл, прибавляют по 1 мл 2%-ного гидрохлорида гидроксиламина, 0,075 %-ного титанового желтого и 2 мл 1,5 н NaOH. Окраска раствора, в который добавлено 0,2 мл калибровочного раствора, соответствует содержанию магния в плазме 0,4 ммоль/л, раствора, в который добавлено 0,5 мл, – концентрации 1 ммоль/л и т. д.

При определении содержания магния в эритроцитах 0,5 мл эритроцитарной взвеси, полученной так же, как и при определении в клетках калия и натрия, вносят в 2,5 мл воды. Через несколько минут, когда взвесь просветлеет (станет лаковой), что свидетельствует о завершении гемолиза, добавляют вольфрамат натрия, серную кислоту и так далее аналогично определению в плазме. Метод пригоден также для определения магния в моче. В этом случае ее разводят водой в 10 или 20 раз (так как концентрация может сильно колебаться), к 0,5 мл приливают 5,5 мл воды, по 1 мл растворов гидрохлорида гидроксиламина и 0,075 %-ного титанового желтого, а также 2 мл 1,5 н NaOH и фотометрируют.

Определение магния по цветной реакции с магоном

Принцип метода

Магний дает с магоном (ксилидиловым синим II) яркое окрашивание, белки сыворотки не препятствуют его развитию. В связи с тем что на интенсивности окраски сказывается присутствие других катионов, используют комплексный калибровочный раствор.

Необходимые реактивы

1. Раствор магона, содержащий 0,28 ммоль/л: 115,4 мг магона при нагревании растворяют в 50 мл диметилформамида, объем доводят до 1 л 96 %-ным этиловым спиртом.

2. 0,02 М боратный буфер рН 9,5: примерно в 800 мл воды растворяют 7,63 г буры (Na₂B₄O₇ × 10Н₂О), прибавляют 79 мл 0,1 н NaOH и проверяют рН, добавляют столько щелочи, сколько необходимо, чтобы рН был 9,5, после чего водой доводят объем до 1 л.

3. Рабочий раствор магона – в день определения смешивают равные части раствора магона и боратного буфера; реактив нестоек, годен в течение одного рабочего дня.

4. Комплексный калибровочный раствор: 200 мг металлического магния в виде стружки промывают разбавленной НСl, водой, спиртом и эфиром, высушивают сначала в токе азота, затем под вакуумом и растворяют в 15 мл концентрированной НСl, добавляют около 200 мл воды и 2,5 г кальция карбоната (СаСО₃), 2,86 г калия хлорида (КСl) и 65,4 г натрия хлорида (NaCl); после растворения всех ингредиентов объем доводят водой до 1 л. Получается раствор, содержащий 200 мг магния в 1 л, перед употреблением его разводят водой в 10 раз, получается рабочий калибровочный раствор, содержащий 0,823 ммоль/л магния (2 мг%).

Ход исследования

К 4 мл рабочего раствора магона прибавляют 30 мкл исследуемой сыворотки или спинномозговой жидкости, перемешивают и фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 505 нм против холостого опыта, в котором вместо сыворотки берут воду. Одновременно ставят калибровочный опыт, в котором вместо сыворотки берут 30 мкл рабочего калибровочного раствора, содержащего 0,823 ммоль/л магния. Расчет ведут по правилу пропорций.

Хлориды

Хлориды поступают в организм в виде солей натрия, кальция, магния, которые при растворении диссоциируют на катионы и анионы хлора. Ионизированный хлор играет большую роль в поддержании кислотно-щелочного равновесия и баланса воды в организме.

Нормальная концентрация в крови:

1) новорожденные до 30 дней – 98–113 ммоль/л;

2) взрослые – 97–108 ммоль/л, в моче – 150–250 ммоль/сутки;

3) взрослые старше 90 лет – 98–111 ммоль/л.

У здоровых людей, несмотря на избыточное или недостаточное поступление хлористого натрия (поваренной соли), в крови сохраняется нормальная концентрация ионов хлора благодаря регулированию их выведения с мочой.

Клиническое значение определения хлоридов такое же, как и натрия.

Увеличение концентрации хлоридов в крови – признак обезвоживания – может возникать при недостаточном поступлении жидкости, нарушении мочеотделения при заболеваниях почек или закупорке мочеточников, при несахарном диабете, респираторном алкалозе, повышенной функции коры надпочечников, травмах головы, сопровождающихся повреждением гипоталамуса.

Снижение концентрации хлоридов в крови возникает при избыточном потоотделении, рвоте, респираторном и метаболическом ацидозе, применении диуретиков, появлении отеков, истощении запасов натрия при потерях солей из ткани мозга после травмы головы, острой порфирии, синдроме неадекватной секреции антидиуретического гормона.

Повышенное выведение с мочой отмечается при недостаточности коры надпочечников, истощении запасов натрия, хроническом нефрите; уменьшенное выведение – при развитии отеков, голодании, рвоте, усиленном потоотделении.

Концентрация хлоридов резко возрастает в поте и слюне при муковисцидозе.

Хлор, как и натрий, – внеклеточный элемент, поэтому их определение имеет аналогичное клиническое значение с той разницей, что физиологические механизмы поддерживают концентрацию натрия в значительно более узких пределах. Происходит это потому, что натрий – основной катион внеклеточных жидкостей, на его долю приходится 92–93 % всех положительных зарядов, в то время как главных анионов три: хлор, бикарбонат и органические кислоты, причем на долю хлора приходится лишь 2/3 их общего количества. Хотя сумма анионов так же постоянна, как и сумма катионов, но колебания хлора относительно больше, чем натрия, так как уравновешиваются изменениями других анионов.

Определение натрия в биологических жидкостях на пламенном фотометре просто и надежно; для хлора аналогичного метода нет, поэтому натрий определяют в биохимических лабораториях значительно чаще, чем хлор. Однако в некоторых случаях, если речь идет об анализе отдельных проб в небольших лабораториях, особенно при исследовании мочи, определение хлора предпочтительнее, так как не требует почти никакого оборудования. Одновременное определение и хлора, и натрия вместе с другими неорганическими ионами плазмы иногда используют для того, чтобы вычислить содержание органических кислот, которое соответствует разности между суммами неорганических катионов и анионов.

Хлор чаще всего определяют титрованием, так как, подобно другим галогенам, Сl^— образует плохо растворимые соли с ионами серебра и ртути. Основная методическая проблема – как установить конец титрования, т. е. появление избытка серебра или ртути. Для этого используются электрохимические методы или обратное титрование, когда ионы хлора осаждаются ионами серебра, а их избыток затем оттитровывается роданид-ионами, используя в качестве индикатора конца титрования соли железа. Однако практичнее всего прямой метод, при котором к исследуемому раствору добавляются соли ртути, а в осадок выпадает нерастворимая каломель. Эти методы возможны благодаря эффективным индикаторам на ртуть – органическим веществам, ртутные соли которых окрашены. Когда весь хлор удален из раствора, новые порции титранта окрашивают его. На этом основан унифицированный метод, в котором в качестве индикатора на ртуть используется дифенилкарбазон.

Самые распространенные методы определения хлора – аппаратурные, в которых используется кулонометрическое титрование. Оно заключается в том, что измеряется количество электричества, необходимое для того, чтобы удалить весь хлор из раствора. Анализ сводится к тому, что небольшое количество исследуемой жидкости (порядка 0,01–0,02 мл) – плазмы, сыворотки, мочи или пота – разводится буферным раствором, содержащим соли азотной кислоты. В раствор погружены 3 электрода: рабочий, индикаторный и индифферентный. К рабочему (серебряному) электроду прилагается положительный электрический потенциал, в результате чего через раствор течет ток, количество которого измеряется специальной электронной схемой – кулонометром. Атомы серебра на рабочем электроде превращаются в ионы Ag⁺, которые сразу же реагируют с ионами Сl^—, в результате чего выпадает нерастворимое хлорное серебро. Когда весь хлор удален из раствора, концентрация в нем резко возрастает; это улавливается индикаторным электродом, сигнал с которого останавливает титрование. Содержание хлора в пробе вычисляется по формуле Фарадея, которая связывает количества электрического тока и выделившегося серебра, потребовавшегося, чтобы связать весь хлор.

Унифицированный меркуриметрический метод определения хлора

Принцип метода

Исследуемая биологическая жидкость титруется раствором азотнокислой ртути, образующаяся каломель выпадает в осадок. Когда весь хлор связан, избыток ионов ртути образует с индикатором дифенилкарбазоном темное, сине-лиловое окрашивание, что служит признаком конца титрования.

Необходимые реактивы

1. Ртуть азотнокислая, раствор 6 ммоль/л: 2 г Hg(NO₃)₂ × 0,5Н₂О растворяют в 200 мл воды, добавляют 20 мл 2 н азотной кислоты и доводят водой до 1 л.

2. Дифенилкарбазон, спиртовой раствор: 100 мг дифенилкарбазона растворяют в 100 мл 96 %-ного этилового спирта, хранят в посуде из темного стекла в холодильнике (стоек в течение месяца).

3. Азотная кислота, 2 н: 14 мл концентрированной азотной кислоты (плотность 1,4) разводят в 100 мл воды.

4. Калибровочный раствор, 10 ммоль/л: хлорид натрия (поваренная соль) высушивают до постоянной массы при температуре 120 °C, 584 мг препарата растворяют в воде и доводят объем до 1 мл.

Ход исследования

Сначала устанавливают величину фактора раствора для титрования (титранта). Для этого в маленький стаканчик или колбочку вносят 2 мл калибровочного раствора и 4 капли (0,2 мл) раствора фенилкарбазона, постоянно перемешивая, титруют раствором азотнокислой ртути до появления темного окрашивания. Фактор титранта вычисляют, разделив 20 (количество микромолей хлорид-ионов в калибровочной пробе) на число миллилитров, пошедших на титрование. Фактор указывает, какому количеству микромолей хлорид-ионов соответствует 1 мл титранта.

При исследовании опытной пробы поступают аналогично: в маленький стаканчик или колбочку наливают 1,8 мл воды и вносят 0,2 мл исследуемой биологической жидкости, добавляют 4 капли (0,2 мл) раствора дифенилкарбазона и титруют раствором азотнокислой ртути при постоянном перемешивании до появления темной окраски. Удобнее всего перемешивать магнитной мешалкой. На титрование сыворотки должно пойти примерно 3 мл титранта.

Раствор азотнокислой ртути можно приготовить из красной окиси ртути. Для этого 1,3 г HgO растворяют в 11 мл концентрированной азотной кислоты и доводят объем водой до 1 л. Раствор дифенилкарбазона должен быть красно-оранжевого цвета; если окраска становится желтой или вишнево-красной – реактив непригоден.

Микроэлементы

К микроэлементам относят химические элементы, содержание которых в организме колеблется от нескольких микрограммов до нескольких нанограммов. Несмотря на такое мизерное количество, их влияние на биохимические процессы и функции организма очень существенно, так как они входят в состав ферментов, комплексы белков и нуклеиновых кислот, являются катализаторами многих процессов. Избыток или недостаток микроэлементов может приводить к тяжелым расстройствам функций клеток и органов. Определение концентрации микроэлементов проводят только в специализированных лабораториях и в особых случаях, так как, во-первых, нарушение баланса микроэлементов как самостоятельная причина заболеваний встречается редко, и, во-вторых такой анализ продолжителен и дорогостоящ в силу сложности и трудоемкости.

Для анализа используют не только кровь, мочу или ткани, но и волосы, иногда – ногти, где микроэлементы накапливаются и долго сохраняются.

Ниже мы остановимся только на тех показателях, которые имеют наибольшее диагностическое значение.

Железо

Железо входит в состав молекул гемоглобина, миоглобина, цитохромов и некоторых ферментов. Общее содержание в организме – 4–5 г. Основная часть, около 70 %, входит в состав гемоглобина, 20–25 % находится в запасных депо (в печени, селезенке, костном мозге) в виде ферритина и гемосидерина. Переносится в организме в составе специального транспортного белка – трансферрина. Из пищи усваивается около 10–15 % железа, поэтому суточная потребность составляет 12–15 мг.

Лабораторными анализами определяется плазменное железо, которое в основном связано с трансферрином, ферритином и внеэритроцитарным (внутрисосудистым) гемоглобином. В норме трансферрин насыщен железом примерно на 30 %. Дополнительное количество железа, которое может связаться с трансферрином, определяется как «ненасыщенная железосвязывающая способность сыворотки крови» (НЖСС). Максимальное количество железа, которое может присоединить трансферрин, обозначается как «общая железосвязывающая способность сыворотки крови» (ОЖСС).

Нормальная концентрация плазменного железа у мужчин – 12–32 мкмоль/л, ОЖСС – 54–72 мкмоль/л, НЖСС – 26,9–41,2 мкмоль/л; у женщин эти показатели на 10–15 % ниже.

Нормальное насыщение трансферрина железом: у мужчин – 25,6–48,6 %, у женщин – 25,5–47,6 %.

Железо, высвобождающееся при разрушении старых эритроцитов, не выводится из организма, а используется повторно для синтеза гемоглобина. Наибольшая потеря железа происходит при кровопотерях – физиологических (менструация) и патологических (желудочные, кишечные, легочные, маточные, геморроидальные и другие кровотечения). В связи с этим у женщин потребность в железе примерно вдвое выше, чем у мужчин. При беременности женщина теряет около 350 мг железа, которое идет на формирование депо у ребенка.

Причинами дефицита железа могут быть его недостаточность в пище (однообразное питание с низким содержанием животных белков и зелени) и нарушение всасывания при недостатке витамина С, заболеваниях желудка и кишечника (атрофические процессы, удаление части желудка, воспалительные процессы), злокачественных заболеваниях. На начальных этапах недостаток поступления или большие потери железа компенсируются его запасами из депо. Выраженная недостаточность проявляется снижением содержания гемоглобина и цветного показателя – железодефицитной анемией.

Это весьма распространенное заболевание, особенно у беременных. Определение уровня сывороточного (плазменного) железа и трансферрина позволяет проводить дифференциальную диагностику железодефицитной анемии с другими формами анемий, назначать соответствующее лечение и объективно судить об его эффективности.

Значительное увеличение сывороточного железа с высоким (до 85 %) насыщением трансферрина отмечается при различных по природе (наследственных или приобретенных) гемохроматозах – заболеваниях, характеризующихся повышенным всасыванием железа в кишечнике и отложением в органах и тканях железосодержащих пигментов.

Подавляющая часть всего железа человеческого организма находится внутри эритроцитов и входит в состав гемоглобина. Каждая его молекула содержит 4 атома двухвалентного железа, на долю которых приходится 0,334 % ее массы, что при концентрации гемоглобина в крови 140 г/л соответствует содержанию железа 500 мг/л крови. Определение содержания железа в цельной крови не имеет практического значения, так как определять гемоглобин значительно проще. Иное дело плазма крови, содержание железа в которой примерно в 300 раз ниже и составляет около 1,5 мг/л. Его большая часть находится в окисленном состоянии, т. е. трехвалентна, и связана с белком трансферрином (сидерофилином); кроме того, в плазме имеются геминовое железо, ферритин и внутрисосудистый гемоглобин. Так называемое геминовое железо входит в состав молекул, содержащих только по одной порфириновой группе. Это продукты неполного синтеза или распада гемоглобина и дыхательных ферментов, они связаны с транспортным сывороточным белком гемопексином. Ферритин – самый богатый железом сывороточный белок, в его составе находится мицелла, содержащая до 4300 атомов окисленного железа. Молекулы гемоглобина, образовавшиеся в результате внутрисосудистого гемолиза, содержат 4 порфириновых кольца, они связываются не с гемопексином, а с гаптоглобином. Разрушение эритроцитов и увеличение содержания в плазме свободного гемоглобина почти неизбежны при взятии крови. Считается, что при соблюдении всех предосторожностей (игла с широким просветом, свободное вытекание крови, центрифугирование в течение 45 мин при скорости 2500 об./мин, отсасывание сыворотки и повторное центрифугирование) удается уменьшить количество свободного гемоглобина в сыворотке лишь до уровня около 30 мг/л, что соответствует содержанию железа 100 мкг/л или примерно 1/15 всего железа сыворотки. Используемые при получении плазмы антикоагулянты сами связывают железо, поэтому рекомендуется исследовать содержание железа именно в сыворотке.

Железо поступает в организм через желудочно-кишечный тракт, а выводится почти исключительно с калом (конечно, если нет кровотечения или гематурии), поэтому содержание его в моче у здоровых людей очень мало – 0,7–5,7 нмоль/сутки (0,04–0,3 мкг), это количество не может быть уловлено обычными методами. После приема некоторых железосодержащих препаратов или комплексообразователя десферала, который способствует опустошению депо, выведение железа с мочой значительно увеличивается и может быть измерено. Состояние обмена железа лучше всего характеризует количество негеминового сывороточного железа, т. е. железа трансферрина и ферритина, так как это основной резерв, который используется организмом в случае необходимости. Общее количество трансферрина, связанного с железом и свободного, может быть определено также иммунологическими методами. Определяют количество свободного трансферрина и по его способности связывать радиоактивное железо. Для практических лабораторий, использующих обычные биохимические методы, наибольшее значение имеет определение негеминового железа сыворотки, а также ее железосвязывающей способности, т. е. того максимального количества трехвалентного железа, которое может связаться с белками сыворотки.

Прочность комплекса трансферрин – железо максимальна при рН 7,0 и зависит от природы буферного раствора. При увеличении кислотности, а также восстановлении железа комплекс распадается. Другие соединения, например гемоглобин, в этих условиях не разрушаются или разрушаются лишь незначительно, поэтому кислотноотщепляемое, или негеминовое, железо лучше других компонентов плазмы характеризует резервы железа в организме.

Существуют несколько вариантов методов определения негеминового железа. В частности, некоторые рекомендуют проводить нагревание на водяной бане для лучшего разрушения комплекса, но при этом всегда существует угроза, что разрушатся и другие железосодержащие соединения, поэтому результаты анализа будут завышенными.

Известно много цветных реактивов как на восстановленное (Fe⁺²), так и на окисленное (Fe⁺³) железо; лучшие результаты получаются с батофенантролином, который образует наиболее прочный и ярко окрашенный комплекс. Но батофенантролин не растворяется в воде, поэтому его надо предварительно обработать хлорсульфоновой кислотой либо использовать спиртовой раствор. При определении железа после минерализации с серной кислотой надо всегда иметь в виду, что почти неизбежно образующаяся в этих условиях пирофосфорная кислота, связывая железо, мешает проведению цветной реакции, поэтому ее надо разрушать, нагревая на водяной бане слегка разбавленный минерализат.

Условия взятия материала

Определение сывороточного железа обычно проводят для выявления железодефицитного состояния, поэтому, как правило, информативно уменьшение его содержания. Обследуемые по крайней мере в течение 2 недель перед взятием крови не должны получать железосодержащих препаратов. Кровь надо брать широкими иглами. Сыворотка должна быть свободна от видимых следов гемолиза.

Определение железа по цветной реакции с сульфонированным батофенантролином

Принцип метода

Белки осаждают трихлоруксусной кислотой, которая при прогревании разрушает также комплекс железа с трансферрином. Для установления оптимальной величины рН 4,8–5,0 добавляют аммония ацетат, а для восстановления всего железа – гидразин. Двухвалентное железо образует окрашенный комплекс с батофенантролином, который переведен в сульфатированную форму добавлением хлорсульфоновой кислоты.

Необходимые реактивы

1. Трихлоруксусная кислота, 20 %-ная.

2. Аммония ацетат: 70 г ацетата аммония (CH₃COONH₄) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл, препарат гигроскопичен.

3. Гидразина сульфат, насыщенный раствор, готовят, заливая 2,5 г препарата 100 мл воды.

4. Раствор сульфонированного батофенантролина: в пробирке к 100 мг батофенантролина (4,7-дифенил-1,10-фенантролина) приливают 0,5 мл хлорсульфоновой кислоты, нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 с, охлаждают и медленно приливают 10 мл воды, после чего снова нагревают на водяной бане в течение 5 мин и разбавляют 100 мл воды, добавляя 5 н NaOH, устанавливают рН 4,0 и доводят объем водой до 200 мл.

5. Калибровочный раствор железа, содержащий 30 мкмоль/л. Сначала готовят раствор соли Мора (железо-аммиачные квасцы, аммоний-железо II сернокислое), FeSO₄ × (NH₄)SO₄ × 6H₂O, содержащий 3 ммоль/л, растворяя 1,178 г в 5 мл 0,3 н НСl и доводя объем до 1 л водой, содержащей в 1 л 1 мл концентрированной серной кислоты. Этот раствор разводят подкисленной водой в 100 раз; получается раствор, содержащий 30 мкмоль/л, или 1,67 мкг/мл.

Ход исследования

К 2 мл исследуемой сыворотки прибавляют 2,5 мл воды и 1,5 мл 20 %-ного раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и ставят на 15 мин на водяную баню температурой 90–95 °C. Затем центрифугируют в течение 20 мин при скорости 2000 об./мин и отбирают 4 мл прозрачного слоя, к которым приливают 0,35 мл 70 %-ного раствора аммония ацетата и 0,3 мл раствора сульфата гидразина. Смесь фотометрируют при длине волны 535 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см, затем прибавляют 0,4 мл раствора сульфонированного батофенантролина, оставляют на 1 ч и снова фотометрируют при той же длине волны. Обе фотометрии выполняют против холостого опыта, в котором берут вместо исследуемой сыворотки 2 мл воды.

Калибровку проводят так же, как и основной опыт, но вместо сыворотки берут 2 мл калибровочного раствора.

Расчет сывороточного железа (мкмоль/л) выполняют по формуле:

Е_оп1 – Е_оп2 / Е_к1 – Е_к2 × 30,

где Е_оп1 и Е_оп2 – отсчеты опытной пробы до и после прибавления раствора сульфонированного батофенантролина;

Е_к1 и Е_к2 – соответственно результаты фотометрии калибровочной пробы;

30 – содержание железа в калибровочном растворе, мкмоль/л.

Надо тщательно следить за содержанием железа в дистиллированной воде и реактивах, используя в случае необходимости бидистиллированную воду, приготовленную в стеклянном перегонном аппарате. Если после удаления белков не удается набрать точно 4 мл надосадочной жидкости, можно взять меньшее ее количество и сделать поправку при Расчете или же взять точно такое же количество калибровочного раствора.

Определение железа по цветной реакции со спиртовым раствором батофенантролина

Принцип метода

Сывороточное железо восстанавливают тиогликолевой кислотой, белки осаждают трихлоруксусной кислотой, в фильтрате устанавливают нужную величину рН, добавляя ацетат натрия, и проводят цветную реакцию с батофенантролином. В связи с тем что он в воде не растворяется, используют спиртовой раствор.

Необходимые реактивы

1. Кислота тиогликолевая, кислота трихлоруксусная, раствор 400 г/л.

2. Натрия ацетат, насыщенный раствор (в случае необходимости его очищают от следов железа, растворяя 500 г в 1 л воды при 37 °C). К прозрачной надосадочной жидкости добавляют раствор батофенантролина из Расчета 10 мл на 1 л и этиловый спирт в количестве, равном количеству надосадочной жидкости; на холоде выпадают кристаллы СН₃СООNа × 3Н₂О.

3. Батофенантролин, 40 мг в 100 мл этанола.

4. НСl 1 н раствор.

5. Калибровочный раствор железа: 100 мг мягкой железной проволоки растворяют в 4 мл концентрированной НСl и разводят до 1 л водой, получается раствор, содержащий 100 мкг/мл. Из него разведением в 60 раз получают раствор, содержащий 30 мкмоль/л (1,67 мкг/л).

Учитывая, что метод определения очень чувствительный, необходимо принять все меры, чтобы реактивы и посуда не содержали железа, присутствие которого выявляется при постановке холостых проб. Посуду, в том числе пробирки для взятия крови, необходимо обрабатывать разбавленной НСl; должна использоваться только деионизированная или перегнанная в стеклянной посуде вода; реактивы очищаются перекристаллизацией.

Ход исследования

К 0,7 мл сыворотки прибавляют 2 капли тиогликолевой кислоты, взбалтывают, а затем еще 0,35 мл 1 н НСl, опять перемешивают и прибавляют 0,2 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Энергично размешивают стеклянной палочкой в течение 45 с, а затем центрифугируют при скорости 2500 об./мин. В пробирку с притертой пробкой отбирают из надосадочной жидкости 0,7 мл, к которым прибавляют 0,6 мл насыщенного раствора аммония ацетата и 0,7 мл раствора батофенантролина. Окраска развивается за 20–30 с. Фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 536 нм против холостой пробы, в которой вместо сыворотки берут 0,7 мл воды. Одновременно обрабатывают и калибровочную пробу, в которой вместо сыворотки используют 0,7 мл калибровочного раствора, содержащего 30 мкмоль железа в 1 л.

Расчет проводят по правилу пропорций.

Определение железосвязывающей способности сыворотки крови

Принцип метода

Исследуемую сыворотку выдерживают с раствором трехвалентного железа, при этом весь трансферрин насыщается. Избыток солей железа удаляют адсорбцией на карбонате магния и определяют содержание железа в надосадочной жидкости одним из приведенных выше методов.

Необходимые реактивы

1. Железо хлорное, 5 мг/мл: 2,42 г FeCl₃ × 6H₂O растворяют в 100 мл 0,005 н HCl.

2. Магния карбонат в порошке.

3. Все реактивы, необходимые для определения сывороточного железа одним из описанных выше методов.

Ход исследования

К 2 мл исследуемой сыворотки добавляют 4 мл раствора хлорного железа и тщательно перемешивают. Через 5 мин прибавляют порошок магния карбоната в объеме примерно 0,5 мл, встряхивают в течение 10–15 с и центрифугируют. В надосадочной жидкости определяют железо одним из описанных выше методов. Полученный результат умножают на 3 (разведение сыворотки).