Текст книги "Анализы. Актуальные сведения по лабораторным исследованиям под рукой"

Анализаторы свертывания крови

В лабораторной практике широко применяются коагулологические анализаторы, действующие в автоматическом и полуавтоматическом режиме.

Коагулометры лабораторные, автоматические и полуавтоматические. Применяются для качественного и количественного определения одного или нескольких факторов коагуляции, задействованных в гемостазе. В частности, может быть определено тромбиновое, частичное тромбопластиновое время. Принцип работы может быть основан на нескольких методах: спектрофотометрии, турбидиметрии, нефелометрии, электрометрии, механическом средстве контроля образования сгустка.

Приборы данного типа отличаются высокой производительностью и точностью полученных результатов. Для их работы требуется минимальное количество биологического материала. При работе с полуавтоматическими и автоматическими приборами исключается человеческий фактор (вероятность ошибки).

Иммунологические реакции

Иммунологические реакции используются для выявления специфических антител, идентификации возбудителей и других антигенов, определения групп крови и подбора адекватного донора при пересадках органов и тканей. Серологические реакции – реакции между антигенами и антителами in vitro – применяют для выявления неизвестного антигена или антитела с помощью известного антитела или антигена соответственно. Корпускулярные антигены дают феномен агглютинации, растворимые – преципитации. В лабораторной практике используют реакции агглютинации, преципитации, связывания комплемента и др.

Антигены, по которым отдельные индивидуумы или группы особей одного вида различаются между собой, являются изоантигенами. Изоантигены, генетически связанные, объединены в группы, получившие следующие названия: система АВО, резус и др. В плазме человека всегда содержатся естественные, полные, холодовые изоантитела к агглютиногенам А и В. Агглютинин анти-А – α-агглютинин, а агглютинин анти-В – β– агглютинин (табл. 6).

Таблица 6

Групповая принадлежность людей по системе АВО

Определение группы крови (определение агглютиногенов). Реакцией агглютинации с помощью стандартных сывороток определяют групповые агглютиногены в эритроцитах. Ампулы или флаконы со стандартными сыворотками двух различных серий каждой группы ставят в 2 штатива, имеющих по 3 гнезда, или в 1 штатив с двумя рядами гнезд. Слева направо ставят сыворотки групп 0 α-β (I), А β(II), В α(III). Отдельно ставят сыворотку АВ0(IV). Определение производят на белых пластинах или тарелках. На левой стороне делают надписи 0 α-β, в середине – А β, справа – В α. Под соответствующей надписью наносят по 0,1 мл каждой стандартной сыворотки отдельной для каждой сыворотки пипеткой. Кровь для исследования берут из пальца, 0,01 мл крови сухой стеклянной палочкой наносят рядом с каждой каплей стандартной сыворотки. Перемешивают капли стандартной сыворотки с исследуемой кровью. После этого пластину покачивают, затем на 1–2 мин оставляют в покое и снова периодически покачивают. Наблюдение за ходом реакции проводят не менее 5 мин, несмотря на то что агглютинация начинается в течение первых 10–30 с, так как возможна поздняя агглютинация, например эритроцитами группы А2 (II). По мере наступления агглютинации, но не ранее чем через 3 мин, в те капли, в которых наступила агглютинация, добавляют изотонический раствор хлорида натрия и продолжают наблюдение при покачивании пластинки в течение 5 мин, после чего оценивают результат. При положительной реакции в смеси появляются видимые невооруженным глазом мелкие красные зернышки (агглютинанты), состоящие из склеенных эритроцитов. При этом сыворотка полностью или частично обесцвечивается. В случае отрицательной реакции на протяжении всего времени наблюдения (5 мин) жидкость остается равномерно окрашенной в красный цвет и в ней не обнаруживаются агглютинанты. Результаты реакции в каплях с сыворотками одной группы обеих серий должны быть одинаковыми. Возможны различные комбинации реакций:

1) сыворотки всех трех групп дали отрицательную реакцию – испытуемая кровь принадлежит к группе 0(I);

2) сыворотки групп 0 α-β(I) и В α(III) дали положительную реакцию, а сыворотка группы А β(II) – отрицательную: испытуемая кровь принадлежит к группе А(II);

3) сыворотки группы 0 α-β(I) и А β(II) дали положительную реакцию, а сыворотка группы В α(III) – отрицательную: испытуемая кровь принадлежит к группе В(III);

4) сыворотки всех групп дали положительную реакцию. В этом случае для исключения неспецифической агглютинации проводят дополнительное контрольное исследование со стандартной сывороткой АВ0(IV).

Отсутствие агглютинации в капле этой сыворотки при наличии ее во всех остальных позволяет отнести кровь к группе АВ0(IV). Наличие агглютинации с сывороткой группы АВ0(IV) говорит о неспецифической агглютинации. В этих случаях нужно исследование повторить с отмытыми эритроцитами.

Определение полной групповой формулы крови (агглютиногенов и агглютининов). Одновременное определение групповых антигенов эритроцитов и агглютиногенов сыворотки позволяет установить полную групповую формулу исследуемой крови. Для этого берут 2 различные серии стандартных сывороток групп крови 0 α-β(I), А β(II), В α(III), АВ0(IV); 0,85 %– ный раствор хлорида натрия; стандартные эритроциты групп 0(I), А(II), В(III). В центрифужную пробирку, содержащую 0,25–0,5 мл 3,8 %-ного раствора цитрата натрия, добавляют 2–4 мл крови специально отобранных доноров, затем пробирку на 3/4 заполняют изотоническим раствором хлорида натрия. Перемешивают, центрифугируют и оставляют стоять до оседания эритроцитов. Отмытые стандартные эритроциты хранят в холодильнике. Срок годности – 2–3 дня. Ампулы со стандартными сыворотками двух различных серий каждой группы ставят в 2 штатива. Отдельно ставят сыворотку группы АВ0(IV). Пробирки со стандартными эритроцитами устанавливают в отдельный штатив с тремя гнездами в следующем порядке: группа 0(I), А(II) и В(III). На пластинке делают надписи слева направо: 0 α-β, А β и В α для стандартных сывороток и 0, А и В – для стандартных эритроцитов. Под соответствующими обозначениями наносят по 1 большой капле всех стандартных сывороток и по 1 маленькой капле стандартных эритроцитов. Исследуемую кровь для отделения сыворотки центрифугируют или оставляют стоять 20–30 мин. Исследуемую сыворотку по одной большой капле капают на подготовленные стандартные эритроциты. После этого той же пипеткой набирают со дна эритроциты исследуемой крови и наносят их по 1 маленькой капле рядом с каждой каплей стандартной сыворотки. Сыворотку тщательно перемешивают с эритроцитами сухими стеклянными палочками. Через 1 мин в те капли, в которых наступила агглютинация, добавляют изотонический раствор хлорида натрия и продолжают наблюдение при покачивании пластинки до истечения 5 мин.

Возможные варианты реакций:

1) реакция со стандартными сыворотками указывает на отсутствие агглютиногенов, т. е. на принадлежность исследуемой крови к группе 0(I). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами группы 0(I) и положительную – с эритроцитами групп А(II) и В(III);

2) реакция со стандартными сыворотками указывает на наличие в исследуемой крови агглютиногена А. При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами групп 0(I) и А(II), но положительную – с эритроцитами группы В(III);

3) реакция со стандартными сыворотками указывает на наличие в исследуемой крови агглютиногена В. При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами групп 0(I) и В(III), но положительную – с эритроцитами группы А(II);

4) реакция со стандартными сыворотками указывает на наличие в исследуемой крови агглютиногенов А и В. При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами всех трех групп, т. е. не содержит агглютининов.

Определение резус-фактора методом конглютинации с применением желатина. Исследуемые эритроциты инкубируют со стандартной сывороткой-антирезус, содержащей неполные антитела-резус, в коллоидной среде – растворе желатина. Если исследуемые эритроциты резус-положительны, происходит их склеивание – конглютинация, которая обнаруживается после добавления в инкубационную смесь изотонического раствора хлорида натрия. Резус-отрицательные эритроциты не склеиваются.

Для реакции используют стандартные сыворотки-антирезус с неполными антителами двух различных серий (группа стандартной сыворотки должна быть совместима с группой исследуемой крови), 10 %-ный раствор желатина в ампулах заводского изготовления, 0,85 %-ный раствор хлорида натрия, 3,8 %-ный раствор цитрата натрия, стандартные эритроциты для контроля.

В одну пробирку вносят 0,05 мл исследуемых эритроцитов. В другую пробирку помещают 0,05 мл стандартных резус-положительных эритроцитов группы 0(I) или группы, одноименной с исследуемой кровью. В третью пробирку – по 0,05 мл стандартных резус-отрицательных эритроцитов той же группы, что и исследуемая кровь. Затем во все пробирки добавляют по 0,1 мл 10 %-ного раствора желатина, предварительно подогретого до 48 °C. Слегка встряхивают для перемешивания. После этого в первую пробирку вводят 0,1 мл сыворотки-антирезус одной серии, во вторую – по 0,1 мл сыворотки-антирезус второй серии. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и все пробирки помещают в водяную баню при 48 °C на 5 мин или термостат при той же температуре на 30 мин. После прогревания приливают по 8–10 мл подогретого изотонического раствора хлорида натрия, содержимое пробирок перемешивают и затем просматривают на свет невооруженным глазом или через лупу.

Когда кровь резус-положительна, в пробирке наблюдаются легко различимые красные зерна или хлопья, состоящие из склеенных эритроцитов, на прозрачном, почти обесцвеченном фоне. Если эритроциты резус-отрицательны, в пробирке видна равномерно окрашенная в розовый цвет, слегка опалесцирующая жидкость.

Результаты следует считать истинными при совпадении их в обеих сериях стандартной сыворотки-антирезус. В контрольных образцах стандартные резус-положительные эритроциты одноименной группы или группы 0(I) с сывороткой-антирезус должны дать положительный результат, а стандартные резус-отрицательные эритроциты одноименной группы – отрицательный. Кроме того, отрицательный результат должен быть также во всех пробирках третьего ряда, т. е. без сыворотки-антирезус.

Определение неполных антител. Как к изоантителам, так и к аутоантителам могут относиться тепловые антитела (оптимум действия при 37 °C), главным образом класса IgG. Они называются неполными, унивалентными и, покрывая поверхность эритроцитов, не вызывают их агглютинации в солевом растворе, однако могут склеивать эритроциты в среде с высокой концентрацией белка (альбумина или сыворотки). Тепловые антитела класса IgG редко обладают способностью фиксировать комплемент, вызывая лизис эритроцитов, т. е. выступать в качестве гемолизинов. Обычно эритроциты, покрытые антителами IgG, секвестрируются селезенкой, где они теряют часть оболочки, что приводит к фрагментации и сфероцитозу, или агглютинируют (в среде с высокой концентрацией белка) и захватываются макрофагами. Фиксированные на эритроцитах неполные антитела выявляются прямой пробой Кумбса (антиглобулиновой пробой).

Суть метода состоит в агглютинации эритроцитов, покрытых антителами класса IgG, антисывороткой кролика против γ-глобулина человека. Непрямая проба Кумбса определяет неполные антитела, содержащиеся в сыворотке крови и могущие быть как аутоантителами, так и изоантителами. В этой пробе эритроциты донора инкубируют с исследуемой сывороткой крови, затем отмывают и соединяют с антиглобулиновой сывороткой, т. е. проводят пробу Кумбса, с помощью которой устанавливают, имеются ли на поверхности донорских эритроцитов неполные антитела. При положительном варианте происходит агглютинация эритроцитов.

Определение ристомицин-агрегации (агглютинации) в богатой тромбоцитами исследуемой плазме отражает взаимодействие фактора Виллебранда (ФВ) с собственными тромбоцитами пациента. При исследовании in vitro ристомицин способствует связыванию ФВ с тромбоцитарным рецептором ГП1 в. Процесс агрегации, индуцируемый добавлением к богатой тромбоцитами исследуемой плазме стандартного количества ристомицина, регистрируется фотометрически по падению ее оптической плотности. Измерения проводятся в агрегометре или на модифицированном фотоэлектроколориметре, снабженном перемешивающим и записывающим устройствами. Ристомицин-агрегация тромбоцитов может снижаться как при качественных, так и при количественных дефектах ФВ.

Определение активности фактора Виллебранда (ристомицин-кофакторной активности – РКА) исследуемой плазмы основано на его способности вызывать в присутствии ристомицина агглютинацию нормальных донорских тромбоцитов. В классическом методе, предложенном H. I. Weiss, предлагается использование суспензии свежеприготовленных отмытых донорских тромбоцитов для измерений, проводимых в агрегометре. При этом взвесь отмытых и ресуспендированных донорских тромбоцитов должна иметь концентрацию около 250 × 10⁹/л. В кювету агрегометра добавляют взвесь доведенной исследуемой бедной тромбоцитами плазмы и стандартизованное количество ристомицина. Последующий агрегационный процесс регистрируется в течение нескольких минут с помощью записи увеличения трансмиссии. Угол наклона полученной кривой пропорционален РКА исследуемого образца плазмы. РКА исследуемой плазмы определяется в процентах по калибровочной кривой зависимости максимального изменения трансмиссии за минуту от уровня РКА. Для ее построения используется серия разведений стандартной коммерческой или пулированной плазмы, в которых РКА соответствует 100, 50, 25 %-ному уровню.

В модификациях данного метода предусмотрено использование не свежих, а фиксированных формалином донорских тромбоцитов. Такая обработка тромбоцитов способствует длительному хранению их без потери рецепторов к ФВ. Для этого из донорской крови, взятой на ЭДТА-формалиновом растворе (соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) в соотношении 9: 1, готовится бедная тромбоцитарная плазма. Полученный после ее удаления тромбоцитарный осадок дважды отмывается ЭДТА-буферным раствором и разводится в буфере до концентрации тромбоцитов 200–250 × 10⁹/л. Полученный тромбоцитарный реагент может храниться.

В настоящее время коммерчески доступны тест-наборы, основанные на регистрации агглютинации лиофилизированных фиксированных тромбоцитов как методами агрегатометрии, так и слайд-тестами. Определение РКА в слайд-тестах требует меньших затрат времени и характеризуется более высокой точностью.

Иммуногематологические анализаторы

В настоящее время широко применяются автоматические и полуавтоматические иммуногематологические анализаторы, благодаря чему определение группы крови становится менее трудозатратным и более точным процессом.

Анализаторы групп крови/скрининг антител, автоматические и полуавтоматические. Применяются при предварительном определении группы крови накануне переливания, идентификации эритроцитарных антител, эритроцитарного фенотипирования донорских образцов для определения совместимости (перед переливанием, трансплантацией). В спектр анализов могут входить определение группы крови по системе AB0, резус-фактора и пр. Возможно задействование серологических методов с применением микропланшетов, кассет, технологий колоночной агглютинации.

Анализаторы иммуногематологические, автоматические и полуавтоматические. Применяются для определения группы крови, скрининга и идентификации антител, фенотипирования эритроцитов, прямых антиглобулиновых анализов, перекрестной совместимости клинических образцов. Работа основана на одном или нескольких иммунологических методах, в том числе на микропланшетной агглютинации, агглютинации в колонках, нефелометрии, ферментативной, фотометрической, радиометрической системе детектирования. В состав анализатора могут входить обработка проб, программы для обработки данных.

Глава 2
Биохимические методы исследования в клинической лабораторной диагностике

Техническое оснащение биохимических методов исследования в клинико-диагностических лабораториях

В настоящее время компьютеризация и автоматизация изменили характер работы клинико-диагностических лабораторий лечебно-профилактических учреждений.

Выполнение практически всех биохимических и других видов лабораторных исследований становится возможным на автоанализаторах. Подключение их к компьютерам значительно облегчает формирование серии исследований для одного пациента, хранение в памяти результатов, подготовку ответа клиницисту и др.

Арсенал современных анализаторов и технических средств для проведения биохимических исследований разнообразен: стекло и посуда, вакуумные системы забора крови – Вакуэт, разнообразные дозирующие устройства, обычные и программируемые фотометры, высокопроизводительные биохимические анализаторы.

Появление новых методов анализа, новых совершенных технологий (одной из основных развивающихся технологий сегодня в клинической биохимии становится «сухая химия») способствует ежегодному обновлению на рынке лабораторного оборудования, постоянному изменению условий работы на нем известных фирм, появлению новых компаний, слиянию их между собой, быстрому решению сложных научно-технических проблем, не имеющих равных себе по сложности в других областях приборостроения.

Автоматизация выполнения лабораторных исследований изменила выпуск наборов реагентов для клинической лабораторной диагностики. В России начат серийный выпуск наборов реагентов. Все выпускаемые в настоящее время наборы реагентов, стандартные, контрольные, калибровочные образцы стандартизированы и зарегистрированы в Минздраве РФ.

Данные наборы перед регистрацией проходят серьезные испытания в ведущих лабораториях и медицинских центрах страны. Такая стандартизация позволяет получать в разных лабораториях сопоставимые результаты исследований.

Наборы контролируются системой Государственного контроля качества, в случаях несоответствия которой они могут быть сняты с производства. Лаборатории при наличии дефектов в работе наборов могут предъявлять рекламации фирме-изготовителю и требовать замены их на качественную продукцию.

Характеристика абсорбциометрических приборов

В клинико-диагностических лабораториях при исследовании показателей обмена используются фотометрические приборы.

Приборы проводят фотометрическое детектирование результатов: энергия светового потока измеряется с помощью фотодетектора, преобразующего световую энергию в электрический сигнал.

Фотометрические методы анализа делятся на следующие:

1) абсорбционный (поглощение раствором световой энергии);

2) нефелометрический (рассеяние световой энергии дисперсной средой);

3) флуориметрический (излучение раствором световой энергии, вызванной световой энергией возбуждения);

4) рефлектометрия (измерение интенсивности энергии, отраженной от твердофазной среды);

5) турбидиметрический (сочетание поглощения и рассеяния световой энергии дисперсной средой);

6) хемилюминесцентный (излучение раствором световой энергии в результате химической реакции).

В настоящее время в практических лабораториях можно встретить самые различные по конструкции и характеристикам колориметры, фотометры и спектрофотометры.

Их различия связаны с формой выдачи информации (единицы светопропускания, оптической плотности, концентрации или другие значения, по которым проведена калибровка прибора); со способом построения и хранения калибровочных значений (автоматическое, ручное, длительное или краткосрочное); со способом подачи в прибор исследуемого раствора (проточная кювета, коммутированная кювета, кювета специальной конструкции и др.); с конструкцией оптической системы (одноканальные или многоканальные); с видом источника излучения световой энергии (разнообразные лампы накаливания с телом накала из вольфрама, импульсные, газоразрядные лампы, светодиоды, лазеры).

Каждый из используемых в лабораториях фотометров имеет следующие характеристики:

1) спектральный диапазон – длины волн, в которых работает прибор. В большинстве случаев фотометры работают в спектральном диапазоне 340–700 нм;

2) динамический диапазон измерения. Обычно диапазону оптических плотностей от 0 до 2 соответствует диапазон по светопропусканию от 100 до 1 %;

3) максимальный и минимальный объем фотометрируемого раствора. Эти объемы определяются объемами измерительных кювет, при этом минимальный допустимый объем раствора – объем, при котором возможно получение гарантированных результатов измерений. На современных фотометрах можно работать в диапазоне 10–500 мкл;

4) метрологические характеристики фотометрических приборов;

5) градуировка прибора – процесс построения калибровочной кривой, по которому в дальнейшем проводится градуировка прибора. Приборы высокого класса имеют энергонезависимое запоминающее устройство, позволяющее сохранять градуировочные характеристики в течение длительного времени;

6) способы отображения и регистрации информации. В приборах используются стрелочные, цифровые и алфавитно-цифровые индикаторы, принтеры самых разных конструкций.

В клинико-диагностических лабораториях в настоящее время используются самые разные виды фотометров. Это обычные фотометры типа КФК-2, КФК-3, ФЭК, программируемые фотометры типа МИНИЛАБ 501 (программируемый фотометр для биохимических исследований по конечной точке в моно– и бихроматическом режиме). В памяти фотометра хранится до 50 программ, он имеет встроенный термостат, объем кюветы 1 мл; МИНИЛАБ 502 – кинетический программируемый фотометр для исследования активности ферментов и определения концентрации метаболитов кинетическими методами с встроенным термостатом.

Все более широкое распространение получают биохимические анализаторы типа Стат Факс 1904. Анализатор предназначен для выполнения биохимических исследований кинетическим методом и по конечной точке. Производительность: кинетическим методом – до 40 исследований в час, по конечной точке – до 200 исследований в час.