Текст книги "Анализы. Актуальные сведения по лабораторным исследованиям под рукой"

Методы исследования мочевины сыворотки крови

Из всего разнообразия методов исследования мочевины в качестве унифицированных в лабораториях утверждены следующие:

1) экспресс-метод определения содержания мочевины с использованием реактивной бумаги «Уратест»;

2) диацетилмонооксимный метод, который может быть применен при работе как с отечественными реактивами, так и с наборами реактивов фирмы «Лахема»;

3) ферментативный метод с применением кристаллического препарата уреазы.

Диацетилмонооксимный метод определения мочевины

Принцип метода

Мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа красный комплекс.

Необходимые реактивы

1. Трихлоруксусная кислота, 100 г/л.

2. Диацетилмонооксим, 25 г/л водный раствор. Реактив стабилен.

3. Тиосемикарбазид, 2,5 г/л водный раствор. Для приготовления реактива можно пользоваться также тиосемикарбазида гидрохлоридом; последний применяется в виде 3,2 г/л водного раствора.

Оба реактива стабильны при хранении в темной посуде при комнатной температуре.

4. Серная кислота концентрированная.

5. Ортофосфорная кислота 85 %-ная.

6. Хлорное железо. Основной раствор хлорного железа: 5 г хлорного железа доводят до 100 мл водой и подкисляют добавлением 1 мл концентрированной серной кислоты. Из основного раствора готовят рабочий раствор хлорного железа: 1 мл основного раствора хлорного железа доводят до 100 мл водой, затем добавляют 8 мл концентрированной серной кислоты и 1 мл 85 %-ной ортофосфорной кислоты. Хранят в темной посуде. Годен в течение 2 недель.

7. Бензойная кислота, 2 г/л. 0,2 г кристаллической бензойной кислоты растворяют в 100 мл воды при интенсивном перемешивании на водяной бане.

8. Мочевина для приготовления калибровочного раствора. Готовят 7 ммоль/л раствор мочевины: 42 мг мочевины растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл. В качестве растворителя можно использовать 2 г/л раствор бензойной кислоты. Калибровочный раствор, приготовленный на растворе бензойной кислоты, стабильнее, чем водный; 1 мл калибровочного раствора содержит 0,007 ммоль мочевины.

9. Цветной реактив: к 30 мл рабочего раствора хлорного железа добавляют 20 мл воды, 1 мл 25 г/л раствора диацетилмонооксима и 0,25 мл 2,5 г/л раствора тиосемикарбазида. Цветной реактив готовят каждый раз перед употреблением.

Ход определения мочевины в сыворотке крови

Опытная проба: в центрифужную пробирку наливают 0,8 мл воды, 0,2 мл сыворотки и 1 мл 100 г/л раствора трихлоруксусной кислоты, смешивают. Через 15–20 мин центрифугируют. В чистую пробирку вносят 0,5 мл надосадочной жидкости и 5 мл цветного реактива. Пробирку выдерживают на кипящей водяной бане в течение 20 мин, затем охлаждают в течение 2–3 мин под проточной водой. Измерение проводят на фотометре при длине волны 530–560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы в кювете с толщиной слоя в 1 см. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо надосадочной жидкости берут 0,5 мл воды.

Расчет проводят по формуле путем сравнения с калибровочной пробой. Калибровочную пробу ставят аналогично опытной, но вместо сыворотки берут 0,2 мл калибровочного раствора.

Концентрация мочевины, ммоль/л:

Е_оп / Е_к × С_к,

где Е_оп – экстинкция опытной пробы;

Е_к – экстинкция калибровочной пробы;

С_к – концентрация мочевины в калибровочном растворе, 7 ммоль/л.

Определение мочевины в моче проводят аналогично определению мочевины в сыворотке крови, но вместо сыворотки берут 0,2 мл разведенной мочи. Параллельно обрабатывают калибровочную пробу, как описано для определения мочевины в сыворотке крови.

Расчет мочевины на суточное количество мочи производят по следующей формуле:

М_сут = С_к × Е_оп × а × К / Е_к × б,

где М_сут – количество мочевины в суточной моче, ммоль;

Е_оп – экстинкция опытной пробы;

Е_к – экстинкция калибровочной пробы;

С_к – содержание мочевины в калибровочном растворе, ммоль;

а – суточное количество мочи, мл;

б – количество мочи, взятое на анализ, мл;

К – коэффициент разведения мочи.

Примечания

1. Измерение проводят не позже чем через 15 мин после охлаждения проб ввиду неустойчивости окраски.

2. Из-за неустойчивости окрашенного комплекса мочевины с диацетилмонооксимом и зависимости окраски от условий нагревания калибровочную пробу определяют параллельно каждой серии опыта.

3. При содержании мочевины в сыворотке крови выше 17 ммоль/л сыворотку разводят изотоническим раствором хлорида натрия, а результаты умножают на коэффициент разведения.

4. Для пересчета на азот мочевины результаты следует разделить на 2,14.

Ферментативный (уреазный) метод определения мочевины

Принцип метода

Мочевина под действием уреазы разлагается на углекислый газ и аммиак, который в щелочной среде с гипохлоритом натрия и фенолом образует индофенол синего цвета (метод Бертло). Светопоглощение образовавшегося продукта пропорционально содержанию мочевины в образце.

Необходимые реактивы

1. Уреаза. Для определения пригодна уреаза с активностью > 5 МЕ/мг.

2. Этилендиамин-N, N, N’, N’-тетрауксусной кислоты динатриевая соль (трилон Б).

3. ЭДТА-буфер, 0,0269 моль/л, рН 6,5: 0,50 г трилона Б растворяют в 30–40 мл воды, доводят рН до 6,5 1 моль/л раствором едкого натра и доливают водой в мерной колбе до 50 мл.

4. Основной раствор уреазы в буфере, 10 МЕ/мл: 20 мг уреазы (активность 5 МЕ/мг) растворяют в 10 мл буфера. Навеску уреазы берут в зависимости от активности фермента. Раствор стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике.

5. Рабочий раствор уреазы. Перед началом определения берут необходимое количество основного раствора уреазы и разводят бидистиллированной водой в отношении 1: 4.

6. Фенол.

7. Натрия нитропруссид 2-водный.

8. Цветной реактив: фенол – 0,11 моль/л, нитропруссид натрия – 0,18 моль/л: 0,0263 г нитропруссида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 500 мл, приливают примерно 300 мл воды, растворяют при перемешивании. Затем добавляют 5,18 г фенола и доливают водой до метки. Реактив стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла.

9. Натр едкий, 1 моль/л; 0,26 моль/л.

10. Гипохлорит натрия. Приготовление основного раствора гипохлорита: 100 г хлорной извести размешивают в течение 15 мин с 170 мл воды, после чего прибавляют при непрерывном помешивании раствор, состоящий из 170 мл воды и 70 г карбоната натрия. Масса сначала густеет, затем разжижается. Оставляют стоять до следующего дня. Надосадочную жидкость (гипохлорит натрия) сливают и фильтруют через промытый водой фильтр. Хранят в холодильнике в посуде из темного стекла. Определение активности хлора: 1 мл основного раствора гипохлорита натрия смешивают с 100 мл воды. К 50 мл этого раствора добавляют 5 мл свежеприготовленного 50 г/л раствора йодида калия и 10 мл 6 моль/л раствора НСl. Титруют 0,1 н раствором тиосульфата натрия (готовят из фиксанала). Как только раствор приобретает слабо-желтую окраску, добавляют 10 капель 1 %-ного раствора крахмала и титруют до обесцвечивания. Концентрацию гипохлорита натрия рассчитывают по хлору:

К = а × 0,709,

где К – концентрация активного хлора, г/100 мл гипохлорита натрия;

а – количество тиосульфата, пошедшего на титрование, мл;

0,709 – коэффициент пересчета 1 мл тиосульфата натрия в концентрацию хлора, г/100 мл.

11. Рабочий раствор гипохлорита натрия. После установления концентрации активного хлора основной раствор гипохлорита натрия разводят водой так, чтобы концентрация хлора составляла 0,78 г/л. Раствор гипохлорита с содержанием хлора 0,78 г/л смешивают с равным объемом 0,26 моль/ л раствором едкого натра (100 мл + 100 мл). Активность хлора проверяют не реже одного раза в 2 недели. Рабочий раствор содержит 0,011 моль/л гипохлорита и 0,13 моль/л едкого натра. Раствор хранят в холодильнике в посуде из темного стекла.

12. Мочевина.

13. Бензойная кислота, 2 г/л (кислоту растворяют при нагревании).

14. Калибровочный раствор мочевины, 0,5 ммоль/л: 15 мг мочевины растворяют в мерной колбе вместимостью 500 мл в 2 г/л растворе бензойной кислоты. Раствор стабилен при хранении в холодильнике.

15. Натрия хлорид, 0,154 моль/л.

Специальное оборудование

1. Спектрофотометр или колориметр с кюветой для микроизмерений.

2. Полуавтоматические микропипетки.

Ход определения

Перед определением сыворотку разводят 0,154 моль/л раствором хлорида натрия в отношении 1: 9.

Опытная проба: 100 мкл рабочего раствора уреазы вносят в пробирку, добавляют 20 мкл разведенной сыворотки. Закрывают пробкой, перемешивают и инкубируют в течение 15 мин при температуре 37 °C. После инкубации добавляют 300 мкл цветного реактива и 300 мкл рабочего раствора гипохлорита натрия. Перемешивают и инкубируют в течение 20–30 мин при температуре 37 °C. Измеряют экстинкцию в кювете с толщиной слоя в 1 см при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов.

Холостую пробу обрабатывают так же, как опытную, но вместо сыворотки берут 0,154 моль/л раствор NaCl.

Калибровочную пробу обрабатывают так же, как опытную, но вместо сыворотки берут калибровочный раствор мочевины. Измеряют при тех же условиях против холостой пробы.

Расчет количества мочевины в ммоль/л ведут по формуле:

Е_оп / Е_к × 0,5 × 10,

где Е_оп – экстинкция опытной пробы;

Е_к – экстинкция калибровочной пробы;

0,5 – концентрация мочевины в калибровочном растворе, ммоль/л;

10 – коэффициент разведения.

Линейная зависимость между оптической плотностью и концентрацией мочевины сохраняется до 33 ммоль/л.

Примечание

Объемы сыворотки и реактивов можно пропорционально увеличивать.

Содержание мочевины сыворотки крови – 2,5–8,3 ммоль/ л; мочевина суточной мочи – 333–583 ммоль/л.

Верхняя граница содержания мочевины в сыворотке крови зависит от приема белков с пищей. При приеме белков свыше 2,5 г/кг живой массы в сутки верхняя граница референтных величин содержания мочевины в сыворотке может быть повышена даже до 10 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение

При трактовке результатов анализа следует исходить из того, что диета с низким содержанием белка может уменьшить концентрацию мочевины, а избыточное питание азотистыми продуктами повышает уровень мочевины. Диета, бедная ионами хлора, также нередко приводит к повышению концентрации мочевины. Поэтому в большинстве случаев повышение концентрации мочевины до 12 ммоль/л считается физиологически допустимым. Однако существует мнение, что всякое повышение мочевины в крови выше 10 ммоль/л нужно рассматривать выходящим за пределы нормы, так как едва ли какой-либо пищевой режим способен поднять содержание мочевины крови выше этого уровня при отсутствии выделительных расстройств.

Из других физиологических состояний следует отметить беременность, при которой концентрация мочевины в крови часто падает ниже 4,5 ммоль/л.

Повышение уровня мочевины в сыворотке крови наблюдается не только при почечной недостаточности, но и при ряде других патологических состояний: рефлекторной анурии, камнях и злокачественных новообразованиях в мочевыводящих путях, болезни предстательной железы, отравлении сулемой, болезни Аддисона, усиленном распаде белков (острой желтой атрофии печени, тяжелых инфекционных заболеваниях: брюшном тифе, холере и др.), при непроходимости кишечника (илеусе), перитоните, шоке, ожогах, обеднении организма ионами хлора (хлорипривная азотемия, уремия), а также при дизентерии, обезвоживании (в последнем случае уремия носит не абсолютный, а относительный характер). Поскольку мочевина образуется главным образом в печени (существует мнение, что синтезировать мочевину в небольших количествах могут и другие ткани), вполне понятно, что при ее заболеваниях в первую очередь страдает мочевинообразовательная функция. Поэтому при паренхиматозной желтухе, острой дистрофии печени, декомпенсированном циррозе уровень мочевины в крови уменьшается, хотя концентрация остаточного азота при этом может не изменяться или даже несколько увеличиваться (за счет возрастания содержания азота аминокислот и аммиака). Особенно показательно в этом отношении изменение коэффициента urea ratio (азот мочевины / остаточный азот × 100, норма – 48–60 %, при хронических нефритах возрастает до 90 % и более), который резко снижается (в противоположность значительному повышению при недостаточности почек). Повышение содержания мочевины в моче наблюдается при злокачественной анемии, лихорадке, гиперпротеиновой диете, после приема салицилатов, хинина, при отравлении фосфором; понижение – при уремии, нефрите, ацидозе, паренхиматозной желтухе, острой дистрофии печени, прогрессирующем циррозе.

Методы исследования креатинина сыворотки крови

Креатинин является продуктом белкового обмена, он образуется при взаимодействии аминокислот глицина, аргинина, метионина. Креатинин присутствует в крови в свободном виде и в виде креатинфосфата в мышцах и миокарде.

Креатинин – ангидрид креатина, образуется в мышцах из креатинфосфата, вместе с креатином содержится во фракции остаточного азота крови.

Креатинин является постоянной составной частью мочи. Суточное выделение креатинина с мочой постоянно и пропорционально общей мышечной массе тела.

В качестве унифицированного метода при определении концентрации креатинина в крови и моче предложен метод Поппера, основанный на реакции Яффе. Отечественные и импортные наборы для определения уровня креатинина содержат все необходимые реагенты для выполнения исследования данным методом.

Принцип метода Поппера

В щелочной среде пикриновая кислота взаимодействует с креатинином с образованием оранжево-красной окраски (реакция Яффе – образование таутомера пикрата креатинина), которую измеряют фотометрически. Определение в сыворотке крови проводят после депротеинизирования, в моче – после разведения водой. Определение не совсем специфично, интерферируют вещества с активной метиленовой группой и некоторые восстанавливающие вещества, например глюкоза, ацетон, ацетоуксусная и пировиноградная кислоты. Содержание креатинина сыворотки крови:

1) мужчины – 61–115 мкмоль/л или 0,061–0,115 ммоль/л;

2) женщины – 53–97 мкмоль/л или 0,053–0,097 ммоль/л.

Мочу перед анализом разводят дистиллированной водой в соотношении 1: 100 (результат умножают на 50).

Необходимые реактивы

1. Пикриновая кислота, насыщенный раствор. Товарная пикриновая кислота содержит 15–20 % влажности. Кислоту не сушить! Взрывоопасно! В 100 мл воды растворяют 2 г пикриновой кислоты при нагревании на горячей водяной бане. После этого раствор оставляют стоять на 24 ч, периодически перемешивая. Затем раствор фильтруют. Реактив стабилен. Хранят в темной посуде.

2. НСl, 0,1 моль/л.

3. Основной калибровочный раствор креатинина, 10 ммоль/л: 113,1 мг креатинина доводят до 100 мл 0,1 моль/л раствором НСl. Хранят в холодильнике в посуде с притертой пробкой. Для определения креатинина в сыворотке крови рабочий калибровочный раствор получают разведением основного раствора водой в 100 раз; 1 мл раствора содержит 0,1 ммоль креатинина.

4. Натр едкий, 2,5 моль/л.

Ход определения

Определение креатинина в сыворотке крови: 2 мл сыворотки смешивают с 6 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты. Через 5 мин пробирку помещают на 15–20 с в кипящую водяную баню, затем центрифугируют. К 4 мл центрифугата добавляют 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого натра и тщательно смешивают. Иногда после подщелачивания раствор мутнеет вследствие выпадения фосфатов. В этом случае раствор еще раз центрифугируют. Затем раствор доводят до объема 10 мл водой. Через 10 мин (не позже 20 мин) измеряют в кювете с толщиной слоя в 2 см при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы.

Холостая проба: 3 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого натра доводят до объема 10 мл водой.

Расчет производят по калибровочному графику (табл. 9).

Построение калибровочного графика: из рабочего калибровочного раствора креатинина готовят разведения, как указано ниже.

Таблица 9

Определение креатинина сыворотки крови

Через 10 мин производят измерения при тех же условиях, что и опытные пробы. Калибровочная кривая линейна до 260 мкмоль/л креатинина.

Определение уровня креатинина в моче

В мерной колбе или цилиндре вместимостью 100 мл смешивают 0,5 мл мочи (из суточного количества) с 3 мл раствора пикриновой кислоты. Смесь тщательно встряхивают и добавляют 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого натра. Выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин. Доводят объем до 100 мл водой. Измеряют на фотометре в кювете с толщиной слоя в 1 см при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы.

Холостая проба: 3 мл раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого натра доводят водой до объема 100 мл. Расчет производят по формуле при сравнении с калибровочной пробой.

Калибровочная проба: к 0,5 мл основного калибровочного раствора прибавляют 3 мл раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого натра. Далее пробы обрабатывают так же, как опытные.

К = С_к × Е_оп × а / Е_к × б,

где К – количество креатинина в суточной моче, мкмоль;

С_к – количество креатинина в калибровочной пробе, 50 мкмоль;

Е_оп – экстинкция опытной пробы;

Е_к – экстинкция калибровочной пробы;

а – суточное количество мочи;

б – количество мочи, взятой для анализа.

Клинико-диагностическое значение

Нарушение выделения креатинина почками наблюдается лишь при далеко зашедших патологических процессах в них. Устойчивое повышение уровня креатинина в крови аналогично повышению уровня мочевины указывает на нарушение работы почечного фильтра и может считаться ранним показателем почечной недостаточности. Повышение содержания креатинина в сыворотке крови отмечается не только при почечной недостаточности и прогрессирующих диффузных заболеваниях почек, но также при закупорке мочевых путей, кишечной непроходимости (илеусе), тяжелом диабете, декомпенсации сердца, острой желтой атрофии печени, механической желтухе, гипофункции надпочечников, хлорипривной азотемии, голодании и беременности. Азотемия при простатите не дает повышения креатинина.

Понижение уровня креатинина отмечается при анемии, после введения АКТГ.

Содержание креатинина в моче зависит от питания. Помимо эндогенного креатинина, в моче содержится креатинин экзогенный, поступающий из мясной пищи.

Повышение содержания его в моче наблюдается при усиленной мышечной работе, лихорадочных состояниях (при которых происходит более интенсивный распад белков протоплазмы), пневмонии, недостаточности печени.

Понижение уровня наблюдается при мышечной атрофии, дегенерации почек, амилоидозе почек, лейкемии.

Одновременное определение у одного и того же пациента концентрации креатинина в крови и моче значительно расширяет возможности исследования функционального состояния почек, позволяя получить более надежную информацию о процессах фильтрации, реабсорбции и секреции.

Проба Реберга

В клинической практике для обнаружения и диагностики заболевания почек часто используется проба Реберга, позволяющая рассчитать клиренс креатинина. Клиренс креатинина рассчитывается по результатам исследования содержания креатинина в сыворотке крови и моче. Клиренс креатинина или коэффициент очищения показывает, какой объем плазмы крови полностью очищается от данного вещества за минуту. Он является характеристикой клубочковой фильтрации и рассчитывается по формуле:

С = U × V / Р,

где С – клиренс креатинина, мл/мин;

U – содержание креатинина в моче, мкмоль/л;

Р – содержание креатинина в сыворотке крови, мкмоль/л;

V – минутный диурез, мл/мин.

Вместе с тем протеинурия и выраженная почечная недостаточность делают клиренс креатинина ненадежным показателем скорости клубочковой фильтрации. При повышении его концентрации в сыворотке крови Расчет клиренса дает завышенные величины скорости клубочковой фильтрации.

Проведение пробы

Исследуемый натощак выпивает 400–500 мл воды или слабого чая и мочится (эту порцию мочи не исследуют и выливают). Время мочеиспускания точно отмечают. Ровно через 1 ч собирают мочу (полностью). В середине этого часа пунктируют локтевую вену и получают 5–8 мл крови. По объему собранной мочи устанавливают минутный диурез. В крови и моче определяют концентрацию креатинина. Фильтрацию и реабсорбцию рассчитывают по формулам:

клубочковая фильтрация (мл/мин) =

= концентрация креатинина в моче (ммоль/л) ×

× минутный диурез (мл) / концентрация креатинина в крови (мкмоль/л);

реабсорбция (%) = клубочковая фильтрация —

– минутный диурез × 100 / клубочковая фильтрация.

Клубочковая фильтрация в норме составляет 80–120 мл/ мин, реабсорбция – 97–99 %.

Критерии снижения скорости клубочковой фильтрации:

1) пограничное – 62–80 мл/мин;

2) незначительное – 52–63 мл/мин;

3) легкое – 42–52 мл/мин;

4) умеренное – 28–42 мл/мин;

5) выраженное – менее 28 мл/мин.